专利名称：大豆花粉管通道转基因及其品种改良技术的制作方法
技术领域：
本发明属于在大豆上转移外源基因以及大豆种质改良技术。
将外源DNA(基因)转至受体农作物，使农作物产生新的、人们期望的性状的技术，被称之为转基因技术。它不同于常规的有性杂交，使双亲的遗传组成在染色体水平进行交换重组，而是在分子水平即在载有遗传信息的DNA分子水平进行重组和交换、使基因发生改变。迄今为止，国际上现有的转移外源基因的方法按技术的属性分有三类①物理法，如基因枪、电激、显微注射、激光、超声波、碳化硅纤维；②化学法，如磷酸钙-DNA共沉淀、聚乙二醇(PEG)、脂质体等；③生物学法，如农杆菌介导Ti质粒转移、花粉携带、花粉管通道。综合分析国际文献，农杆菌法及基因枪法目前在应用上占主导地位，其它方法也有利用。评价一个转基因技术好与否，要考虑其是否高效，是否易于重复，难易程度及其适用范围。一个成熟的、实用性广泛的转基因技术系统，必须具备高效、重复性高、简易、快速、适用性广等特点。其中最重要的是转化频率要高，易于重复，以及没有基因型依赖性。基因型的依赖性以及某些重要农作物的转化效率低被公认为是目前植物基因工程发展的主要限制因素。下面对几个主要方法作一分析(一)农杆菌介导法农杆菌介导转化，是借助于农杆菌细胞内自有的Ti质粒可以向植物细胞内转移并可插进植物细胞基因组内复制增殖的特性，人为地将重组DNA装至Ti质粒上，再让农杆菌侵染植物，把人们所需要的基因通过Ti质粒转入植物细胞。这个技术一般需要建立植物组织培养再生系统，农杆菌侵染经培养的外植体，然后在选择压力下，筛选出转化愈伤组织，再经再生获得转基因(DNA)植株。其优点相对简单易于操作，对大多数双子叶植物的各种器官或组织均适合，但存在基因型依赖性，特别是对一些不易于再生的作物，转化效率很低，大豆属于此类。
(二)基因枪转化法基因枪技术的基本原理是以火药爆炸、高压放电或高压气作驱动力，将载有外源DNA的钨、金等金属颗粒加速，射击真空室中的靶细胞或组织，从而达到将外源DNA分子导入靶细胞中的目的。其步骤包括微粒子弹装备、装枪、轰击、过渡培养和选择培养。
此技术可用于双子叶和单子叶植物，受体靶可以是组织也可以是细胞，与农杆菌法相比，克服了一些基因型对农杆菌不敏感的缺欠，特别是可用于单子叶植物，因而是继农杆菌介导法之后又一广泛应用的遗传转化技术。其不足之处转化效率比农杆菌还低；基因枪的造价高，转化成本也高，而且也必须有一个组织培养再生系统。
(三)PEG介导转化、电击穿孔转化、显微注射、激光微束、超声波、脂质体介导等这些方法的前提都建立在有成功的植物细胞和原生质体培养系统基础上，由于原生质体培养相对于组织培养更困难，因此应用受到限制。
(四)花粉管通道法花粉管通道法的原理是植物在开花授粉受精过程中，在从柱头到胚囊之间形成可使大分子通过的通道，而胚囊此时又呈部分无壁的原生质体状态，外源DNA分子可进入细胞参与受体基因组DNA的合成复制。本方法可在室外操作，在植株开花的某一时刻，将DNA分子溶液在合适的受精生理时期，采取合适的方法注入胚囊，实现转化目的。此技术不需要组织培养以及转化仪器设备，操作简便，易于掌握，而且可克服基因型的限制。此技术需针对不同作物采用不同方法细则操作。棉花是此技术首先成功的对象。
本发明的目的是建立一个适用于大豆的转DNA(基因)技术，并用此技术向大豆转移各种来源的DNA分子，以达到改变大豆遗传DNA分子组成，创造大豆新种质，改良大豆品种。
本发明的目的是这样实现的一种大豆花粉管通道转基因方法，包括外源基因的提取纯化，选择受体大豆并种植至开花，对花器官进行处理，注入DNA导入液，对种子及后代进行鉴定筛选；选择受体大豆当日开的花，去除翼瓣、龙骨瓣，留中央旗瓣，露出柱头，用眼科小剪从雌蕊靠近子房处剪去柱头；在切口处滴15～20ulDNA导入液，在幼胚至种子成熟时，或取幼胚进行组织培养筛选或取成熟种子对其进行种子处理筛选，得到转基因大豆。
DNA导入液以0.1×SSC、TE、或ddH2O溶解外源DNA，浓度为25-150ug/ml质粒DNA，100-500ug供体基因组总DNA。
外源基因为大豆或者非大豆基因，来源可为种间，属间，科间以至微生物。
外源基因为各种抗性、品质及其它有益性状基因。
受体为大豆品种、品系或者中间材料。
受体大豆当日开花的生理时间为其自花受粉后6-14小时。
幼胚组织培养筛选是将选择剂配制到培养基中，将转基因幼胚用该培养基培养，从培养的幼胚愈伤组织再生苗中选择抗选择剂植株。
种子处理筛选为将收获的转基因大豆种子无菌接在具有选择剂的培养基上使其萌发根系发育正常者为抗性阳性苗；用选择剂浸泡后，播于营养钵、珍珠岩或者河沙内，根系正常生长株为抗选择剂单株，将抗选择剂单株转于田间或者大盆栽培继续做分子生物学鉴定和农艺性状鉴定。
选择剂根据载体上所具有的选择标记基因而定，如Bar基因选用Basta除草剂，Npt II基因选用卡那霉素；Basta、卡那霉素，选择浓度为50-1000PPM，处理时间组织培养为培养期间，种子浸泡为6-12小时。
种子处理筛选为将收获的转基因大豆种子，播于盘中或者田间，在幼苗期，取叶片提取DNA做PCR分析，阳性者用于继续鉴定和培养。
对改良目标品种导入含目标性状的共体DNA，从导入后代中选择目标变异或转化株，通过农艺性状鉴定筛选，株系品系培育，获得含目标性状的优良种质、品系或品种，实现种质创新和改良。
下面详细叙述本发明的内容本发明可分为两部份一是外源DNA(基因)转化的花粉管通道技术；二是应用于大豆种质创新与品种改良的方法与结果。
第一部分包括几个步骤①外源DNA的提取纯化；②受体大豆的种植，培育至开花；③转化操作；④培育大豆至结实，并收获；⑤于田间或实验室种植种子，进行筛选和分子检测。
分解描述如下1.外源DNA(基因)的提取与纯化此步操作方法参照发表过的书刊杂志介绍的方法进行。外源DNA供体包括任何来源的动植物以及微生物，包括提取总DNA和通过从细菌克隆的重组DNA。
2.受体大豆材料的种植，在适合其正常生长开花的环境下种植，培育至开花。受体大豆可是以任何品种和品系。
3.实施导入。其细则如下①选择当日开的花，生理时间为其自花受粉后6～14小时，(每节选2-3朵其余去除)；②去除翼瓣、龙骨瓣，留中央旗瓣，露出柱头，用眼科小剪从雌蕊靠近子房处剪去柱头；③在切口处滴15～20ulDNA导入液。导入液可用0.1×SSC、TE、或ddH2O配制，浓度为25-150ug/ml(质粒DNA)、50～300ug/ml(供体总DNA)。
4.在胚成熟至种子成熟的任何时期取下籽粒进行如下任何方式的鉴定筛选1)取下幼胚，进行幼胚组织培养，培养期间进行抗生素等选择标记筛选；2)待种子成熟后，取出籽粒，用选择剂处理筛选，可以有几种方法a.用高浓度选择剂浸泡种子，然后将种子播于营养钵内，正常生长者移栽于田间或大盆中栽培；浓度范围需根据基因载体中筛选标记种类及受体材料的不同事先做临界浓度的确定试验，如对NPT II基因卡那霉素的浓度可在500-1000PPM，处理时间可在6-12小时。
b.用高浓度(浓度选择及处理方法与上述a相同)选择剂浸泡种子，然后播于珍珠岩或河沙中萌发后观查根系发育情况，正常者为初选转化株；c.用低浓度(卡那霉素的浓度可在50-200PPM)的选择剂配制培养基，将种子无菌接在培养基上，抗选择剂正常生长者为初选转基因株。
3)将种子播于盆中或田间，幼苗期，取叶片提取DNA做PCR分析，阳性者留下培育成苗获得后代，阴性者淘汰。
4)将种子种于盆中或田间，用选择剂处理幼苗，抗性者为初选转基因植株。
5)将种子种于盆中或田间，观查农艺目标性状选择变异株。
第二部分，利用花粉管通道技术向大豆导入外源总DNA和重组DNA进行种质创新和品种改良。
1.选择生产上正在推广的或正欲推广的高世代优良品系，作为改良对象；2.针对改良对象尚存的缺欠选择具相应的优点的品种间、种间、属间、科间、以至更远缘材料为供体，提取总DNA或经人工重组的基因载体DNA，配成导入液。
3.将受体材料种植于田间或其它可使大豆植株正常生长的环境，培育至开花后，进行各种组合的导入操作。
4.收获操作种子，种植，根据期望目标，选择变异后代。
5.对变异后代进行常规育种程序的鉴定、株系培育、品系培育、生产试验，最后成为可利用资源或成为品种，可以按下面方式进行不同世代的处理。
D1、D2代选择变异→D2、D3代抗逆性鉴定兼丰产株系筛选→D3、D4抗逆高产品比试验→D5进入区域生产试验。
本发明的优点和积极效果如下
1.转化率高。迄今为止现有用于大豆的转化技术主要是农杆菌技术和基因枪技术，这两个技术都依赖于大豆组织培养再生技术，而大豆组织培养技术还未达到十分成熟完善程度，也存在很大的基因型差异(即依赖性)。虽有一些转化成功的报道消息，但转化频率不高，而且仅限于少数品种。基因枪设备价值昂贵，轰击一枪的成本也在30.00元(人民币)以上。而本发明不需组织培养再生过程，基因型依赖性很小，转化率在3％左右，有时可达10％，当年操作，当年获得种子，第二年即可有大量T2群体供遗传筛选分析。
2.易于操作，适用性好。由于不必在实验室内操作，因此常规育种家也可进行。只要有外源DNA(基因)分子(可以通过自己提取或从其它来源索取)即可自己在田间进行，勿需生物技术专业人员，适用于各种生态区域和各级大豆育种单位育种人员，可以广泛利用。
3.本技术可通过导入各种来源的DNA分子，因此可扩大生物基因资源的利用率和范围，创造种质，培育品系，周期短，常规方法要获得稳定的品系需5-6代甚至更多，本技术2-3年即可得到纯系，提高了育种效率。
下面叙述
具体实施例方式实施例1Bar基因载体为质粒PDM 803，按照《分子克隆实验指南》所示提取质粒DNA，经电泳和分光光度计分析测定质量纯度OD260/OD230≥2.0，OD260/OD280≥1.8，用TE缓冲液配成100ug/ml浓度导入液，冷冻保存。将品系D9202-1种于田间。当开花盛期，于下午1500以后，选新开的花，去除龙骨瓣、翼辨，留旗瓣，用眼科小剪剪下柱头，用微量移液管或注射器，将DNA液滴在子房断面上，每花20ul，共做150朵花。收获100多个荚，200多粒种子。于当年秋冬取100粒播于直径10cm的营养钵中，每钵一粒。待幼苗真叶展开后，用除草剂Basta(4.5ppm)溶液200ul滴在真叶上(为使溶液不流失，在叶片上钉0.8～1cm两层滤纸)，5天后观查伤害情况，敏感者出现黄斑，逐渐扩大，最后枯萎落掉，抗者不出现黄斑。从此100株中选得10株不同抗性表现的幼苗，按抗性程度依次移栽于田间。在成苗期再以90ppm的除草剂溶液喷施，观查，获得抗性植株。再将抗株于第二年种成株行于苗期用涂抹叶片的方法再次进行除草剂抗性鉴定筛选，淘汰不抗者留抗者。第三年于田间种株行，用超出市售除草剂说明书最高剂量的0.5、1.5、3倍的浓度喷施，结果不抗的株行植株枯死，而抗株未死。从而选出抗除草剂大豆6个株系，其中2个株系最为突出，以Bar基因两端序列为引物经PCR分析，呈阳性，对其作Gus染色分析也表现阳性。
实施例2质粒pSKRSSGNAI含雪花莲外源凝集素GNA基因。按《分子克隆实验指南》提取质粒DNA，经电泳和紫外分光光度计测定质量和纯度O.D260/O.D230≥2，O.D260/O.D280≥1.8，用重蒸水配成100ug/ml导入液，按实施例1方法，转化品种吉20和吉30。取一部分操作种子先种于田间，待3片复叶时，每株接2-3龄蚜虫10头，扣上网罩，任其繁殖，从中选择抗蚜植株。一个月后抗蚜株茎杆叶片较干净，植株生长较正常，危害症状轻，而感蚜株叶片皱缩枯萎，植株矮小，受害严重。收获抗株种子，于下年种株行，与对照受体同时接蚜鉴定，抗株抑制蚜口数达30～80％，表现出GNA基因对蚜虫的抑制作用。PCR分析呈阳性。另一部分种子，当年种于室内盆栽，取叶片先做大量PCR鉴定，选出阳性者。再对阳性后代进行抗蚜性鉴定，也表现出抗性，最好的抑制蚜口数也达80％，PCR呈阳性。Southern blot与western blot分析得到验证。总的转化频率为1-3％。
实施例3以皂角树为DNA供体，按有关书籍资料介绍的方法取皂角叶片和种子胚芽提取DNA，用0.1×SSC缓冲液配成100-300ug/ml浓度的导入液。以吉林25、吉林27、吉林20品种为受体，按照实施例2所述时间方法导入，秋后收取种子。于下年播种田间，从中选出变异株。变异表现为植株茎杆强度增加，生长旺盛，株型收敛，荚皮和荚形有与皂角荚相似之处，粗糙，放宽。将变异株的后代种于田间，接蚜虫鉴定筛选，经4年的连续筛选，从以吉25为受体的后代中选出一株系表现明显抗蚜性。蚜虫繁殖率下降30％，危害指数与对照比下降33％；减产幅度，比对照少70％以上，对照减产47％，而抗性变异株系仅减产5％，培育成抗蚜品系。
实施例4以大豆吉27为受体，以农家品种“国育100-4”为DNA供体，(国育100-4抗蚜虫)，按实施例2的方法导入DNA及鉴定筛选，同样也选出一品系NY-181，对蚜虫耐受性比对照有明显的提高，危害指数NY-181为25，而对照为69.7，减产幅度NY-181为17％，而对照为28.8％。
实施例5以大豆吉20为受体，以鹰咀豌豆为DNA供体，按实施例2的方法导入DNA及鉴定筛选选出品系D2011，叶片增厚，变硬，栅栏细胞增多，排列紧密整齐，因此而耐蚜。同时其茎杆韧性弹性增强，抗倒耐密，籽粒蛋白质含量提高4个百分点。通过增加密度栽培，公顷产量提高20％以上，已在生产示范。
权利要求
1.一种大豆花粉管通道转基因方法，包括外源基因的提取纯化，选择受体大豆并种植至开花，对花器官进行处理，注入DNA导入液，对种子及后代进行鉴定筛选；其特征在于选择受体大豆当日开的花，去除翼瓣、龙骨瓣，留中央旗瓣，露出柱头，用眼科小剪从雌蕊靠近子房处剪去柱头；在切口处滴15～20ulDNA导入液，在幼胚至种子成熟时，或取幼胚进行组织培养筛选或取成熟种子对其进行种子处理筛选，得到转基因大豆。
2.根据权利要求1所述的转基因方法，其特征在于DNA导入液以0.1×SSC、TE、或ddH2O溶解外源DNA，浓度为25-150ug/ml质粒DNA，100-500ug供体基因组总DNA。
3.根据权利要求2所述的转基因方法，其特征在于外源基因为大豆或者非大豆基因。
4.根据权利要求3所述的转基因方法，其特征在于外源基因为各种抗性、品质及其它有益性状基因。
5.根据权利要求1所述的转基因方法，其特征在于受体为大豆品种、品系或者中间材料。
6.根据权利要求1所述的转基因方法，其特征在于受体大豆当日开花的生理时间为其自花受粉后6-14小时。
7.根据权利要求1所述的转基因方法，其特征在于幼胚组织培养筛选是将选择剂配制到培养基中，将转基因幼胚用该培养基培养，从培养的幼胚愈伤组织再生苗中选择抗选择剂植株。
8.根据权利要求1所述的转基因方法，其特征在于种子处理筛选为将收获的转基因大豆种子无菌接在具有选择剂的培养基上使其萌发根系发育正常者为抗性阳性苗；或用选择剂浸泡后，播于营养钵、珍珠岩或者河沙内，根系正常生长株为抗选择剂单株，将抗选择剂单株转于田间或者大盆栽培继续做分子生物学鉴定和农艺性状鉴定。
9.根据权利要求7、8所述的转基因方法，其特征在于选择剂根据载体上所具有的选择标记基因而定，如Bar基因选用Basta除草剂，Npt II基因选用卡那霉素；Basta、卡那霉素，选择浓度为50-1000PPM，处理时间组织培养为培养期间，种子浸泡为6-12小时。
10.根据权利要求1所述的转基因方法，其特征在于种子处理筛选为将收获的转基因大豆种子，播于盘中或者田间，在幼苗期，取叶片提取DNA做PCR分析，阳性者用于继续鉴定和培养。
11.根据权利要求1所述的转基因方法，其特征在于对改良目标品种导入含目标性状的共体DNA，从导入后代中选择目标变异或转化株，通过农艺性状鉴定筛选，株系品系培育，获得含目标性状的优良种质、品系或品种，实现种质创新和改良。
全文摘要
一种大豆花粉管通道转基因方法,包括外源基因的提纯,选择受体大豆并种植至开花;选择当日开的花,在授粉后合适的生理时间,用眼科小剪从雌蕊靠近子房处剪去柱头;在切口处滴15～20u1DNA导入液,在幼胚至种子成熟时,取幼胚进行组织培养水平筛选或者对种子及幼苗处理和田间筛选,得到转基因大豆进而进行品种培育。本发明导入外源DNA分子,扩大基因资源的利用率和范围,创造种质,培育品系;有周期短,转化率高等特点。
文档编号A01H4/00GK1251862SQ9912370
公开日2000年5月3日 申请日期1999年11月16日 优先权日1999年11月16日
发明者刘德璞, 袁鹰, 周正平, 王成武, 郑培和, 王丙旭, 王兴智, 唐克轩 申请人:吉林省农业科学院