专利名称：乙型肝炎病毒突变位点的肽核酸检测芯片及其制备方法
技术领域：
本发明涉及基因芯片领域，具体地是涉及肽核酸低密芯片及其制备方法，尤其是涉及乙肝突变位点的肽核酸检测芯片及其制备方法。
肽核酸最早是在1991年由彼得等人合成的一种用于反义、抗基因治疗的核酸类似物。它是由N-(2-氨基乙基)甘氨酸替代DNA分子中的磷酸戊糖骨架，四种碱基通过亚甲基羰基与骨架相连。肽链骨架的引入，赋予了PNA独特的理化和生物学特性。PNA在分子生物学领域前景非常广阔，它已被用于增强的PCR扩增、PNA胶前杂交(pre-gelhybridization)、PNA辅助剪切(PNA-assisted rare cleavage)、核酸纯化、采用PCR发夹(PCR clamping)分析单碱基突变，用PNA作探针通过毛细管电泳检测遗传突变，发展PNA衍生物，生物传感器等领域。
肽核酸为非手性分子、不带电荷，稳定性高、不易被蛋白酶和核酸酶所降解、在很宽的pH值范围内稳定，与核酸的结合遵循瓦斯顿-克瑞克(Waston-Crick)碱基互补配对原则。由于PNA含中性骨架，链间无排斥作用，它与DNA、RNA所形成的杂交体热稳定性要比相应的RNA-RNA、DNA-DNA、DNA-RNA高。10-mer的PNA与相对应的DNA杂交所形成的反向平行二聚体的Tm值为50℃，15-merPNA的Tm值为70℃。PNA的结合特异性也要高于DNA和RNA，15-mer PNA/DNA中一个碱基的差异就可使Tm值下降8-20℃(平均为15℃)，而相应的DNA/DNA Tm值下降为4-16℃(平均为11℃)。而且PNA的杂交不依赖于高盐离子强度，只需低的盐离子强度。考虑到PNA的配对、结合和杂交等特性，PNA探针在识别单碱基突变、微阵列等方面具有广阔的前景。
肝炎是世界性传染疾病，我国是公认的肝炎大国，肝炎的患病率和发病率都居世界前列。乙肝病毒基因不同位点的突变可引起免疫逃避、抗病毒治疗逃避，使得临床检测出现漏检、用药不当，以至延误治疗。本发明采用标记的RNA和肽核酸芯片杂交来检测乙肝突变位点，能提高检测的灵敏度和特异性，至今未见报道。
发明内容针对上述不足，本发明要解决的问题是提供一种乙型肝炎病毒突变位点的肽核酸检测芯片及其制备方法，并同时公开乙肝已知突变位点的肽核酸检测探针和阴、阳性对照探针，用于PCR扩增的上、下游引物。该肽核酸检测芯片具有快速、高效、准确、平行诊断的特点，能为临床用药、治疗提供重要依据。
本发明的乙型肝炎病毒突变位点的肽核酸检测芯片，包括基片和阵列式分布的肽核酸探针与对照的点涂层，基片是玻璃基片，尼龙膜之一。肽核酸探针与对照的点涂层是指在基片上均匀分布的，含有乙肝前核心抗原区(前C区)和表面抗原区(S区)已知突变位点和野生位点的24条检测探针，2条阳性对照探针，1条阴性对照探针及空白点样液对照。
上述的基片是未经任何修饰的玻璃裸片、醛基化玻璃片、氨基化玻片和尼龙膜之一。
上述醛基化玻片采用饱和碳酸氢钠溶液作为点样液，氨基化、未经任何化学修饰的玻璃裸片和尼龙膜采用杂交液作为点样液。
上述的肽核酸探针所在阵列与对照的点涂层的大小，可以根据点的大小，点间距的变化而变化，阵列在基片上的分布数目可根据待分析样品的数目而变化。
上述的肽核酸探针排列如附图2所示，肽核酸探针点直径为100μm，点间距为300μm时，肽核酸探针所在阵列与对应的点涂层大小为1.6mm×1.6mm。
上述的肽核酸检测探针，包括乙肝表面抗原区已知的5个突变位点546C-T、551A-G、552T-C、585A-C、587G-A；前核心抗原区已知的7个突变位点1896G-A、1762A-T与1764G-A联合突变、1858C-T、1862G-T、1898G-A、1899G-A、1901 G-A；突变位点肽核酸检测探针12条，野生位点肽核酸检测探针12条，合计肽核酸检测探针24条。
上述的2条阳性肽核酸对照探针，分别源于前核心抗原区和表面抗原区的核酸保守序列。
上述的阴性肽核酸对照探针源于人ATM基因中的17mer核酸序列。
上述的肽核酸探针是长度为14-18mer的肽核酸，均设计在乙肝病毒DNA反义链，其氨基末端连有O-连接子(O-1inker，8-amino-3，6-dioxaoctonic acid)，对应着DNA链的3′端。
本发明乙型肝炎病毒突变位点的肽核酸检测芯片的制备方法包括以下步骤1、肽核酸PNA检测探针的设计及合成肽核酸探针的长度为14-18mer，均设计在乙肝DNA反义链。突变检测位点尽可能设计在肽核酸探针的中间位置，所有探针的Tm值按GC碱基百分比计算，相差不超过10℃。其氨基末端连有O-连接子，对应着DNA链的3′端，即PNA与样品DNA以反向平行方式结合。该芯片所用肽核酸探针及其序列见表1。PNA探针由德国麦德堡(MetabionGmbH)公司合成。
2、玻片的修饰与PNA探针的固定用含1％-5％3-氨基丙基三甲氧基硅烷的95％丙酮溶液处理玻璃载玻片，即得到氨基化玻片。氨基化玻片经5％-25％的戊二醛溶液处理2-5小时后，得到醛基化玻片。肽核酸含有氨基端，通过希佛氏碱反应与醛基化玻璃基片结合。醛基化玻片采用饱和的NaHCO3溶液作为点样液，氨基化、未经任何化学修饰的玻璃裸片和尼龙膜采用杂交液，即pH7.0的10mM的磷酸盐缓冲液(0.1mMNaCI、5mMEDTA、0.1％SDS)作为点样液。
3、乙肝样品DNA的提取、PCR扩增和荧光标记1)DNA提取取20-100μl乙肝血清，加入3倍体积的裂解液，混匀。加入等体积的氯仿、异戊醇溶液(24∶1)，离心后向吸取上清液，加入2倍体积的无水乙醇，冷冻后离心，所得沉淀用70％的乙醇清洗2次。
2)PCR扩增所采用的PCR上下游引物分别为上游引物5′ATTAACCCTCACTAAAGGGGAGGCATACTTCAAAGACTGT 3′T3启动子序列下游引物5′GATGGGATGGGAATACA 3′上游引物起始于乙肝病毒DNA正义链的1700位点(起始位点是以GeneBank号为AF100308的乙肝病毒DNA为参考)，长度为21个碱基，5′端连有19个碱基的T3启动子序列。下游引物的长度为17个碱基，起始于乙肝病毒DNA正义链的601位点。PCR扩增区域为2133bp，包括了前C区与S区所有已知突变位点。
PCR扩增采用美国MJ Research PTC-225PCR扩增仪，扩增体系为25μl。程序如下94℃ 1.5min 1个循环94℃ 20sec、 55℃ 20sec、72℃ 2.5min共计35个循环72℃ 8min 1个循环所得PCR扩增产物经玻璃奶纯化。
3)体外转录标记采用普洛麦格(Promega)公司商用试剂盒，在T3体外转录中加入Cy3-UTP标记。
4、肽核酸阵列的杂交和检测，信号分析体外转录得到的RNA经片段化后与肽核酸阵列杂交。杂交温度为65℃-85℃，时间为1-3个小时。杂交液采用10mM的磷酸盐缓冲液pH7.0，内含0.1mMNaCI、5mMEDTA、0.1％SDS。清洗液采用10mM的磷酸盐缓冲液洗1次，5mM的磷酸盐缓冲液洗2次。
杂交后的肽核酸芯片经激光扫描仪扫描或荧光显微镜观察并收集信号，依据扫描分析或荧光定量，阴性对照和点样液对照无荧光信号，阳性对照探针有荧光信号。根据各位点野生型和突变型探针荧光信号的强弱来确定该位点是否有突变发生。表1 乙型肝炎病毒突变位点的肽核酸检测芯片中肽核酸探针的序列
表1肽核酸探针序列中黑体标记的碱基是待检测的位点。
本发明的优点和效果1)PNA与DNA、RNA杂交所形成的PNA-DNA、PNA-RNA二聚体的Tm值、稳定性要高于相应的DNA-DNA、DNA-RNA，存在一个碱基的差异，PNA-DNA的Tm值就会降低8-20℃。因而PNA芯片在识别单碱基差异方面具有独特的优势。
2)PNA与RNA的杂交二聚体的稳定性要高于PNA-DNA，故本发明采用RNA。长的单链RNA经片段化后更易于杂交的进行。
3)PNA与DNA、RNA的反向平行结合(PNA的氨基端对应着DNA的3′端)所形成的二聚体的稳定性要高于其正向平行结合方式(PNA的羧基端对应着DNA的3′端)，本发明正是采用反向平行结合方式。
图1是乙型肝炎病毒突变位点的肽核酸检测芯片的示意图。
其中，1为基片，2为肽核酸探针与对照的点涂层。
图2是肽核酸检测芯片中肽核酸探针分布图。
其中，A1、A6、F1、F6均代表阳性对照PCS，B1、B6、F1、F6均代表阳性对照PCCC1与C6均代表阴性对照NC；D1与D6为点样液对照；A2、3、4、5分别代表探针S1、S3、S5、S7；B2、3、4、5分别代表探针S2、S4、S6、S8；C2、3、4、5分别代表探针S9、C1、C3、C5；D2、3、4、5分别代表探针S10、C2、C4、C6；E2、3、4、5分别代表探针C7、9、11、13；F2、3、4、5分别代表探针C8、10、12、14。
图3是上、下游引物扩增乙肝DNA所得到的PCR产物电泳图谱。
其中，泳道1的白色条带是目的扩增片段，长度为2136bp。泳道2是TaKaRaDL-2000分子量Marker，白色条带从上到下长度分别为2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，1OObp。
图4是部分固定在醛基化玻片上的部分肽核酸检测探针杂交后经激光共聚焦扫描仪Scanarray4000(激光强度为80，PMT增益为80)扫描结果图。
上排的三个点分别为1896、1762与1764联合位点、1862三个位点的野生探针杂交后扫描结果。下排的三个点是与上排位点相对应的突变探针杂交后的扫描结果。根据荧光信号的强弱，可以断定检测样品的1896与1862位点未发生突变，1762与1764联合位点发生突变。
(五)
具体实施例方式
实施例1结构如附图1所示在基片1上阵列式均匀分布有肽核酸探针与对照的点涂层2，其中含有乙肝前C区和S区已知突变位点和野生位点的24条检测探针，2条阳性对照探针，1条阴性对照探针及空白点样液对照。阳性探针均位于阵列的四周，它不仅是阳性对照的作用，同时可以作为阳性信号，定位阵列。乙肝DNA样品PCR扩增产物经体外转录标记后与肽核酸阵列杂交，由激光共聚焦扫描仪扫描得出结果，并进行分析与判断。
实施例2玻片的修饰与肽核酸探针的固定1、玻片的修饰将空白玻璃载片用10％NaOH清洗，再用1％HCI酸液洗，水洗后甩干，即得到干净的玻璃裸片。用1％3-氨基丙基三甲氧基硅烷的95％丙酮溶液中处理30分钟，然后用丙酮清洗3次，每次5分钟，80℃烘烤15分钟，得到的氨基化玻片。继续用10％的戊二醛水溶液处理30分钟，然后用双蒸水清洗，真空干燥后得到醛基化修饰的玻片。
2、肽核酸探针的固定(以醛基化玻片为例)肽核酸探针的设计与选择见表1所示。
肽核酸探针在醛基化玻片上的固定，用饱和的NaHCO3溶液作为点样液。肽核酸探针浓度均为50μM，经点样仪点到相对应的玻片上(肽核酸探针在基片上的分布图见附图2)，点直径为100μm，点间距为300μm。肽核酸阵列的大小为1.6mm×1.6mm。将点样后得到的肽核酸芯片放到湿盒里，37℃水合2个小时。然后进行以下处理1)将玻片用0.2％的SDS溶液清洗两次，每次5分钟，以除去未结合的肽核酸。
2)将玻片浸于纯水中清洗两次，每次5分钟。
3)将玻片用0.26％的硼氢化钠溶液(用75％的磷酸盐，25％的乙醇溶液配置)处理5分钟，封闭未反应的醛基。
4)将玻片用0.2％的SDS溶液处理3次，每次1分钟。
5)将玻片用焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的纯水清洗两次，每次1分钟。
6)用平板离心机，800rpm 10分钟，甩干玻片，以杂交使用。
实施例3乙肝样品DNA的提取、PCR扩增和标记1、乙肝样品DNA的提取1)取100μl乙肝血清，加入3倍体积的裂解液(4M硫氰酸胍、巯基乙醇、0.1MTris-CI，pH7.5)，混匀。
2)加入等体积的氯仿、异戊醇溶液(24∶1)，充分混匀。室温下12000rpm离心15分钟。
3)小心将上清液移入另一1.5ml离心管中，加入2倍体积的无水乙醇。-20℃放置2个小时。4℃，12000rpm离心15分钟。
4)离心后所得沉淀用70％的乙醇清洗2次，每次在4℃，12000rpm离心10分钟。
5)沉淀自然干燥后溶于16μl纯水中。
2、PCR目的片段的扩增和纯化1)PCR扩增体系为25μl，其中包括10×PCR缓冲液 2.5μl2mM dNTP 2.5μl
上游引物(5μM) 2.0μl下游引物(5μM) 2.0μlTaq DNA聚合酶(5u/μl)0.25μl乙肝DNA 16.0μl25.0μl其中10×PCR缓冲液的成分为500mM Tris-CI(pH8.3)，20mM MgCI2、0.75％牛血清白蛋白。
2)PCR扩增采用MJ Research PTC-225PCR扩增仪，程序为94℃ 1.5min 1个循环94℃ 20sec、55℃ 20sec、72℃ 2.5min共计35个循环72℃ 8min 1个循环3)取5μl PCR产物，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测结果。如附图3所示。
4)PCR产物的纯化采用玻璃奶纯化。
3、PCR产物的体外转录荧光标记采用Promega公司T3转录试剂盒，体外转录反应体系为10μl，Cy3-UTP购于安法玛西亚(Amersham Phamacia)公司。具体步骤如下1)T3转录反应包括T3 5×转录缓冲液 2μl100mM的ATP、CTP、GTP 各0.75μl100mM的UTP 0.5μl100mM Cy3-UTP， 0.25μlPCR纯化产物 4μl(5-50ng)T7酶混合物 1μl10μl2)将反应混合物混匀，37℃温育1小时。
3)体外转录得到的RNA经调整浓度，使之溶于30mM的MgCI2溶液，于94℃孵育30分钟从而得到片段化的RNA。
实施例4肽核酸阵列的杂交和检测，信号分析1.肽核酸阵列的杂交1)将1μl片段化标记的RNA稀释到10μl事先预热到杂交温度的经DEPC处理过的肽核酸杂交液中(10mM的磷酸盐缓冲液pH7.0，内含0.1mMNaCI、5mMEDTA、0.1％SDS)，混匀。
2)将上述荧光标记的RNA样品滴到肽核酸芯片探针所在区域的中央，在阵列区域盖上盖玻片。
3)将该玻片放入预热到杂交温度、盛有纯水的湿盒(购于西格玛Sigma公司)中，以避免阵列干燥。
4)将玻片置于杂交炉中，杂交温度为75℃，时间为1.5个小时。
5)杂交结束后将玻片放入10mM的经DEPC处理的磷酸盐缓冲液清洗5分钟。
6)然后放入5mM的经DEPC处理的磷酸盐缓冲液2次。每次5分钟。
7)在室温下，使用平板离心机在800rpm下离心5分钟，将玻片甩干。
2.肽核酸阵列的检测和结果分析杂交后的肽核酸芯片经激光共聚焦扫描仪ScanArray4000扫描探针所在的阵列区域并收集信号，分析检测结果。扫描结果显示阴性对照和点样液对照无荧光信号，阳性对照有荧光信号，根据对比相对应的正常和突变探针的荧光信号强弱来区别该位点是否有突变的发生。附图4是前C区1896、1762与1764联合位点、1862三个位点共计6条肽核酸探针杂交后经激光共聚焦扫描仪Scanarray4000扫描(激光强度为80，PMT增益为80)后的结果图。上排的三个点分别是1896、1762与1764联合位点、1862三个位点的野生探针杂交后扫描结果。下排的三个点是与上排位点相对应的突变探针的杂交后扫描结果。根据荧光信号的强弱，可以断定检测样品的1896与1862位点未发生突变，1762与1764位点由原来的1762A、1764G联合突变为1762T、1764A。
实施例5以玻璃裸片、氨基化玻片或尼龙膜之一为基片的乙肝病毒突变位点的肽核酸检测芯片以玻璃裸片、氨基化玻片或尼龙膜之一为基片的乙肝病毒突变位点的肽核酸检测芯片，玻璃裸片和氨基化玻片的制备如实施例2步骤1玻片的修饰。氨基化和未经化学修饰的裸片、尼龙膜采用杂交液pH7.0的10mM的磷酸盐缓冲液(0.1mMNaCI、5mMEDTA、0.1％SDS)作为点样液。肽核酸探针浓度均为50μM，经点样仪点到相对应的玻片上(肽核酸探针在基片上的分布图见附图2)，点直径为100μm，点间距为300μm。肽核酸阵列的大小为1.6mm×1.6mm。点样后的玻璃裸片、氨基化玻片或尼龙膜，经紫外交联5分钟后可直接用于杂交。乙肝样品DNA的提取、PCR扩增和标记同实施例3，肽核酸阵列的杂交和检测，信号分析见实施例4。
权利要求
1.一种乙型肝炎病毒突变位点的肽核酸检测芯片，包括基片和阵列式分布的肽核酸探针与对照的点涂层，其特征在于，所述的基片是玻璃基片，尼龙膜之一；所述的肽核酸探针与对照的点涂层是指在基片上均匀分布的，含有乙肝前核心抗原区、表面抗原区已知突变位点和野生位点的24条检测探针，2条阳性对照探针，1条阴性对照探针及空白点样液对照。
2.如权利要求1所述的乙型肝炎病毒突变位点的肽核酸检测芯片，其特征在于，所述的基片是未经任何修饰的玻璃裸片、醛基化玻片、氨基化玻片和尼龙膜之一。
3.如权利要求2所述的乙型肝炎病毒突变位点的肽核酸检测芯片，其特征在于，醛基化玻璃片采用饱和碳酸氢钠溶液作为点样液，氨基化、未经任何化学修饰的玻璃裸片和尼龙膜采用杂交液作为点样液。
4.如权利要求1所述的乙型肝炎病毒突变位点的肽核酸检测芯片，其特征在于，所述的肽核酸探针所在阵列与对照的点涂层的大小，可以根据肽核酸探针点的大小，点间距的变化而变化；阵列在基片上的排列和分布数目可以根据待分析样品的数目而变化。
5.如权利要求1或4所述的乙型肝炎病毒突变位点的肽核酸检测芯片，其特征在于，所述的肽核酸探针点直径为100μm，点间距为300μm时，肽核酸探针所在阵列与对应的点涂层大小为1.6mm×1.6mm。
6.如权利要求1所述的乙型肝炎病毒突变位点的肽核酸检测芯片，其特征在于，所述的肽核酸检测探针，包括乙肝表面抗原区已知的5个突变位点546C-T、551A-G、552T-C、585A-C、587G-A；前核心抗原区已知的7个突变位点1896G-A、1762A-T与1764G-A联合突变、1858C-T、1862G-T、1898G-A、1899G-A、1901 G-A；突变位点肽核酸检测探针12条，野生位点肽核酸检测探针12条，合计肽核酸检测探针24条。
7.如权利要求1所述的乙型肝炎病毒突变位点的肽核酸检测芯片，其特征在于，所述的2条阳性肽核酸对照探针，分别源于前核心抗原区和表面抗原区的核酸保守序列。
8.如权利要求1所述的乙型肝炎病毒突变位点的肽核酸检测芯片，其特征在于，所述的阴性肽核酸对照探针源于人ATM基因中的17mer核酸序列。
9.如权利要求1、6或7所述的乙型肝炎病毒突变位点的肽核酸检测芯片，其特征在于，所述的肽核酸探针是长度为14-18mer的肽核酸，均设计在乙肝病毒DNA反义链，其氨基末端连有O-linker，对应着DNA链的3′端。
10.一种如权利要求1所述的乙型肝炎病毒突变位点的肽核酸检测芯片的制备方法，包括(1)肽核酸探针的设计及合成，(2)玻片的修饰与肽核酸探针的固定，(3)乙肝样品DNA的提取、PCR扩增和标记，(4)肽核酸阵列的杂交和检测，信号分析等步骤；其特征在于，PCR扩增区域为2133bp，所采用的上游引物起始于乙肝病毒DNA正义链的1700位点，序列为5′GAGGCATACTTCAAAGACTGT 3，其5′末端连有T3启动子序列ATTAACCCTCACTAAAGGG；下游引物起始于乙肝病毒DNA正义链的601位点，序列为5′GATGGGATGGGAATACA 3′；PCR产物是利用T3启动子，通过体外转录进行荧光标记；转录后得到的单链RNA经片段化后与肽核酸阵列杂交。
全文摘要
本发明公开了一种乙型肝炎病毒突变位点的肽核酸检测芯片及其制备方法，芯片包括基片和阵列式分布的肽核酸探针与对照的点涂层，基片是玻璃基片，尼龙膜之一；肽核酸探针与对照的点涂层是指含有乙肝前核心抗原区和表面抗原区已知突变位点和野生位点的24条检测探针，2条阳性对照探针，1条阴性对照探针及空白点样液对照；乙肝病毒DNA样品的PCR扩增利用带有T3启动子的引物，PCR产物经体外转录进行荧光标记，所得单链RNA经片段化与肽核酸芯片杂交，由杂交信号的强弱来分析突变位点。本芯片同时平行检测乙肝前核心抗原区和表面抗原区已知的突变位点，具有快速、高效、诊断精确的特点。
文档编号C12Q1/68GK1431318SQ0213562
公开日2003年7月23日 申请日期2002年10月14日 优先权日2002年10月14日
发明者韩金祥, 鲁艳芹 申请人:山东省医药生物技术研究中心