一株短小芽孢杆菌n103-1及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种生防菌剂及其应用，尤其是一株短小芽孢杆菌N103-1及其在防 治草莓炭疽病中的应用。
【背景技术】
[0002] 草莓炭疽病是草莓的主要病害之一，一般可造成减产10%~20%，严重的可减产 50%以上，南方草莓产区发生较为普遍。草莓炭疽病主要发生在育苗期（匍匐茎抽生期） 和定植初期，其主要危害匍匐茎、叶柄、叶片、托叶、花瓣、花萼和果实，可造成局部病斑或全 株萎蔫枯死。匍匐茎、叶柄、叶片染病，初始产生直径3~7毫米的黑色纺锤形或椭圆形溃 疡状病斑；当匍匐茎和叶柄上的病斑扩展成为环形圈时，病斑以上部分萎蔫枯死，湿度高时 病部可见肉红色黏质孢子堆。当母株叶基和短缩茎部位发病，初始1~2片展开叶失水下 垂，傍晚或阴天恢复正常，随着病情加重，则全株枯死。浆果受害，产生近圆形病斑，淡褐至 暗褐色，软腐状并凹陷，后期也可长出肉红色黏质孢子堆。此病由真菌半知菌亚门毛盘孢属 草莓炭疽菌Colletotrichum fragariae Brooks侵染所致，其有性阶段为子囊菌亚门小丛 壳属的 Glomerella fragariae〇
[0003] 目前生产上草莓炭疽病以化学防治为主，化学农药的大量使用不仅导致病原菌易 产生抗药性，造成防效不佳、病害再猖撅；而且造成生态环境严重污染，直接增加农产品中 有毒化学物质的残留，对人类健康带来严重危害。生物防治具有安全无毒、无污染和病菌 不易产生抗药性的特点，越来越受到各国政府和人民的关注。Seiju Ishikawa报道真菌 Talaromyces fIavus 能有效防治草莓炭疽病（《Journal of general plant pathology》， 2013, 79 (6))。Chalfoun等人研宄发现一些无毒真菌可以诱导抗病性，提高对草莓炭疽病 的防效（《Biological control》，2011，58(3))。Freeman等人发现木霉菌可以防治草莓 炭疽病和灰霉病（《European journal of plant pathology》，2004,110 (4))。国内杨敬 辉等人报道黄色链霉菌NF0919对草莓炭疽病菌等多种植物病原真菌有不同程度的抑制作 用（《西北农业学报》，2013, 22 (4))。王美林等研宄发现1000亿活芽孢/g枯草芽孢杆菌对 草莓炭疽病有较好的防效，与化学药剂多菌灵、咪鲜胺防效相当（《生物灾害科学》，2013， 36(1))。刘诗胤等人报道枯草芽孢杆菌对稻瘟病菌、小麦赤霉病菌、草莓炭疽病菌和黄瓜枯 萎病菌菌丝生长有较好的抑制作用（《浙江农业学报》，2012, 24 (4))。魏彩燕等从草莓炭 疽病样上分离获得对草莓炭疽病具有较强拮抗作用的黄蓝状菌（Talaromyces flavus)菌 株MT-06(《菌物学报》，2010,（4))。张雪等报道木霉菌剂能提高"红颜"草莓炭疽病的抗性 (《西北农业学报》，2010,19 (8))。马华升等采用生物发酵法制备木霉菌株HZ0501发酵液， 对草莓炭疽病具有明显的抑菌活性（《山东轻工业学院学报》，2009,23(4))。
[0004] 本专利申请人从北京市郊采集的土样中，分离纯化获得一株生防菌株N103-1。根 据细胞形态、生理生化特征、16S rRNA基因序列等实验数据综合分析，菌株N103-1鉴定为 短小芽抱杆菌（Bacillus pumiIus)。同时，短小芽抱杆菌N103-1已于2013年11月19日在 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记入册，保藏编号为CGMCC No. 8484。 地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研宄所。前期研宄发现：短小 芽孢杆菌N103-1对室内多种病原真菌菌丝生长均具有较强的抑制作用，草莓炭疽病的小 区实验和田间实验防效良好，明显高于对照药剂多菌灵。
[0005] 短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus)为芽孢杆菌目、芽孢杆菌科、短小芽孢杆菌 属。短小芽孢杆菌呈杆状，圆末端，单个或呈短链排列，1.2~1.5X2. 0~4.0微米。能 运动，革兰氏阳性，芽孢1.0~1.2X 1.5~2.0微米，椭圆形，中生或次端生。该菌能水 解淀粉，降解甘露聚糖、木聚糖、纤维素等。短小芽孢杆菌一般为饲用微生物菌种，适用于 猪、禽类反刍动物，也适用于鱼、虾等水产动物，能显著抑制动物肠道致病菌的生长。已有 短小芽孢杆菌相关专利主要是：防治水稻稻瘟病（专利【申请号】201210271396. 4)、水稻纹 枯病（ZL 201010572008)、小麦合谷孢囊线虫病（ZL 201310046055. 1)、番茄灰霉病（ZL 200910223357. 5)、黄瓜霜霉病（CN201110288018. 2)辣椒疫病（ZL 201010268495. 8)、松树 苗木猝倒病（ZL 201010238823. X)、兰花茎腐病（ZL 201110413021.2)等。另外还有一些堆 肥或微生物秸杆腐熟剂中含有短小芽孢杆菌（专利【申请号】201410407424.X)，可以分解秸 杆，同时具有生物防治功能，能抑制作物纹枯病、水稻稻瘟病、小麦根腐病、草莓灰霉病等病 原菌的生长。
[0006] 目前，国内外只有Min等人曾报道短小芽孢杆菌Bacillus pumilus分泌的挥发 性物质对Colletotrichum gloeosporioidles(Penz.)引起的芒果炭疽病有较好的防效 (《Biological control》，2013,65(2))。而申请人分离获得的短小芽孢杆菌N103-1作用 机理和标靶病原菌与之完全不同。具体如下：1、短小芽孢杆菌N103-1活菌体可以直接抑制 草莓炭疽病菌生长；2、Colletotrichum fragariae引起的草莓炭疽病和Colletotrichum gloeosporioides引起的芒果炭疽病属于盘孢属的两个不同种。众所周之，病原菌不同种之 间千差万别。同一种化学药剂或生防菌对这个种有防治作用，可能对另一个种就没有任何 作用。甚至病原菌同一个种在不同寄主植物上侵染，同一种化学药剂或生防菌产生的效果 也是各不相同。在短小芽孢杆菌的这个大家族中，不同短小芽孢杆菌作用的靶标病原菌小 种各不相同。
[0007] 短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus)N103_l是由申请人采样分离获得一株新菌株， 能有效防治Colletotrichum fragariae引起的草莓炭疽病，国内外未见相关报道，具有创 造性和新颖性。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是提供一株具有较好应用前景的生防菌株-短小芽孢杆菌 (Bacillus pumilus)N103_l，该菌株已于2013年11月19日在中国微生物菌种保藏中心登 记入册，保藏编号为CGMCC No. 8484。
[0009] 本发明提供了一种生物杀菌剂，其中有效活性成分由短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus) N103-1 组成。
[0010] 本发明所述的生物杀菌剂，其中短小芽孢杆菌N103-1分泌的代谢产物中包括蛋 白酶、纤维素酶和嗜铁素三种抗菌相关物质。
[0011] 本发明所述的生物杀菌剂，是水剂。其特征在于：各组成及重量百分含量如下：活 性成分50% -99% ;助剂0. 5% -10% ;防腐剂0. 1-0. 5%。其中活性成分由短小芽孢杆菌 N103-1组成；助剂选自NNO、氮酮、噻酮中的一种或多种；防腐剂选自苯甲酸钠、山梨酸钾、 脱氢乙酸钠、丙酸钙、双乙酸钠中的一种或多种。
[0012] 本发明所述的水剂，各组成及重量百分含量如下：5亿短小芽孢杆菌N103-1 : 98. 8% ;NN0 :1· 0% ;山梨酸钾：0· 2%。
[0013] 本发明所述的水剂在草莓苗移栽或定植时，1 : 50-500倍稀释液均匀喷施植物叶 面，用于防治草莓炭疽病。
[0014] 本发明的优点在于：开发出一株对人畜安全、具有较好应用前景的生防菌株-短 小芽孢杆菌N103-1，丰富生防资源。该生防菌剂可以用来防治草莓炭疽病，减少生产中化学 药剂的使用量，降低用药成本；同时改善生态环境、减少化学药剂在草莓中的残留量。
【附图说明】
[0015] 下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
[0016] 图1是短小芽孢杆菌N103-1对病原细菌的抑制作用
[0017] 图2是短小芽孢杆菌N103-1对病原真菌的抑制作用。
[0018] 图3是短小芽孢杆菌N103-1产生蛋白酶。
[0019] 图4是短小芽孢杆菌N103-1产生纤维素酶。
[0020] 图5是短小芽孢杆菌N103-1产生嗜铁素。
[0021] 图中A :短小芽孢杆菌N103-1 ;B :草莓炭疽病菌；C :番茄枯萎病菌；D :水稻纹枯病 菌；E :甘蓝黑斑病菌；F :梨火疫病菌；G :水稻细菌性条斑病菌；H :番茄青枯病菌。
【具体实施方式】：
[0022] 实施例1、
[0023] 短小芽孢杆菌N103-1对3种病原细菌的抑制作用
[0024] A、供试病原细菌
[0025] 病原细菌包括梨火疫病菌、水稻细菌性条斑病菌和番茄青枯病菌，由江苏省农业 科学院植物保护研宄所提供。用LB培养液（蛋白胨10. 0g，酵母粉5. 0g，NaCl 10g，蒸馏水 1000 mL) 28°C、150rpm振荡培养2d，用无菌水稀释至108cfu/mL，备用。
[0026] B、试验方法：
[0027] 将江苏省农业科学院筛选获得的短小芽孢杆菌N103-1在LB培养基上进行活化， 然后移入50mL LB培养液中，于28°C、150rpm振荡培养2d，用无菌水稀释至5 X 108cfu/mL， 备用。
[0028] 吸取短小芽孢杆菌N103-1菌液5 μ L，点接在LB平板中央，28°C培养48h后用病原 细菌稀释液喷雾，28°C培养过夜，调查抑菌圈直径。每处理重复3次，取平均值。设清水对 照。
[0029] C、试验结果：
[0030] 试验结果见图1。短小芽孢杆菌N103-1菌液对对供试的3种病原细菌均有一定的 抑制作用，对梨火疫病菌的的抑菌圈直径最大，为28mm ;对水稻细菌性条斑病菌的抑菌圈 直径为22_ ;对番茄青枯病菌的抑菌圈直径最小，为15_。
[0031] 如图1所示。
[0032] 实施例2
[0033] 短小芽孢杆菌N103-1对4种植物病原真菌的抑制作用
[0034] A、供试病原真菌：
[0035] 病原真菌包括草莓炭疽病菌、番茄枯萎病菌、水稻纹枯病菌和甘蓝黑斑病菌，均由 江苏省农业科学院植物保护研宄所提供。用PDA培养基（200g马铃薯、20g葡萄糖、20g琼 脂和1000