狐尾兰组织培养方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种狐尾兰组织培养方法。
【背景技术】
[0002]狐尾兰(Rhynchos tylis gigantea)又名钻喙兰、海南钻喙兰为兰科钻喙兰尾多年生附生草本，其在野生环境下多附生于橡胶树、楓树或榕树上，是我国海南野生名优兰品种之一。狐尾兰叶片肥厚、翠绿，宽带状，外弯，多有数条浅色的纵条纹，茎直立，具数节，不分枝。狐尾兰花序直立或呈下垂状，且花序多而密集；花瓣比萼片小；其唇瓣呈浅3裂或不裂状；距两侧压扁；蕊柱短，蕊柱足较短；花粉块2个，有不同程度的裂隙，呈蜡质状；具有狭长的蕊喙柄以及较小粘盘，花期通常在1-3月。狐尾兰的花色也较为丰富，有红、粉红、白、蓝、橘等颜色。由于其花型独特，花色丰富，花期长，且花期为我国传统春节前后，是极好的新春贺岁花卉，因此受到人们的极度喜欢[1]。
[0003]然而，由于我国海南地区热带森林过量采伐，致使野生狐尾兰的自然生境受到严重破坏，加上人为的过度采集出售，致使野生狐尾兰数量锐减，严重影响了狐尾兰生态群的构成。且由于狐尾兰的种子在自然条件下不易萌发，采用种子繁殖很难获得后代，虽然可以采取分株方法，但是这种方法不仅繁殖系数低，且繁殖速度非常慢，远远不能满足市场的需求[2]。
[0004]目前，通过组织培养的技术来快速繁殖已在很多兰科植物普遍应用，比较常见的如蝴蝶兰、大花蕙兰等。
【发明内容】
[0005]本发明提供一种狐尾兰组织培养方法，为狐尾兰工厂化育苗提供科学依据。
[0006]本发明是以如下技术方案实现的:一种狐尾兰组织培养方法，以狐尾兰未成熟种子作外植体，应用组织培养等生物技术对狐尾兰类原球茎体诱导、增殖和催根并获得狐尾兰组织培养所需培养基的最佳条件；具体步骤如下:
1)无菌材料的获得
用去离子水冲洗狐尾兰果实表面，然后在超净工作台上用80%酒精表面消毒果实2min,无菌水冲洗3次，再用无菌滤纸吸干水分，然后用解剖刀切开荚果，取出细小种子，轻轻将种子均匀散落到固体培养基上，每平板接种量为55粒种子；
2)类原球茎体诱导
把狐尾兰的种子分别接种于诱导培养基中，诱导原球茎(类原球茎体)的形成。培养基组成成分如下:VW+6_BA1.5mg/L+NAA0.lmg/L ；
3)培养方式的筛选
将诱导出的类原球茎体接种在1/2MS培养基上，分别采用固体培养和液体转动培养两种方式，4次重复，每个处理接种20个三角瓶；四周后统计类原球茎体的增殖倍数；其增殖倍数=新长出的类原球茎体/接种类原球茎体数； 4)植物生长调节剂浓度的筛选
以1/2MS为基本培养基，添加不同浓度的BA，KT, IBA NAA这四种生长调节剂，分别进行单因素试验，每处理4次重复，每个处理接种20个三角瓶；四周后统计类原球茎体的增殖倍数，计算方法同步骤3)；
5)不同添加物对类原球茎体的褐化
以1/2MS为基本培养基，在培养基中分别添加不同浓度的维生素C、活性炭AC和Na2S203;分别进行单因素试验，每处理3次重复，每个处理接种20个三角瓶；50天后观察并记录类原球茎体褐化和生长状况。
[0007]本发明的有益效果是:本发明通过对不同条件下类原球茎体增殖倍数的研究，来明确培养基中各种成分的作用方式，最终得出如下结论:1)液体培养基有利于类原球茎体短期的快速增殖，长期继代培养及保存类原球茎体时选用固体1/2MS培养基适宜；(2)在培养过程中，施加lmg/L的BA的效果更优，可以增加类原球茎体的数目，又不会引起玻璃化的产生；(3)在培养基中加入1.0g/L维生素C可以有效抑制外植体的褐化。
【具体实施方式】
[0008]实施例1
1)无菌材料的获得
用去离子水冲洗狐尾兰果实表面，然后在超净工作台上用80%酒精表面消毒果实2min,无菌水冲洗3次，再用无菌滤纸吸干水分，然后用解剖刀切开荚果，取出细小种子，轻轻将种子均匀散落到固体培养基上，每平板接种量为55粒种子；
2)类原球茎体诱导
把狐尾兰的种子分别接种于诱导培养基中，诱导原球茎(类原球茎体)的形成。培养基组成成分如下:VW+6_BA1.5mg/L+NAA0.lmg/L ；
3)培养方式的筛选
将诱导出的类原球茎体接种在1/2MS培养基上，分别采用固体培养和液体转动培养两种方式，4次重复，每个处理接种20个三角瓶；四周后统计类原球茎体的增殖倍数；其增殖倍数=新长出的类原球茎体/接种类原球茎体数；
4)植物生长调节剂浓度的筛选
以1/2MS为基本培养基，添加不同浓度的BA，KT, IBA NAA这四种生长调节剂，分别进行单因素试验，每处理4次重复，每个处理接种20个三角瓶；四周后统计类原球茎体的增殖倍数，计算方法同步骤3)；
5)不同添加物对类原球茎体的褐化
以1/2MS为基本培养基，在培养基中分别添加不同浓度的维生素C、活性炭AC和Na2S203;分别进行单因素试验，每处理3次重复，每个处理接种20个三角瓶；50天后观察并记录类原球茎体褐化和生长状况。
[0009]实验结果分析
结果显示:液体1/2MS培养基中培养的类原球茎体的增殖倍数极显著的高于固体1/2MS培养基条件下的增殖速度。但同时也表现出固体1/2MS培养基上的类原球茎体的外观表现较好，呈现出嫩绿色的外观，质地紧致。而在液体培养基中类原球茎体粒数多，颗粒大但组织结构较疏松，且严重玻璃化，丧失了分化能力，这与陈春满(2002)在象牙白花兰种子的组织培养研究结果类似M。因此，液体培养基有利于类原球茎体短期的快速增殖，一旦时间过长，将丧失分化能力。如果要长期继代培养及保存类原球茎体时选用固体1/2MS培养基适宜。
[0010]3.2植物生长调节浓度对类对圆球茎体增值的影响
结果显示:可以看出细胞分裂素KT、BA都对类圆球茎体的增值明显的促进作用。表上看，0.45mg/L的KT相对于BA的增值效果更好一些，这样说明了狐尾兰类圆球茎体对KT反应较为敏感，超过一定浓度，如浓度达到lmg/L或高于这个浓度，则会增加类圆球茎体玻璃化的几率。因此，笔者认为1.0mg/L浓度的KT相对于BA效果更好，说明此狐尾兰的根状茎对KT更敏感。
[0011]3.3不同添加物对类圆球茎体褐化的影响
前人的研究认为活性炭、维生素C和他23203可以减缓或抑制培养物褐化。在1/2MS培养基中添加不同附加物，并观察比较其对类圆球茎体生长状况的影响。施结果显示:Na2S203没有有效抑制狐尾兰褐化，为了确认这一结果，笔者又对外植体进行了暗培养、接种前用Na2S203浸泡外植体等处理，均没有抑制狐尾兰褐化。这可能是由于醌类化合物被外植体排到培养基中，从而抑制了植物体内的酶活性。不同浓度维生素C也有在一定程度上也能抑制褐化，不同浓度活性炭一定程度上也能抑制褐化，其原因可能是活性炭吸附了培养基中的有害物质时，也常常会吸附营养物质，因此，笔者推荐0.8mg/L维生素C作为外植体褐化的抑制剂。除此之外，长时间继代培养可使培养物逐渐脱除酚类物质。
[0012]根据本发明并结合前人的研究结果，对狐尾兰组织培养条件进行了优化研究最终得出如下结论:(1)液体培养基有利于类原球茎体短期的快速增殖，一但时间过长，将丧失分化能力，如果要长期继代培养及保存类原球茎体时选用固体1/2MS培养基适宜；(2)在培养过程中，施加1.0mg/L的BA的效果会更优一些，及可以增加类原球茎体的数目，又不会引起玻璃化的产生；(3)在培养基中加入1.0g/L维生素C可以有效抑制外植体的褐化。
[0013]对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。
【主权项】
1.一种狐尾兰组织培养方法，其特征在于:以狐尾兰未成熟种子作外植体，应用组织培养等生物技术对狐尾兰类原球茎体诱导、增殖和催根并获得狐尾兰组织培养所需培养基的最佳条件；具体步骤如下: 1)无菌材料的获得 用去离子水冲洗狐尾兰果实表面，然后在超净工作台上用80%酒精表面消毒果实2min,无菌水冲洗3次，再用无菌滤纸吸干水分，然后用解剖刀切开荚果，取出细小种子，轻轻将种子均匀散落到固体培养基上，每平板接种量为55粒种子； 2)类原球茎体诱导 把狐尾兰的种子分别接种于诱导培养基中，诱导原球茎(类原球茎体)的形成；培养基组成成分如下:VW+6_BA1.5mg/L+NAA0.lmg/L ； 3)培养方式的筛选 将诱导出的类原球茎体接种在1/2MS培养基上，分别采用固体培养和液体转动培养两种方式，4次重复，每个处理接种20个三角瓶；四周后统计类原球茎体的增殖倍数；其增殖倍数=新长出的类原球茎体/接种类原球茎体数； 4)植物生长调节剂浓度的筛选 以1/2MS为基本培养基，添加不同浓度的BA，KT, IBA NAA这四种生长调节剂，分别进行单因素试验，每处理4次重复，每个处理接种20个三角瓶；四周后统计类原球茎体的增殖倍数，计算方法同步骤3)； 5)不同添加物对类原球茎体的褐化 以1/2MS为基本培养基，在培养基中分别添加不同浓度的维生素C、活性炭AC和Na2S203;分别进行单因素试验，每处理3次重复，每个处理接种20个三角瓶；50天后观察并记录类原球茎体褐化和生长状况。
【专利摘要】本发明公开了一种狐尾兰组织培养方法。本发明以狐尾兰未成熟种子作外植体，应用组织培养等生物技术对狐尾兰类原球茎体诱导、增殖和催根并获得狐尾兰组织培养所需培养基的最佳条件；(1)液体培养基有利于类原球茎体短期的快速增殖，长期继代培养及保存类原球茎体时选用固体1/2MS培养基适宜；(2)在培养过程中，施加1mg/L的BA的效果更优一些，及可以增加类原球茎体的数目，又不会引起玻璃化的产生；(3)在培养基中加入1.0g/L维生素C可以有效抑制外植体的褐化。
【IPC分类】A01H4/00
【公开号】CN105409781
【申请号】CN201511012875
【发明人】潘红娟, 张坤, 吴言红
【申请人】镇江常青园林工程有限公司
【公开日】2016年3月23日
【申请日】2015年12月31日