专利名称：新的链霉菌菌株及其相关用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及新的东方链霉菌(Streptomyces orientalis)及产黑链霉菌(Streptomyces melanogenes)菌株，及其用途。
有许多种昆虫会造成农业上重大经济损失，并在植物之间散播病害，粉虱为全世界最恶名昭彰的农业害虫之一。例如1981年时，烟草粉虱(Bemisia tabaci)(Gennadius)造成美国棉花、葫芦及莴苣1亿美元损失。1986年时，粉虱成为佛罗里达州的问题，烟草粉虱使佛州价值800至1000万美元的圣诞红受到约2百万美元的损失。
现在已知粉虱啃食500种以上不同的植物。例如番薯、番茄、豆类、棉花、胡萝卜、树薯、南瓜类、莴苣、辣椒、茄子、西瓜、及小黄瓜为这种害虫的公知宿主。亦已知烟草粉风会传播70种以上虫病毒与微生物引起的病害。
1991年时，台湾首次出现银叶粉虱(B.argentifolii Bellows及Perring)。1995年时，银叶粉虱造成台湾1000公顷的农业损失。
粉虱很难利用公知的杀虫剂施药法控制。有许多因素造成杀虫剂防治工作上的漏洞。只有少数几种杀虫剂商品可有效控制粉虱。然而，这些杀虫剂必须一周彻底施用数次才有效。此外，粉虱的大部份生命期都留在叶子背面；因此，种植者必须调整他们的操作法才可提高除虫剂的覆盖范围。植物之间隙必须足使化学喷洒剂可渗入树顶并到达植物所有表面。
此外，无效率的使用化学除虫剂耗费成本，并有其他显著缺点，如环境污染，且对农民及消费者有潜在健康危害。
因此需要更安全且更有效的防治粉虱方法。虽然生物性防治剂已研究有年，但目前仍无生物性防治剂商品可以成功防治粉虱。
USP 4,942,030及USP 5,413,784揭示利用真菌玫烟色拟青霉(Paecilomyces fumosoroseus)及白僵菌(Beauveria bassiana)防治烟草粉虱。
链霉菌属已广泛用于制造抗生素，然而迄今仍未鉴定出具有对抗粉虱的生物性杀虫活性的链霉菌属。
现已惊人地发现链霉菌属新菌株，称为东方链霉菌Y31014及产黑链霉菌Y31042-1，这些菌株具有对抗粉虱的活性。
因此，本发明一方面提供新菌株东方链霉菌Y31014及产黑链霉菌Y31042-1。
本发明第二方面提供含该新菌株的生物性杀虫剂组合物。
本发明另一方面，提供经由害虫与新菌株接触来防治害虫的方法。
微生物之鉴定与特性分析新的Y31014及Y31042-1菌株是自台湾省苗栗地区的土壤样本中分离。这些微生物经过台湾省新竹食品工业发展研究所鉴定，分别为东方链霉菌及产黑链霉菌。其方法与结果如下采用国际链霉菌计划(International Streptomyces Project)(ISP)为分析链霉菌属特性所建议的方法分析分类学与形态学特性。
1．细胞壁分析取干细胞(10毫克)置入含1毫升6N HCl的试管中，于100℃下水解18小时。水解液过滤及干燥。干粉溶于0.4毫升蒸馏水中，倒至PTLC板上。采用甲醇-H2O-6N HCl-吡啶作为展开溶液。然后在风干后施用茚三酮。二氨基庚二酸(DAP)产生黄绿色，而其他氨基酸则产生紫红色。参见柯马加塔(Komagata)等人，“细胞分类的脂质与细胞壁分析法”(Lipid and Cell Wall Analysis in BacterialSystematics),Meth.Microbiol.19:161-207(1987)。
2．全细胞糖分析法取干细胞(50毫克)置入含1毫升1N H2SO4的试管中，于100℃下水解2小时。利用饱和Ba(OH)2调整水解液pH至5.0-5.5的范围内。水解液离心，收集上层悬浮液，并浓缩。浓缩物溶于0.4毫升蒸馏水中，然后点至滤纸上。采用N-甲醇-H2O-吡啶-甲苯作为展开溶液。施用苯胺酞酸酯使糖类显色。6碳糖在风干后产生褐色，5碳糖则产生粉红色。参见柯马加塔等人，“细菌分类学的脂质及细胞壁分析法”，Meth.Microbiol.19:161.207(1987)。
3．菌株培养特性分析细胞分别于酵母提取物-麦芽汁琼脂(ISP#2培养基)、燕麦粉琼脂(ISP#3培养基)、无机盐淀粉琼脂(ISP#4培养基)及甘油-天冬酰胺琼脂(ISP#5培养基)中培养14天，以观察营养菌丝质量、气生菌丝质量、孢子产量及色素产量。参见希林(Shiring)等人，“链霉菌菌种的特性分析方法”，Int.J.Syst.Bacteriol.,16:313-340(1966)。
4．黑色素产生分析法取细胞于胰蛋白胨-酵母提取物营养液(ISP#1培养基)、蛋白胨-酵母提取物琼脂(ISP#6培养基)及酪氨酸琼脂(ISP#7培养基)中分别培养7及14天，观察黑色素生产情形。参见希林等人，“链霉菌菌种的特性分析方法”，Int.J.Syst.Bacteriol.,16:313-340(1966)。
5．形态特征分析自ISP#2、3、4与5培养基连同琼脂切下细胞，于烘箱中脱水，于离子涂布机上涂布黄金。采用扫描式电子显微镜(SEM)研究形态。
6．糖类的利用与生理特性分析细胞于含1％糖(D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、蔗糖、D-果糖、鼠李糖、棉子糖、I-肌醇、D-甘露糖醇、纤维素、柳醇)的ISP#9培养基上培养细胞7及14天，观察细胞生长。参见希林等人，“链霉菌属的特性分析方法”，Int.J.Syst.Bacteriol.,16:313-340(1966)。
结果示于表1至4。 表2．Y31014的生理特性碳源Y31014D-葡萄糖 +*D-木糖+D-果糖+蔗糖 -L-阿拉伯糖+鼠李糖-棉子糖+D-甘露糖醇+I-肌醇+纤维素-柳醇 +*+阳性反应，-阴性反应 表4．Y31042-1的生理特性碳源 Y31042-1D-葡萄糖+*D-木糖 +D-果糖 +蔗糖-L-阿拉伯+鼠李糖 -棉子糖 +D-甘露糖醇 +I-肌醇 +纤维素 -柳醇-*+阳性反应，-阴性反应细胞壁氨基酸与全细胞糖类分析法Y31014与Y31042-1二种菌种的细胞壁氨基酸与全细胞糖含量分别为LL-DAP及葡萄糖、核糖。根据李希瓦烈(Lechevalier)等人“放线菌类的化学分类学”(The Chemotaxonomy ofActinomycetes),A.狄兹(Dieiz)与D.W.泰尔(Thayer)(编辑)的“放射菌类分类学”SIM特别公告No.6,USA的说明分类，这些菌种属于化学型IC，归为链霉菌属。
品种鉴定与菌种的标准分离株比较时(Actinobase及细菌分类学国际期刊(International Journal of systematic Bacteriology))显示Y31014与东方链霉菌最相关，且Y31042-1与产黑链霉菌最相关。
保藏资料东方链霉菌Y31014及产黑链霉菌Y31042-1培养物已根据布达佩斯条约，于1999年8月20日保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC,10801 University Boulevard,Manassas,VA 20110-2209,USA)，保藏号分别为ATCC PTA-558及PTA-557。
本发明提供了东方链霉菌Y31014及产黑链霉菌Y31042-1的生物性纯培养物。
现有技术已知可在不改变其特性下得到微生物突变种。例如突变种可得自化学或物理性突变剂的处理，如UV光、X-射线、γ-射线及化学物质如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍。现有技术亦已知可利用例如筛选母菌株的培养物得到天然变异株。因此，本发明亦涉及东方链霉菌Y31014与产黑链霉菌Y31042-1中仍保留该菌株特性的突变株或变异株。
新的东方链霉菌Y31014及产黑链霉菌Y31042-1单离株为首次已知对粉虱有高度毒性的链霉菌。
东方链霉菌Y31014及产黑链霉Y31042-1会附着并随后渗入昆虫宿主的外皮。渗入目标害虫外皮后，茵丝体开始进入宿主组织，濒死的昆虫则长满了菌丝体。孢子在宿主的外表面产生。这些孢子会分散并感染新宿主害虫。
东方链霉菌Y31014及产黑链霉菌Y31042-1作用迅速，在施用3至7天内，杀死四龄若虫阶段银叶粉虱的效果达显著的100％。当培养液稀释率达10-3时，可杀死高至70％的害虫。可使用的浓度为每毫升载体约7×109至7×106CFU。
根据施用的目的，发酵的培养液可直接使用或调配成适合喷洒、雾化、撒粉、撒播或浇注的组合物使用。例如组合物可调配成现成可喷洒的溶液、可湿性粉末、悬浮液、高浓缩水性、油性或其他性质的悬浮液或匀散液、乳液、油匀散液、糊剂、细粉或粒剂。当施用时，培养液与本发明组合物可直接接施用至昆虫、植物叶部或其周围环境。
制备生物性杀虫剂组合物时，可由生长培养基排除水份，得到微生物的纯培养物。组合物可依已知方式制备，例如以农业上可接受的载体、辅剂或稀释剂补充活性成份，如不会抑制微生物生长的乳化剂、匀散剂或表面活性剂。
适用于本发明的载体包括(但不限于)天然或合成矿物磨粉，例如方解石、滑石、硅藻土、蒙脱土、活性白土，等等。为了改善组合物的物理性质，可添加高分散性的硅酸盐或高分散性的吸收性聚合物。
适用于本发明的乳化剂包括(但不限于)非离子性与阴离子性乳化剂，例如聚氧乙烯脂肪醇醚，烷基磺酸酯、芳基磺酸酯，等等。
适用于本发明的匀散剂包括(但不限于)木质素-亚硫酸盐废液及甲基纤维素，等等。
合适的表面活性剂包括(但不限于)揭示于麦肯奇的清洁剂与乳化剂手册(McCutcheon’s Detergents and Emul sifiers Annual,MC出版公司,Glen Rock,New Jersey,1988)；及表面活性剂百科全书(Encyclopedia ofSurfactants),Vol,Ⅰ-Ⅲ(Chemical出版公司，纽约,1980-1981)中的公知表面活性剂。
本发明的生物性杀虫剂组合物是针对粉虱Bemisia，因此可用于防治及预防由例如蚜虫、叶蝉及粉虱所传播的毒素病。
本发明的发酵培养液亦可与粉末或颗粒载体组合施用。当喷洒施用时，粉末或颗粒调配物可直接施用至昆虫，植物叶部或周围环境。为了制备可混合粉末或颗粒载体的微生物纯培养物，可排除生长培养基的水份，与不抑制微生物生长的任何其他颗粒或粉末材料组合。虽然微生物可与颗粒载体组合施用，但若载体与发酵的培养液均匀混合时，可更方便且更均匀施用。本发明的生物性杀虫剂组合物使施用的混合物包含微生物孢子与菌丝体及载体。孢子与菌丝体二者的存在会促进群集在目标昆虫上。
实施例1菌种Y31014与Y31042-1的筛选先将保存的微生物移至PDA平板上，于30℃下培养7天。自PDA平板上取出十分之一的微生物，接种至含100毫升NGY培养基(NB8克，葡萄糖10克，酵母萃出物5克，水1升)的500毫升圆底烧瓶中。微生物于30℃,200rpm下培养24小时。取5毫升培养物移至另一个含100毫升SSM331(玉米淀粉30克，黄豆蛋白30克，糖蜜10克，水1升)培养基的500毫升圆底烧瓶中，培养72小时。培养物稀释并准备用于活性选拔试验。
在载玻片上放置二排四龄若虫阶段的银叶粉虱，每一排含有5只幼虫，间隔1公分。取3微升依上述制备的各稀释培养物滴在各幼虫上。载玻片置入含1毫升水滤膜的9公分培养皿中。3至7天后，以显微镜观察结果。
于前3天时发现死亡率并不高。7天后，在10-2稀释率下，经Y31014及Y3104-1菌株处理的幼虫死亡率为100％。在受Y31014菌感染死亡的粉虱身体上发现白色群落。受Y31042-1菌株感染的虫体只发现少数几个群落，但整只幼虫转呈红褐色。
实施例2Y31014与Y31042-1菌株的活性研究为了测定导致粉虱死亡的有效物质(群)是否为Y31014及Y31042-1菌株产生的抗生素物质，或为该微生物本身所致，进行下列实验。
取Y31014及Y31042-1菌培养物于15000 rpm下离心15分钟，分开收集上清液及沉淀块供进一步试验。此外，亦制备Y31041及Y31042-1菌株的经灭菌培养物，或以丙酮或乙酸乙酯提取的培养物。将这些样本依实例2说明的方法施用至粉虱上。结果示于表5与6。
表5Y31014菌种 死亡率(％)*250× 500×750× 1000×培养液 9060 50 50上清液 5060 50 50沉淀块 9070 70 70经灭菌培养物 0 000丙酮提取物 0 000乙酸乙酯提取物 0 000*稀释率表6Y31042-1菌种死亡率(％)*100× 250× 500×培养液 6050 40上清液 0 00沉淀块 7070 10经灭菌培养物 0 00丙酮提取物 0 00乙酸乙酯提取物 0 00*稀释率由表6可见，Y31042-1菌株的生物活性仅出现在培养液及沉淀块中。根据表5，生物活性存在于Y31014菌株的上清液中，然而，其活性较低，且在尸体上发现白色群落。因此认为Y31014与Y31042-1菌株培养物的有效物质为微生物本身。Y31014菌上清液的生物活性主要是源自无法利用离心法完全分离的孢子。
权利要求
1．一种微生物东方链霉菌(Streptomyces orientalis)Y31014的生物性纯培养物，或其突变株或变异株。
2．如权利要求1所述的微生物，其保藏号为ATCC PTA-558。
3．一种微生物产黑链霉菌(Streptomyces melanogenes)Y31042-1的生物性纯培养物，或其突变株或变异株。
4．如权利要求3所述的微生物，其保藏号为ATCC PTA-557。
5．一种生物杀虫剂组合物，其包含有效量的至少一种根据权利要求1至4中任一项的生物性纯培养物及农业上可接受的载体。
6．一种防治目标害虫的方法，其包括施用有效量的至少一种如权利要求1至4项中任一项的生物性纯培养物。
全文摘要
本发明涉及可有效控制粉虱的东方链霉菌(Streptomyces orientalis)Y31014及产黑链霉菌(Streptomycesmelanogenes)Y31042－1分离株。本发明亦涉及新的生物性杀虫剂及其于防治有害生物上的用途。
文档编号C12N1/20GK1318642SQ0010599
公开日2001年10月24日 申请日期2000年4月18日 优先权日2000年4月18日
发明者郭曼娫, 向明, 赖丽秀 申请人:财团法人生物技术开发中心