本发明涉及环(酪氨酸-4-羟脯氨酸)二肽防治叶螨的应用及其制剂。
技术背景
当前农业有害生物防治中，植食性螨类是世界公认的最难防的有害生物类群之一，其主要类别为叶螨，俗称红蜘蛛，属于节肢动物门(arthropoda)，蛛形纲(arachnida)，蜱螨亚纲(acari)，真螨目(acariformes)，叶螨总科(tetranychoidea)。叶螨是一种世界性害螨，寄生范围广，能危害50多科近千种植物,其中二斑叶螨(tetranychusurticaekoch)危害最为严重，除了粮食作物、果树、蔬菜、花卉，林木及观赏植物等以外，还可以危害城市绿地植物和牧草[1]。因其个体小、世代短、发育周期短、繁殖快、适应性强、突变率高，极易产生抗药性，防治极为困难，造成农作物螨害愈演愈烈的“小虫成大灾”局势。叶螨多群居在叶片背面，吸食植物细胞，使受害细胞干枯，轻度为害可使叶片产生许多白色斑驳，抑制了光合作用。重者可造成植物干枯死亡，使农业生产遭受极大损失，影响到农业增产和农民增收，成为目前农业、林业、园艺生产上一个重要的亟待解决的大问题[2]。
化学防治依然是我国农业、林业、园艺作物生产中治理螨害的主要对策，但是杀叶螨剂的滥用和误用极易导致叶螨抗药性的产生。许多文章报道二斑叶螨对多种药剂已产生不同程度的抗药性，其中包括有机磷类、拟除虫菊酯类、氨基甲酸酯类农药甚至是最近使用的新型杀虫剂[3]。因为叶螨的特殊的生态对策和环境的适应性，加之化学农药的不规范施用，叶螨抗药性的问题变得愈来愈突出[4]。在兰州等地果园的二斑叶螨对水胺硫磷、久效磷、克螨特、甲氰菊酯、联苯菊酯、三氟氯氰菊酯等已经产生了很强的抗药性，基本失去了对二斑叶螨的控制能力；在山东二斑叶螨寿光种群和山东烟台种群对哒螨灵、高效氯氟氰菊酯和甲氰菊酯均产生了较高水平的抗药性；在北京市大兴区的二斑叶螨对阿维菌素、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐、哒螨灵、炔螨特、噻螨酮等药剂已产生极强的抗药性，按照推荐剂量已不能很好的控制二斑叶螨的为害；而在甘肃天水苹果树的二斑叶螨对三氯杀螨醇、克螨特、螨克三种药剂的抗性超过10倍[5-6]。由此可见，叶螨的危害和抗药性问题十分突出，急切需要研发新型环境友好型叶螨生物防治剂。
环二肽(cyclicdipeptides)，又名2,5-二氧哌嗪(2,5-dioxopiperazines)或2,5-二酮哌嗪(2,5-diketopiperazines)，由两个氨基酸通过肽键环合形成，是自然界中最小的环肽[7]。自然界中存在的环二肽一般由α氨基酸(常为l-氨基酸)形成相对稳定的六元环。许多环二肽是动植物中生来就有的，或者通过微生物发酵，或是在食品加工过程中形成的。随着人们对环二肽的深入研究，发现该类化合物具有多种生物活性。作为肽类化合物中最有特点的一类化合物，环二肽以它稳定的六元环结构、分子多样性的优点，使其在作用受体的选择性和体内代谢的稳定性方面都强于其他肽类化合物。环二肽类化合物在药物、抗生素和农用生物除草剂的研制等方面具有巨大的开发潜力。
环(酪氨酸-4-羟脯氨酸)二肽是在微生物的发酵液或培养基中发现的由酪氨酸和4-羟脯氨酸残基环化组成的简单环二肽，其制备方法参照参考文献[8]。在大型真菌、植物、动物中也是常见次生代谢产物，无毒无害，对环境安全。
环(酪氨酸-4-羟脯氨酸)二肽，又名3-对羟苄基-8-羟基吡咯并哌嗪-2,5-二酮(3)，其结构式如式ⅰ：
其分子式为：c14h16n2o4，分子量为276.11。常规的理化性质：白色针状晶体，溶于氯仿，乙酸乙酯，丙酮，dmso等溶剂,详见参考文献[8-9]。
环(酪氨酸-4-羟脯氨酸)二肽的cas号为813461-21-1。目前，环(酪氨酸-4-羟脯氨酸)二肽的主要研究集中在抗微生物和抗肿瘤活性方面详见参考文献[8-9]。可以在赫澎(上海)生物科技有限公司，武汉中标科技有限公司，南京肽业生物科技有限公司以及武汉天植生物技术有限公司等购买得到。
[1]刘庆娟等.二斑叶螨的发生与防治研究进展[j].山东农业科学,2011,(09):99-101.
[2]洪晓月等.作物重要叶螨综合防控技术研究与示范推广[j].应用昆虫学报,2013,50(02):321-328.
[3]唐小凤.二斑叶螨的抗药性监测及其亚致死效应研究[d].中国农业科学院,2014.
[4]高新菊.二斑叶螨对甲氰菊酯的抗性分子机理研究[d].甘肃农业大学,2012.
[5]周兴隆.二斑叶螨对阿维菌素、螺螨酯及甲氰菊酯的多重抗性研究[d].甘肃农业大学,2015.
[6]杨顺义.二斑叶螨对阿维菌素和螺虫乙酯的抗性机理研究[d].甘肃农业大学,2014.
[7]李海峰等.枯草芽孢杆菌7ze3环二肽的分离与鉴定[j].江苏农业科学,2010,(02):107-109.
[8]mitova,m.tommonaro,g.hentschel,u.muller,w.e.g.derosa,s.exocellularcyclicdipeptidesfromaruegeriastrainassociatedwithcellculturesofsuberitesdomuncula,2004,6(1):95-103.)
[9]李斌等.海洋放线菌streptomycessp.次生代谢产物的研究.中国药物化学杂志，2011，21(3)：227-231.
技术实现要素：
为解决现有药剂长期、大量施用或滥用导致叶螨产生抗药性，从而极大地降低了对叶螨的防治效果的技术问题，本发明提供环(酪氨酸-4-羟脯氨酸)二肽防治叶螨的新用途及其作为防治叶螨的活性物质的新型杀叶螨制剂。
本发明的技术方案如下：
1.环(酪氨酸-4-羟脯氨酸)二肽在防治叶螨中的应用。
2.根据技术方案1所述的环(酪氨酸-4-羟脯氨酸)二肽在防治叶螨中的应用，所述叶螨为二斑叶螨。
3.环(酪氨酸-4-羟脯氨酸)二肽在制备杀叶螨制剂中的应用。
4.根据技术方案3所述的环(酪氨酸-4-羟脯氨酸)二肽在制备杀叶螨制剂中的应用，以环(酪氨酸-4-羟脯氨酸)二肽为活性成分、氮酮为助剂和水为溶剂制成环(酪氨酸-4-羟脯氨酸)二肽杀叶螨制剂。
5.根据技术方案4所述的环(酪氨酸-4-羟脯氨酸)二肽在制备杀叶螨制剂中的应用，所制成的环(酪氨酸-4-羟脯氨酸)二肽杀叶螨制剂中含环(酪氨酸-4-羟脯氨酸)二肽0.500mg/ml、含氮酮5.00mg/ml。
6.根据技术方案3至5中任一技术方案所述的环(酪氨酸-4-羟脯氨酸)二肽在制备杀叶螨制剂中的应用，所述叶螨为二斑叶螨。
7.一种防治叶螨药剂，其活性成分为环(酪氨酸-4-羟脯氨酸)二肽。
8.根据技术方案7所述的一种防治叶螨药剂，还含有氮酮。
9.根据技术方案8所述的一种防治叶螨药剂，所述防治叶螨药剂中含环(酪氨酸-4-羟脯氨酸)二肽0.500mg/ml，含氮酮5.00mg/ml。
10.根据技术方案7至9中任一技术方案所述的一种防治叶螨药剂，所述叶螨为二斑叶螨。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
本发明首次发现环(酪氨酸-4-羟脯氨酸)二肽在防治叶螨的新用途。所述环(酪氨酸-4-羟脯氨酸)二肽是自然界常见的天然产物，无毒无害，对环境安全。本发明用环(酪氨酸-4-羟脯氨酸)二肽作为杀叶螨制剂的活性成分，防治农业、林业、园艺生产中的害虫叶螨，其杀叶满制剂为新型环境友好型叶螨防治剂。
本发明用环(酪氨酸-4-羟脯氨酸)二肽制备的杀叶螨制剂在室内玻片浸渍法测试的lc50为0.08mg/ml。浓度为0.500mg/ml环(酪氨酸-4-羟脯氨酸)二肽杀叶螨制剂校正死亡率96.32％。在温室防效实验中，本发明环(酪氨酸-4-羟脯氨酸)二肽杀叶螨制剂分别在玉米、番茄、草莓和玫瑰上的防治效果均达到84％以上。
实验证明，本发明用环(酪氨酸-4-羟脯氨酸)二肽制备的杀叶螨制剂对叶螨有很好的毒杀作用，用极少量的环(酪氨酸-4-羟脯氨酸)二肽作为杀叶螨的活性成分即可达到84％以上的防治效果，产生了预料不到的技术效果，该药剂为新型药剂可有效解决叶螨、二斑叶螨对现有药剂的抗药性问题。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作详细的说明，各实施例中所用材料均为市售。各实施例中无特殊说明的为常规方法。
实施例1环(酪氨酸-4-羟脯氨酸)二肽杀叶螨制剂的配制
准确称量10.00g氮酮和1.00g环(酪氨酸-4-羟脯氨酸)二肽溶于水中，并定容至1l，即配制成环(酪氨酸-4-羟脯氨酸)二肽杀叶螨制剂，其中，氮酮含量为10.00mg/ml,环(酪氨酸-4-羟脯氨酸)二肽含量为1.00mg/ml。所述环(酪氨酸-4-羟脯氨酸)二肽的结构式如下述式ⅰ：
用水梯度稀释上述环(酪氨酸-4-羟脯氨酸)二肽杀叶螨制剂，分别配制成环(酪氨酸-4-羟脯氨酸)二肽及氮酮相应稀释的各梯度浓度的环(酪氨酸-4-羟脯氨酸)二肽杀叶螨制剂，其梯度稀释的环(酪氨酸-4-羟脯氨酸)二肽杀叶螨制剂浓度分别为：含1.00mg/ml环(酪氨酸-4-羟脯氨酸)二肽和10.00mg/ml氮酮，简写为1.00mg/ml(10.00mg/ml)，以下各梯度浓度的简写相同，分别为：0.500mg/ml(5.00mg/ml)、0.250mg/ml(2.50mg/ml)、0.125mg/ml(1.25mg/ml)、0.0625mg/ml(0.625mg/ml)，分别简称为：1.00mg/ml环(酪氨酸-4-羟脯氨酸)二肽杀叶螨剂、0.500mg/ml环(酪氨酸-4-羟脯氨酸)二肽杀叶螨剂、0.250mg/ml环(酪氨酸-4-羟脯氨酸)二肽杀叶螨剂、0.125mg/ml环(酪氨酸-4-羟脯氨酸)二肽杀叶螨剂、0.0625mg/ml环(酪氨酸-4-羟脯氨酸)二肽杀叶螨剂，用于室内和温室杀二斑叶螨活性测试。
实施例2环(酪氨酸-4-羟脯氨酸)二肽杀叶螨剂室内活性测试
玻片浸渍法：从温室大棚喂养二斑叶螨的番茄上采集有大量叶螨的叶片，利用敲打振落法手段结合小毛笔轻刷把叶螨移到一张白纸上。将双面胶粘贴于载玻片的一端，选取颜色鲜艳、活泼、大小一致的二斑叶螨雌成螨，每个处理叶螨数20头。以上述1.00mg/ml、0.500mg/ml、0.250mg/ml、0.125mg/ml、0.0625mg/ml环(酪氨酸-4-羟脯氨酸)二肽杀叶螨剂为处理药剂，以清水为对照。将粘有合格叶螨的载玻片浸入环(酪氨酸-4-羟脯氨酸)二肽杀叶螨剂为处理药剂5s后取出，用滤纸吸掉二斑叶螨身上多余的药液，24h后在体视显微镜下观察死亡数量。每个浓度重复3次试验。结果显示：环(酪氨酸-4-羟脯氨酸)二肽杀叶螨剂lc50为0.08mg/ml，浓度为0.500mg/ml环(酪氨酸-4-羟脯氨酸)二肽杀叶螨剂校正死亡率96.32％。所述0.500mg/ml环(酪氨酸-4-羟脯氨酸)二肽杀叶螨剂中含环(酪氨酸-4-羟脯氨酸)二肽0.500mg/ml和氮酮5.00mg/ml。
死亡率＝[(总螨数－活螨数)/总螨数]×100％
校正死亡率＝[(处理组死亡螨数－对照组死亡螨数)/(总螨数－对照组死亡螨数)]×100％
所得数据经计算机excel软件处理，并计算毒力回归方程及lc50。
表一环(酪氨酸-4-羟脯氨酸)二肽杀叶螨剂室内活性测试结果
注：表一中叶螨数量为3次重复的平均值
实施例3环(酪氨酸-4-羟脯氨酸)二肽杀叶螨剂温室活性测试
以上述0.500mg/ml环(酪氨酸-4-羟脯氨酸)二肽杀叶螨剂作为处理药剂，以清水为对照。对温室内的玉米、番茄、草莓和玫瑰作物上的叶螨进行防治，同时应用于苹果园和梨树园的叶螨防治。选择长势一致，叶螨发生严重的区域，各植物设置3个小区，各小区间设置保护行，每个小区选取3株，每株按不同植物选择10片叶，编号挂牌，定株、定叶调查统计喷药前二斑叶螨的基数。用背负式单管手动喷雾器对每个处理的植物进行全株喷施，以所有叶子正反面均着药，且叶尖稍有药液下滴为宜。第一天，第三天，第十天，第十三天各喷施一次。第十五天观察防治效果并分别调查标记叶片的活叶螨数量。
统计计算防治效果，叶螨减退率＝[(活螨基数－药后活螨数)÷活螨基数]×100％；防治效果＝[(处理组叶螨减退率±对照组叶螨减退率)÷(100％±对照组叶螨减退率)]×100％。试验结果显示施药4次后，第十五天防治效果均超过84％以上，防治效果最好的是在玉米上，达到97.34％(见表二)。
表二环(酪氨酸-4-羟脯氨酸)二肽杀叶螨剂温室活性测试结果
注：表二中叶螨数量为3株植株选定叶片上的叶螨数量(头/叶)的平均值。