通过预处理的自体血液治疗充血性心力衰竭的制作方法

专利名称：通过预处理的自体血液治疗充血性心力衰竭的制作方法
技术领域：
本发明涉及治疗充血性心力衰竭的方法，特别是通过将等份改变的血液应用于接受治疗的患者的方法，任选与一种或多种缓解充血性心力衰竭症状的其他治疗方法联合应用。
2、现有技术的描述充血性心力衰竭(CHF)是一种相当常见的疾病，它影响着大约5,000,000美国人，其死亡率超过80,000/年。人们相信CHF本身不是一种确切的疾病过程，而它代表多种解剖学的、功能的和生物的异常的结果，这些异常相互作用，最终一起导致心脏完成其充当循环泵功能的进行性丧失。
CHF可以由于一种诸如心肌梗塞(心脏病发作)的指标事件的发生引起，或者可以继发于其它原因，诸如高血压或心脏瓣膜疾病等的心脏畸形。这种指标事件或其它原因例如通过损害心肌导致心脏泵血能力开始下降。因为一种或多种代偿机制的激活，这种泵血能力的下降可能即刻不是十分显著。但是，已经发现CHF的进展不依赖于患者的血液动力状态。因此，甚至在患者没有症状的时候，由此病引起的损害性改变是存在的，并且不断发展。事实上，在CHF早期维持心血管正常功能的代偿机制实际上有助于此病的发展，例如通过对心脏和循环施加有害的影响。
某些CHF中发生的更重要的病理生理变化有下丘脑-垂体-肾上腺轴的激活、全身内皮机能障碍和心肌重塑。
特别针对下丘脑-垂体-肾上腺轴激活的治疗，包括β肾上腺素能阻滞剂(β阻滞剂)、血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂、某些钙通道阻滞剂、硝酸盐和内皮素-1阻滞剂。钙通道阻滞剂和硝酸盐在改善临床表现的同时，还没有清楚地显示出可延长存活期，然而β阻滞剂和ACE抑制剂已经显示出可明显地延长生命，醛固酮拮抗剂也是如此。应用内皮素-1阻滞剂的试验研究已经显示出有价值的作用。
全身内皮机能障碍是CHF的一个众所周知的特征，它在左室功能不全的体征存在时表现的比较明显。内皮机能障碍在心肌微循环和心肌细胞之间内在关系方面是十分重要的。证据提示微血管机能障碍可明显地有助于肌细胞的机能障碍和形态学改变，它们可导致进行性心肌衰竭。
根据基础的病理生理学，证据提示内皮机能障碍可由NO相对缺乏引起，NO的缺乏是由于一种NADH-依赖的氧化酶所致的血管O2-形成升高以及随后发生的NO过度清除造成的。增加O2-产生的潜在的起作用的因素包括交感神经紧张升高、去甲肾上腺素、血管紧张素II、内皮素-1和TNF-α。另外还有，与TNF-α相比，IL-10水平不适当的低下。IL-10是一种关键的抗炎细胞因子。现在相信升高的TNF-α水平，连同包括IL-6的相关炎前细胞因子一起，和可溶性TNF-α受体，通过引起心肌收缩力降低、两心室扩张和低血压，在CHF发展中起重要的作用，而且可能与内皮活化和机能障碍有关。人们还相信TNF-α可能在迄今无法解释的重度CHF患者中发生的肌肉消瘦中起作用。对用可溶性TNF-受体治疗的小部分患者的初步研究，通过生活质量指数的测定，显示出NYHA功能分级和患者健康得到改善。
心肌重塑是一个复杂的过程，它伴随从无症状心衰至有症状心衰的转变过程，并且可描述为心肌内一系列适应性变化。心肌重塑变的主要构成是肌细胞生物学的改变、由坏死或凋亡引起的肌细胞丧失、胞外基质的改变和左室腔几何学的改变。心肌重塑仅仅是终末器官反应，它在接受长期神经激素刺激的毒性作用多年后发生，还是心肌重塑单独地归因于心衰的进展，不是很清楚。数据证据提示适宜的治疗可减缓或停止心肌重塑的进展。
尽管目前所用的治疗可减轻CHF的症状，而且可纠正此疾病过程引起的某些病理生理异常，但CHF仍是一种残酷地具有较高死亡率的进行性疾病。事实上，现有药物所带来的发病率和死亡率的相对下降大约为10至25％。因此，仍需要附加的或更优良的治疗CHF的方法，尤其是需要可明显减轻基础疾病的治疗方法。
本发明的总结本发明提供一种治疗CHF的方法，此方法包括在体外处理等份哺乳动物的血液，随后输入受治疗哺乳动物的体内，通过此方法至少克服了目前已知CHF治疗方法的某些上述和其它的不利因素。
通过使其经受一种或多种已经发现可改变血液的紧张性刺激，处理等份血液。按照本发明，可通过使此等份血液、或此血液分离的细胞或非细胞成分、或此血液分离的细胞或非细胞成分的混合物接受紧张性刺激，而改变此等份血液。这些紧张性刺激选自温度刺激、电磁发射和氧化环境，或者是这些刺激的任意组合，可同时进行，或顺序进行。
如上所述，与CHF相关的病理生理变化包括免疫激活、内皮机能障碍和坏死和/或凋亡引起的肌细胞丧失。本发明的治疗方法在这三方面都具有治疗价值。
关于免疫激活，已发现在不同物种的几种Th1/TNF-α-依赖性试验炎症模型中本发明的治疗可调节炎症细胞因子的水平。例如，已发现此治疗可在Balb/c小鼠中减轻变应性接触过敏反应，它是一种由TNF-α介导的Th1-驱动免疫反应(Shivji等，Journal of CutaneousMedicine and Surgery 4132-137，2000)；可降低炎症疾病的Lewis大鼠模型佐剂诱导关节炎的IL-6mRNA的表达；并且可降低硬皮病患者Th1与Th2的比例，硬皮病是一种Th1驱动自身免疫性疾病(Rabinovich等，1998年6月21-25日在加拿大蒙特利尔举行的第七次泛美风湿病学会议所提供的海报)。相信此治疗例如通过提高包括IL-10的抗炎TH2型细胞因子，可以降低炎症前Th1型免疫反应。
在人和动物中进行的大量研究中已发现本发明的治疗可改善内皮的功能。例如，已经发现，在重度原发性雷诺病患者中进行的开放研究中，此治疗可提高内皮依赖性血管舒张药的作用(Cooke等，国际血液淋巴管学杂志16250-254，1997)；在继发于动脉粥样硬化的先期外周血管疾病患者的双盲、安慰剂对照的研究中，此治疗可提高一过性闭塞后皮肤血流的恢复速率(Courtman等，Circulation第102卷，#18，增刊II，2000)；在胆固醇饲养的LDL受体缺陷小鼠中此治疗可减轻动脉粥样硬化的进展(Babaei等，美国心脏病学会杂志35(增刊A)243.1999)；以及在严重动脉粥样硬化、高胆固醇Watanabe兔中此治疗可明显提高内皮依赖性血管舒张剂对乙酰胆碱的作用，这可通过对氧化氮兴奋剂(乙酰胆碱)的血管舒张反应的升高得到证明(Courtman等，上述)。相信内皮功能的改善是由于抗炎作用和NO可利用性增加带来的。NO的可利用性增加可带来血管舒张能力的提高，这种血管舒张能力已知在CHF患者中被严重损害。
对于肌细胞丧失，相信本发明的方法可降低凋亡和坏死的水平。已经发现此治疗可保护肾脏免遭局部缺血/再灌注(I/R)损害，已知这种损害与凋亡细胞死亡的增长有关(Tremblay等，Pathophysiology 526；Chen等，Médecine Sciences 15(增刊1)16)，并且此治疗可降低I/R后的肾脏中的凋亡，这可通过Tdt染色的凋亡细胞核的DNA梯度和密度来测定。
由于本发明的治疗在CHF发生病理生理变化的三方面(即内皮功能障碍、炎症细胞因子产生和凋亡引起的肌细胞丧失)产生治疗作用，因此为预知本发明的治疗对CHF患者将是有利的提供了强有力的理论基础。本发明的方法可单独地用作CHF的一种治疗方法，或者与其它治疗联合应用。其它治疗例如硝酸盐治疗、β-阻滞剂、ACE抑制剂、AT受体阻滞剂、醛固酮拮抗剂、钙通道阻滞剂、TNF阻滞剂、TNF-α产生的抑制剂和/或其它更多的常规治疗方法，诸如限制钠和液体、利尿剂、洋地黄等等。已知抑制TNF-α产生的特异药物包括己酮可可碱、氨吡酮、腺苷、酞胺哌啶酮、TNF转化酶(TACE)抑制剂和地塞米松。特异TNF阻滞剂包括单克隆抗体和etanercept。
相应地，一方面本发明为CHF患者提供一种治疗CHF的方法，包括(a)在体外应用至少一种紧张性刺激处理等份患者血液，此紧张性刺激选自一种高于或低于体温的温度、一种电磁发射和一种氧化环境；(b)将步骤(a)中处理的等份血液应用于患者，其中等份血液的量足以减轻患者的CHF。
另一方面，本发明为CHF患者提供一种治疗CHF的联合方法，此联合方法包括给患者应用一种等份的患者自己的血液，这种血液已在体外用一种或多种紧张性刺激进行了处理，此紧张性刺激选自氧化环境、热刺激和电磁发射，而且一种选自硝酸盐、β-阻滞剂、ACE抑制剂、AT受体阻滞剂、醛固酮拮抗剂、钙通道阻滞剂、TNF阻滞剂、TNF-α产生抑制剂、限制钠和液体、利尿剂和洋地黄的治疗。
附图的简要说明现在仅通过参照附图的实施例对本发明进行描述，其中附

图1和2是下面所述实施例2所得结果的图解描述；附图3是下面所述实施例3所得结果的图解描述；附图4是下面所述实施例4所得结果的图解描述；附图5至8是下面所述实施例5所得结果的图解描述；附图9是本发明对接触性过敏Th1介导的炎症的治疗效果的图解描述。
优选实施方式的详细描述按照本发明的一种优选方法，从一个接受治疗的哺乳动物中抽取等份的血液，此哺乳动物优选为人，并且在体外用某种紧张性刺激处理此等份血液，下面进行更详细的描述。在此所用的术语“等份”、“等份血液”或类似的术语包括全血、包括血小板的血液的分离细胞成分，包括血浆的血液的分离非细胞成分，以及它们的组合。紧张性刺激的作用是改变此血液，和/或包含在此等份血液中的细胞成分或非细胞成分。然后通过任意适宜于接种的途径，将改变的等份血液再导入受治疗者的体内，优先选自动脉内注射、肌肉内注射、静脉内注射、皮下注射、腹膜内注射以及口服、鼻腔或直肠给药。
按照本发明的方法，等份血液在体外所接受的紧张性刺激选自温度刺激(血液温度高于或低于体温)、氧化环境和电磁发射，可单独或为任意地组合，同时进行或顺序进行。适宜地，在受治疗的患者中，当等份血液再导入患者体内时，它的量足以至少部分缓解患者的CHF。此等份血液的量优选不超过大约400ml，优选为0.1至100ml左右，更优选为5至15ml左右，尤其优选为8至12ml左右，而且最优选为10ml左右，连同一种抗凝剂，例如2ml枸橼酸钠。
按照本发明，为了确保此血液得到适宜的改变，优选同时应用前面提到的全部三种紧张性刺激处理等份血液。在本发明的某些实施方式中应用任意2种上述紧张性刺激也是优选的，例如应用温度刺激和氧化刺激，温度刺激和电磁发射，或电磁发射和氧化刺激。必须小心应用适宜水平的紧张性刺激，以有效地改变血液，缓解受治疗者的CHF。
温度刺激使接受处理的等份血液温度升高至正常体温以上，或者使等份血液温度降低至正常体温以下。为了使温度刺激不引起等份血液的过度溶血，并且为了当已处理的等份血液注射给受治疗者时将使CHF得到缓解，选择适当温度。优选地，应用温度刺激以使全部或部分等份血液的温度达到55℃左右，而且更优选其温度在-5℃至55℃的范围内。
在本发明的某些优选实施方式中，将等份血液的温度升高至正常体温以上，以使等份血液的平均温度不超过约55℃，更优选为40℃至50℃左右，再优选40℃至44℃左右，而且最优选为42.5±1℃左右。
在其它优选实施方式中，将等份血液的温度降低至正常体温以下，以使等份血液的平均温度在约-5℃至36.5℃的范围内，更优选为约10℃至30℃左右，再优选约15℃至25℃左右。
氧化环境刺激可应用等份的固体、液体或气体氧化剂。它优选包括在前面所述的温度范围内，用一种医用氧气和臭氧气的混合物处理等份血液，最优选通过用一股(臭氧作为一种较少成分的)医用氧气鼓泡等份血液。气流中臭氧的含量和气流的流速优选，使单独或与其它紧张性刺激联合应用时导入等份血液中的臭氧的量不会将细胞损害的水平过度升高而使此治疗无效。气流适宜的臭氧含量不超过约300μg/ml，优选不超过约100μg/ml，更优选约30μg/ml，甚至更优选约20μg/ml，特别优选约10μg/ml至20μg/ml，并且最优选约14.5±1.0μg/ml。在标准温度压力下，供给等份血液气流适宜的流速不超过约2.0升/分，优选不超过约0.5升/分，更优选不超过约0.4升/分，甚至更优选约0.33升/分，并且最优选约0.24±0.024升/分。气流流速的低限优选不低于0.01升/分，更优选不低于0.1升/分，甚至更优选不低于0.2升/分。
当等份血液保持在前面所述温度和当氧气/臭氧气混合物在等份血液中鼓泡时，应用适宜电磁发射刺激，由一种电磁发射源照射接受处理的等份血液。优选的电磁发射选自光电射线，更优选UV、可见光和红外线，甚至更优选UV。最优选的紫外线源为紫外线灯，它主要发射C谱带波长的UV，即波长短于约280nm。这种灯也可发射大量可见光和红外线。也可应用相对于标准UV-A(波长约315至400nm)和UV-B(波长约280至315nm)源的紫外线。例如，可从布置在含有等份血液的样品容器周围的不超过8个的灯，获得适宜剂量的这种紫外线，它与前面所述温度和氧化环境刺激同时应用。将紫外线总能量传递至血液表面的强度约为0.025至约10焦/cm2，优选约为0.1至约3.0焦/cm2，应用这种强度是有利的。优选应用4个这种灯。
等份血液接受紧张性刺激处理的正常的时间范围不超过大约60分钟。此时间在某种程度上依赖于所选择电磁发射的强度、温度、氧化剂的浓度和它供给等份血液的速率。一旦其它紧张性刺激水平设定下来，对操作者而言，建立一些试验的最佳时间是必需的。在最常用的紧张性刺激条件下，优选的时间将在约2至5分钟的范围内，更优选约3或3分钟。起始血液温度，以及将血液温度升高或降低至预定温度的速率，根据受治疗者的不同而变化。这种处理提供一种可注射给受治疗者的改变的等份血液。
在完成本发明的优选方法中，可应用Mueller的美国专利No.4,968,483描述的仪器，用紧张性刺激处理等份血液。将等份血液置于一种适宜的、无菌、可透射紫外线的容器内，此容器可放在此机器内。在应用气流提供氧化刺激之前，将紫外线灯打开，照射固定的一段时间，以使紫外线灯的输出量稳定下来。典型地在紫外线灯照射的同时，将等份血液的温度调节至预定的值，例如42.5±1℃。然后，将已知组合和流速控制的氧气/臭氧混合气体应用于等份血液，如上所述，预定处理时间不超过60分钟左右，优选2至5分钟，最优选约3分钟，以使等份血液同时接受所有三种紧张性刺激的处理。通过这种方法，按照本发明将血液进行适当改变，以获得所需的作用。
优选受治疗者接受一疗程的治疗，每单个治疗包括抽取等份血液，进行如上所述的处理和将已处理的等份血液再应用于此受治疗者。这样一个疗程的治疗可包括每天给予已处理的等份血液，进行连续许多天，或者可包括第一疗程每天治疗，进行确定的一段时间，随后间断，然后进行每天治疗的一个或多个附加疗程。
在一个优选实施方式中，受治疗者接受的起始疗程包括应用4至6个等份的处理血液。在另一个优选实施方式中，受治疗者接受的起始疗程包括应用2至4个等份的处理血液，在连续的日期、或者是间隔1至21天的间歇期(在这些天中患者不应用任何等份血液)，应用任意成对的连续等份血液。分离一对所选择的连续等份血液的间歇期约为3至15天。在一个更特殊的优选实施方式中，治疗起始疗程的剂量方案共包括三个等份血液，在连续日期中应用第一和第二等份血液，在应用第二和第三种等份血液中间安排一个11天的间歇期。在本发明的方法中，在任意给定的日期里，优选仅仅将一种等份血液应用于受治疗者。
可优选在起始疗程后给予附加的疗程。优选在起始疗程结束后至少3周左右给予后面的疗程。在一个特别优选的实施方式中，受治疗者接受的第二个疗程，它包括在起始疗程结束后，每30天应用一个等份的处理血液，持续6个月。
应该认识到在连续疗程之间的间隔应当保持本发明治疗的阳性作用，而且这种作用可根据所观察的受治疗者个体的反应而确定。
如上所述，可优选将本发明的方法用作一种辅助治疗，它可与CHF的其它疗法联合应用。这些其它疗法的优选实例包括ACE抑制剂、β-阻滞剂、醛固酮拮抗剂、TNF阻滞剂、TNF产生抑制剂和其它类型的常规疗法中的一种或多种。
根据下面的特殊实施例对本发明进行进一步说明和描述。
实施例1本实施例描述的研究用于测定本发明的治疗对Watanabe兔内皮功能的影响。众所周知这种兔在生命的第一年中将发展为复合动脉粥样硬化损害。如前所述，内皮机能障碍与CHF的病理生理相关。
这些兔在7至8个月龄时进入研究，将它们随机分为3个组。第一组立即处死，进行基线的测定；第二组(n＝10)注射按照本发明处理的血液；第三组(n＝10)进行模拟治疗，它包括注射未经处理的血液。
此治疗包括，在10周的时间里，共注射4次处理血液。在Mueller等的美国专利No.4,968,483进行一般描述的一种装置中，用下面三种紧张性刺激处理血液(1)温度升高至42.5℃±1.0℃；(2)一种含有14.5±1.0μg/ml臭氧的医用氧气的气体混合物，在血液中鼓泡3分钟，流速为240±24ml/min；和(3)波长为253.7nm的紫外线，总能量强度为2.0焦/cm2(在前面所述的范围内有一些波动)。
通过肌内注射将处理的血液应用于这些动物。按照与治疗动物相同的注射计划，给对照动物肌内注射未处理的血液。
在11月龄处死所有的动物。从这些动物的髂骨动脉摘取环状标本，在用脱羟肾上腺素(一种血管收缩药)处理后，对这些标本进行评价，测定由乙酰胆碱(一种内皮依赖血管舒张药)诱导的舒张的量。
环标本的测定显示，与注射未处理血液的对照动物(22.9±4％)相比，可在治疗动物中观察到内皮介导的血管舒张(52.2±6％)的显著升高(P＜0.001)。
当从环标本上除去内皮后，没有观察到任何舒张，这进一步证实本发明的治疗具有内皮特异性作用。
实施例2本实施例描述的研究是关于本发明疗法对外周血管疾病(PVD)患者的治疗作用。此研究是在瑞典Lund的大学医院进行的。
本研究包括一个安慰剂对照、双盲研究，它是对18名(7名男性，11名女性)中度晚期PVD患者进行试验，他们的主要症状是间歇性跛行。参加本研究的患者是从瑞典Lund大学医院的国内医疗科的供职人员中征募的。
随机分配患者，使其或者接受安慰剂(肌内注射10ml温生理盐水)，或者接受本发明的治疗，此治疗包括肌内注射10ml处理的自体血液。此血液治疗包括将10ml等份患者静脉血采集至2ml充当抗凝剂的3-4％枸橼酸钠中。将每份等份血液转移至无菌的、一次性低密度聚乙烯试管中，然后在Mueller等的美国专利No.4,968,483进行一般描述的一种装置中使血液接受下面的处理(d)温度升高至42.5℃±1.0℃。
(e)在STP下，将含有14.5±1.0μg/ml臭氧的医用氧气在等份血液中鼓泡3分钟，流速为240±24ml/min；和(f)波长为253.7nm的紫外线，总能量为2.0焦/cm2。
在9周的时间里每个患者共注射12次盐水或处理血液。
在治疗开始前、治疗开始后的3周、6周、9周和2月，将每个患者的四肢血流临时性完全闭塞后，通过测定皮肤血流的恢复速率和氧气张力而评估此治疗。
用激光多普勒磁通计(LDF)测定足部的皮肤血流，通过测定足部经皮皮肤氧压力(TcpO2)而测定氧气张力。在接受本发明治疗的患者中，在最大灌注总时间(TPH)和最大灌注半量时间(T1/2PH)两方面均观察到与治疗相关的降低趋势，表明在皮肤血流恢复速率方面得到提高。在对照组中未观察到任何变化。
接受本发明治疗患者的血流恢复速率的提高在治疗的过程中是明显的，而且在整个治疗过程保持持续提高，但是直到治疗开始后2月才具有显著性意义。附图1显示的是的安慰剂组与治疗组的T1/2PH的比较，它们是通过LDF测定的。
还在治疗组中观察到皮肤氧含量更快速恢复的趋势。这种差异在开始治疗后2月时具有统计学意义。治疗组和对照组的局部缺血后最大TcpO2半量时间(O2T1/2)的比较显示在附图2中。
因此本研究表明，在中度晚期PVD患者组中，本发明的治疗在足部皮肤血流完全闭塞局部缺血一段时间后，对足部皮肤血流恢复速率具有明显的生物学作用。对于TcpO2恢复速率也具有相似的作用，但作用较小，然而安慰剂组的患者没有任何变化。这些结果提示本发明的治疗对内皮功能具有有价值的作用，而且它可改善PVD患者皮肤的微循环机能。
实施例3本实施例涉及本发明治疗在预防关节炎发作方面的应用，并且描述了在一个建立的关节炎动物模型中进行的研究结果。在本研究中所用的特殊动物模型是佐剂诱导的关节炎大鼠(例如参见Pearson，C.，1956，″Development of Arthritis，periarthritis and periostitisin rats given adjuvant″，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.，9195)。按照此模型，给大鼠注射包含丁酸分枝杆菌的佐剂而诱导鼠的关节炎。
从Charles River研究室获得雄性Lewis大鼠，年龄4至5周，100至120g，将它们隔离1周，然后进入本研究。在5ml浅白色石蜡油-m3516(Sigma Chemical Co.，St.Louis，Mo.)中悬浮50mg丁酸分枝杆菌(Difco Laboratones，Inc.，Detroit，Mich.)，并用一个均化器将其完全混合，通过这样制备诱导关节炎的佐剂混合物。将足以提供0.15mg丁酸分枝杆菌的这种等份混合物，在尾巴根部经皮下注射给每个动物。每个动物在注射后12天左右出现关节炎症状，表现为肢体肿胀。
两只大鼠用作血液供体，它们没有注射佐剂混合物。通过心脏穿刺从供体采血，并将10ml含枸橼酸盐的血液转移至一个无菌、低密度聚乙烯容器中，以便按照本发明用紧张性刺激进行体外处理。应用在上述Mueller专利中一般描述的一种仪器，用按照本发明的一种处理刺激此血液。
给6个动物一个疗程的2次注射，每次注射0.2ml等份处理血液，在关节炎发作后的连续日期里进行注射。给对照组的8只大鼠注射未处理血液，注射方案与治疗组的相同。在关节炎诱导1天后开始注射。在关节炎发作后，应用一个顶装式Mettler天平在一个250ml烧杯中，通过水置换法，每隔1天测量这些动物后爪的体积。平均每组动物的结果，并用图表显示在附图3中，附图3是一个关节炎诱导后每天平均足体积的图表。上面的曲线来源于对照组动物，下面的曲线来源于接受处理血液注射的动物。根据足体积较低，表明治疗组动物关节炎的严重性显著降低，与对照组动物相比，有明显的统计学意义。
上面的结果表明，用改变的哺乳动物血液治疗受治疗者，可有效地预防哺乳动物关节炎的发作。
在诱导关节炎10天后测定治疗动物和未治疗动物淋巴结中IL-6mRNA的表达，结果显示在下面的表1中。表1
上面表1所示的结果表明本发明的治疗可控制Th1/TNF-α-依赖性关节炎模型的炎症细胞因子的水平。证明诸如IL-6和TNF-α等的炎症细胞因子的产生与CHF的病理生理学相关。
实施例4通过应用包含局部缺血，并且随后各种身体器官再灌注的一种动物模型系统，本实施例所报告的试验表明本发明的治疗具有降低凋亡和坏死的作用。已知局部缺血-再灌注损害引起所影响器官和组织凋亡和坏死的增多，例如参见Saikumar p，et.al.″Mechanisms of celldeath in hypoxia/reoxygenation in jury″，Oncogene 1998 December24；17(25)3341-9；Burns A.T.et.al.，″Apoptosis inischemia/reperfusion in jury of human renal allografts″，Transplantation，1998 October 15；66(7)872-6；和前面及后面的其它发表论文。本实施例使用已知技术进行细胞水平凋亡的测定。
本试验的动物是正常的纯种小猎兔犬，1-2岁大，雄性和雌性数量相等。将这些动物分为A、B、C、D4个组，每组由6只动物组成，3只雄性和3只雌性。A组和C组动物应用本发明的方法，即接受2个疗程为10天的治疗，该治疗包括每天抽取8ml等份血液，用氧/臭氧、紫外线和加热在体外处理此等份血液，以及通过肌内注射将5ml处理后的等份血液再应用于相同的动物。
这种治疗均按照下面方法进行。
抽取动物8ml等份血液，用枸橼酸钠(2ml)处理，将其置于一个无菌容器中。在前面所述Mueller的美国专利4,969,483中一般描述的一种仪器中，使此血液同时接受紫外线、氧/臭氧气体氧化环境和升高的温度刺激的处理。更特殊的是，用红外线灯将无菌的、紫外线可穿透的容器中的血样加热至42.5℃，并且将其保持在此温度，在前面所述的优选条件下，使其接受主要波长为253.7nm的紫外线的处理。同时，将医用氧气和臭氧的混合物在此血样中冒泡，臭氧的含量为13.5-15.5μg/ml，流速在60-240mls/min(STP)范围内。同时进行紫外线照射和气体混合物通气的时间为3分钟。将处理后的等份血样的5ml经肌内再注射给每个试验动物。
接受本发明治疗疗程的A组和C组的每个动物，在2个10天的疗程之间，经历一个3周的休息期。B组和C组是对照组，它们接受2个疗程为10天的治疗，即每天注射5ml生理盐水，在2个10天的疗程之间为一个3周的休息期。
在第2注射疗程后的1天，在轻微气麻醉下将动物麻醉，并通过背部切开摘取每个动物的右肾。用闭合夹夹在剩余肾动脉和静脉上60分钟，使左肾短暂局部缺血。然后去掉夹子，使肾脏通过正常血流再灌注。
在局部缺血步骤后对动物观察6天，然后将它们处死。通过手术摘取每个动物的缺血肾脏，将其分为两部分。将一部分冰冻在-80℃，将另一部分固定在10％福尔马林中，以进行免疫和常规病理组织学研究。
在摘除对照肾脏的时候和处死以后，均测定从缺血肾脏和对照肾脏分离的近曲小管细胞中线粒体的膜电位。为了达到此目的，应用胶原酶处理方法纯化狗肾正常或局部缺血肾皮质的近曲小管，此方法是Marshansky等在《Isolation of heavy endosomes from dog proximaltubes in suspension》J.Membr.Biol 153(1)，59-73，1996中描述的。在一个含有250mM蔗糖、10mM HEPES-Tris(pH7.5)和250μMEDTA的缓冲液中进行组织匀化，然后通过差速离心在悬浮液中分离肾脏线粒体(see Marshansky，″Organic hydroperoxides at highconcentrations cause energization and activation of AATPsynthesis in mitochondria″，J.Biol.Chem.264(7)，3670-3673，1989)。通过在10,000g下离心30分钟，除去细胞碎屑。用不含EDTA的蔗糖/HEPES缓冲液冲洗此线粒体。
应用JC-1染料(参见Salvioli等在″JC-1是测定完整细胞中δψ变化的一个可靠的荧光探针，而不是DiOC6(3)或碱性蕊香红123，这是凋亡过程中对线粒体官能度研究的提示″，FEBS Letters 411(1)，77-82，1987)，按照Kroemer，G.，Zamzam，N.和Susin，S.A.在″凋亡的线粒体控制″((综述)《今日免疫学》(1997)v.18，p44-51)中所述的方法测定线粒体膜电位。在一个Deltascan Model RFM-2001分光荧光计(Photon Technology International，South Brunswick，N.J.)上连续监测正常和局部缺血肾脏的纯化线粒体悬浮液中的JC-1荧光。激发波长为490nm(裂隙宽度2nm)，发射波长为590nm(裂隙宽度4nm)。用Felix(版本1.1)软件记录信号。在37℃下连续搅拌的同时，进行所有的测定。用于测定线粒体膜电位的孵育缓冲液包含200mM蔗糖、5mM MgCl2、5mM KH2PO4、0.1μM的JC-1和30MmHEPES-Tris(pH7.5)。底物和抑制剂的浓度为10mM丁二酸盐、0.1μM鱼藤酮，含有或不含0.1μM FCCP。对局部缺血之前右肾(对照肾)和局部缺血后第6天处死狗后左肾(局部缺血肾)的近曲小管线粒体膜电位进行估计，并且在用FCCP对线粒体解偶联后根据JC-1的差值估计近曲小管线粒体膜电位，结果显示在附图4A中。在每次测定中应用50μg纯化原料的蛋白。
JC-1荧光与线粒体膜电位是成比例的。对侧切除肾作为对照。从附图4B中可清楚的表明，本发明的治疗方法没有改变非局部缺血对照右肾的膜电位(治疗组与盐水组相比p＝0.445)。但是，与对照肾相比，注射盐水的动物局部缺血肾的荧光显著降低(p＜0.05)。本发明的刺激治疗阻止了局部缺血/再灌注期间线粒体的解偶联，并且局部缺血和对照肾相比，膜电位没有显著差异(p＝0.244)。按照本发明的方法对这些狗进行预处理，至少至再灌注后的6天，这些狗局部缺血肾的这种参数保持显著增高(p＝0.0006，与注射盐水狗相比)。
这些结果表明本发明的方法具有保护肾脏，对抗凋亡的作用，并且/或促进线粒体水平的恢复。因此，预处理哺乳动物躯体的细胞、组织和器官以对抗随后遇到的通常可促进凋亡的因素，本发明的方法是需要的。
特别是，线粒体膜电位的保护证明本治疗具有保护线粒体的能力，而且因此具有将细胞进行预处理而对抗凋亡的作用。
实施例5对一组12只雄性SHR大鼠进行治疗，或者注射上面实施例4中描述的混合的受刺激血，或者在对照动物中注射盐水。因为这种遗传系的所有动物的血液是完全相同的，所以按照本发明的方法处理这种同一系的一个动物的血液，以便应用于试验动物。将枸橼酸钠作为一种抗凝剂处理血液，并将其放在一个无菌的容器中。给这些鼠在-14天和-13天注射150μl刺激血液，然后进入一个11天的休息期，并在局部缺血手术前一天进行第三次注射，或者平行注射盐水。在手术当天，用轻荧烷麻醉这些鼠，通过中腹切开术摘除右肾。然后通过应用一个微夹闭合左肾动脉和静脉，而使左肾短暂局部缺血。然后使皮肤一过性闭合。闭合60分钟后，除去夹子，并缝合伤口。在再灌注后12小后处死这些动物。
摘取试验动物的局部缺血和非局部缺血肾脏，对它们进行DNA梯形试验。寡核小体DNA裂解为180至200个碱基对是一个特殊的模式，在各种进行凋亡的器官中进行琼脂糖凝胶电泳后，此模式呈现为一个梯形。为了估计肾皮质中DNA裂解的程度，称重等份粉碎的肾皮质，在EDTA存在下，用蛋白酶K和RnaseA进行组织消化后，通过苯酚-氯仿方法提取全部组织DNA。通过应用末端脱氧核苷酸转移酶与P32-dCTP一起进行酶测定(参见Teiger等，“鼠压力负荷过大诱导的心脏肥大中的凋亡”，J.Clin.Invest.97，2891-2897，1996)，标记1μg提取的DNA。将增加的放射性标记DNA的量加样在1.5％琼脂糖凝胶上。电泳后，将DNA转移至尼龙膜(Hybond)上，在一个Phosphorlmager(Molecular Dynamics)中测量与150至1500bp DNA片段相关的放射性。将放射性作为在凝胶上加样的DNA的一个函数，绘制每个样本的回归线(参见deBlois et.al，“Smooth muscle cellapoptosis during vascular regression in spontaneouslyhypertensive rats.’Hypertension 29，340-349，1997)。线性回归线的斜率用作DNA裂解指数(cpm/pixel/μg DNA)。
附图5以图表的形式显示了局部缺血-再灌注(I/R)肾的结果，以及正常肾、非I/R肾、没有注射刺激血液的动物肾的结果，它是各种样本(纵轴)与再灌注开始后时间的回归线斜率的一个图表。表示DNA裂解的DNA梯形，与对侧非局部缺血器官相比，在局部缺血肾皮质中明显增高，而且在12小时获得的最大值在48小时时返回至基础值附近。因而在早期局部缺血诱导的肾凋亡上，将12小时选作研究本发明刺激血液的作用的时间点。
附图6是150-1500bp范围中裂解DNA电泳凝胶的一个图谱，它们是按照将放射性标记附加在DNA碎片的方法进行了放射性标记。痕迹S是由肾局部缺血-再灌注前注射盐水的动物肾脏DNA得出的，痕迹V是由肾局部缺血-再灌注前注射刺激后血液的动物肾脏DNA得出的。此图显示60分钟的肾缺血导致12小时时在2组大鼠中裂解DNA均明显蓄积，但是在接受处理血液的动物中这个参数的水平显著降低(p＜0.05)。附图6B测定样本放射性的量，它为任意单位，并表明DNA裂解-梯形在S和V样品中均发生，它是缺血/再灌注的结果，但是与S样品相比，V样本中这种程度明显降低。附图6B中的结果是每例6个动物的均值。
这些结果证实，按照本发明应用刺激的血液对肾再灌注损伤的细胞保护作用包括对早期或晚期凋亡的抑制。
附图7和附图8分别显示了根据DNA梯和Tdt染色的凋亡核密度测定的，在凋亡早期(12小时后)本发明的治疗减少缺血/再灌注后肾脏凋亡的能力。附图3B也显示了按照本发明进行治疗的动物中缺血/再灌注后肾脏中细胞数目也显著增加。
实施例6本实施例描述了对少量患有晚期慢性充血性心力衰竭病人的治疗。这些患者的慢性充血性心力衰竭NYHA分级为III-IV级，左室射血分数(LVEF)小于40％，6分钟步行距离小于300m。某些患者在此之前还接受了其它CHF治疗。
方案给患者注射一些处理的血液。治疗计划包括在第1天、第2天和第14天进行注射，然后每30天注射1次，持续5个月，每次注射的量为10ml。每个个体的治疗包括下面步骤
1.为了注射，在USP下，收集病人自己的10ml静脉血，加入2ml 3-4％枸橼酸钠。向样品中加入枸橼酸钠，以防止在治疗期间血液发生凝集。
2.将枸橼酸化的血样移至一个无菌、一次性的低密度聚乙烯容器中。
3.通过同时接受下列情况，对该血样进行体外处理-温度升高为42.5±1.0℃，-含有14.5±1.0μg/ml臭氧的医用氧气的气体混合物，它以240±24ml/min的流速向血样中通气(在STP下)；以及-波长为253.7nm的紫外线。
4.将血样从无菌的一次性容器移至一个无菌的注射器中。
5.在注射部位进行局部麻醉(1Ml 2％奴佛卡因或等同物)后，将2ml或10ml处理过的血样肌肉注射入同一个病人的臀部肌肉中。
上述步骤(3)中所述的血样的体外处理是在一个仪器中进行的，该仪器通常描述于Mueller等的美国专利第4,968,483中。在3分钟的时间内，对血样同时进行所有三种紧张性刺激。
CHF的评价在每次随访期间，观察病人的副反应。而且，治疗后继续进行存活、住院和严重的副反应的监测。
用于评价治疗有效性的主要的最后分析结果在步行6分钟的距离和/或NYHA功能分级方面发生变化。次要的最后分析结果包括心功能的改善、利尿需要的减少；住院停留减少；和症状的改善。
正如上述资料说明的那样，本发明的治疗在人和大量动物模型系统中已经显示出具有重要的生物学活性，所有这些活性包括Th1/TNF-α依赖性炎症反应。如上所述，人们相信该治疗例如通过提高包括1L-10的抗炎TH2型细胞素，减轻炎症前Th-1型免疫反应。这将至少部分地解释本发明的治疗能够在CHF特征性的三个方面均能产生治疗作用的原因。
而且，有证据提示本发明的治疗是1L-10依赖性的(附图9和Shahid S等，Journal of Investigative Dermatology，14，No.4，2000)，它导致抗炎细胞素例如1L-10升高，并导致TH-1驱动的免疫反应下降。人们还提出1L-10可能是CHF细胞素网络中的一个重要成分，原因是它似乎降低了CHF中1L-10相对于TNF-α的水平(Yamaoka等，Jpn Circ J63951-956)。
虽然，参照特殊的优选实施方式，已经对本发明进行了描述，但是我们应该认识到在不背离本发明的精神或范围的情况下，可以对本发明进行许多修改。计划将所有这些修改包括在下列权利要求的范围内。
权利要求
1.一种等份的病人改变的血液，在制备一种用于治疗人充血性心力衰竭(CHF)的药物中的应用，该等份的血液是通过在体外用至少一种选自高于或低于体温的温度、电磁发射和氧化环境的紧张性刺激处理而制备的。
2.按照权利要求1的用途，其中在处理等份血液中所使用的氧化环境包括将一种氧化剂用于该等份血液。
3.按照权利要求2的用途，其中氧化剂含有臭氧气体，而且臭氧气体以不会将细胞损害的水平过度升高的量导入等份血液中。
4.按照权利要求2或3的用途，其中氧化剂含有一种臭氧气体和医用氧气的混合物，该臭氧气体在混合物中所包含的浓度不超过大约300μg/ml。
5.按照权利要求4的用途，其中臭氧气体在混合物中所包含的浓度不超过大约30μg/ml。
6.按照权利要求5的用途，其中臭氧气体在混合物中所包含的浓度大约为13.5μg/ml至15.5μg/ml。
7.按照权利要求4、5或6的用途，其中混合物以不超过大约0.33升/分的流速用于等份血液中。
8.按照权利要求7的用途，其中混合物以大约0.21升/分至0.27升/分的流速用于等份血液中。
9.按照在前任意一个权利要求的用途，其中在处理等份血液中所使用的电磁发射包括具有一种或多种UV-C谱带波长的紫外线。
10.按照在前任意一个权利要求的用途，其中在处理等份血液期间用于冷却或加热等份血液的温度，使至少部分等份血液的温度在大约-5℃至55℃的范围内。
11.按照在前任意一个权利要求的用途，其中在处理步骤期间等份血液的平均温度在大约37℃至44℃的范围内。
12.按照在前任意一个权利要求的用途，其中在处理步骤期间等份血液的平均温度在大约0℃至36.5℃的范围内。
13.按照权利要求12的用途，其中所述的等份血液中的平均温度在大约10℃至30℃的范围内。
14.按照权利要求10的用途，其中所述的温度在大约37℃至55℃的范围内。
15.按照权利要求14的用途，其中所述的温度为42.5±1℃。
16.按照在前任意一个权利要求的用途，其中等份血液的体积不超过大约400ml。
17.按照权利要求16的用途，其中等份血液的体积大约为10ml。
18.按照权利要求16的用途，其中等份血液的体积大约为2ml。
19.按照在前任意一个权利要求的用途，其中等份血液用紧张性刺激处理的时间不超过大约60分钟。
20.按照权利要求19的用途，其中等份血液用紧张性刺激处理的时间大约为3分钟。
21.按照在前任意一个权利要求的用途，其中等份血液用所有三种上述紧张性刺激同时处理。
22.按照权利要求1至21中任一的用途，其中等份血液用任意两种上述紧张性刺激同时处理。
23.一种病人自己的等份血液与一种选自硝酸盐、β-阻滞剂、ACE抑制剂、AT受体阻滞剂、醛固酮拮抗剂、钙通道阻滞剂、TNF阻滞剂、TNF-α产生抑制剂、限制钠和液体、利尿剂和洋地黄的药剂联合，在制备一种用于治疗人充血性心力衰竭(CHF)的药物中的应用，该等份的血液是经过体外一种或多种选自氧化环境、热刺激和电磁发射处理的。
24.按照权利要求23的用途，其中的药剂是一种选自己酮可可碱、TACE抑制剂、氨吡酮、腺苷、肽胺哌啶酮和地塞米松的TNF-α产生抑制剂。
全文摘要
一种治疗人充血性心力衰竭(CHF)的方法，它包括在体外至少用一种选自温度刺激、电磁发射和氧化环境的紧张性刺激处理等份的病人血液，然后将处理过的血液给予该病人。该治疗可以单独应用或作为一种辅助疗法与常规的CHF治疗联合应用。
文档编号C12N5/08GK1400906SQ01804846
公开日2003年3月5日 申请日期2001年1月18日 优先权日2000年1月18日
发明者E·R·史密斯, G·托勒－阿米昂 申请人:瓦索根爱尔兰有限公司