专利名称：寡核苷酸芯片及其在乙型肝炎病毒突变位点检测中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因芯片技术领域，具体地是涉及乙肝病毒突变位点的寡核苷酸检测芯片，利用寡核苷酸芯片的固相PCR来检测乙肝病毒突变位点。
根据功能分类，基因芯片可分为分为cDNA芯片和寡核苷酸芯片，前者可用于基因功能的分析。寡核苷酸芯片除了可绘制表达谱外，在高通量测序、临床诊断、疾病耐药性检测、单核苷酸多态性、基因分型等方面具有潜在的优势。例如人线粒体16.6kb基因组多态性的研究、BRCA I外显子11、CFTR基因、ATM基因、HIV-1逆转录酶及蛋白酶基因的突变检测、分枝杆属内不同种的识别及利福酶素抗性检测等。
寡核苷酸芯片识别单核苷酸多态性(SNPs)或单碱基突变可以通过PCR扩增得到的片段与等位特异性的寡核苷酸探针杂交，根据信号的强弱来分析结果。但由于核酸的杂交效率和形成杂合体的热稳定性与核酸的序列、结构关系密切，改变反应条件如温度、杂交严谨度等只能部分改善杂交效率和杂合体的热稳定性。由于该限制性，衍生出许多新方法和新思路。寡核苷酸芯片由最初的固相合成到合成后点样，高密度芯片与低密度芯片同时并存。基于寡核苷酸阵列的微测序、单碱基延伸、固相PCR等也应运而生。
肝炎是世界性传染疾病，我国是公认的肝炎大国，肝炎的患病率和发病率都居世界前列，尤其是乙型肝炎在全国范围内分布最广。肝炎病毒的感染，不仅与急慢、性肝炎，还与肝硬化、肝癌的发生密切相关。乙肝病毒基因不同位点的突变可引起免疫逃避、抗病毒治疗逃避，使得临床检测出现漏检、用药不当，以至延误治疗。传统的乙肝突变检测，通常是通过限制性片段长度多态性分析(RFLP)等各种分子标记、PCR扩增而实现的。它们难以做到对大量样品的同时、平行分析，而且所需样品量大，检测灵敏度低，操作时间长。
本发明总的构思是集寡核苷酸芯片和固相PCR反应于一体。在PCR反应中，鉴于TaqDNA聚合酶在引物的3′末端存在错配时不能正确延伸的特点，将突变位点设计在检测探针的3′末端，然后将其5′末端固定在经过化学修饰的玻璃基片上作为寡核苷酸芯片的探针、固相PCR反应的固相引物，其3′末端游离。设计不同的液相引物，使其与固相引物配对。为确保扩增的效率和准确性，所扩增的PCR区域不超过150bp，荧光标记采用Cy3-dCTP。固相PCR扩增结果的检测采用荧光扫描或是荧光显微镜观察(见附
图1)。
在本发明中，采用了三对液相引物。上游引物3与下游引物3用于扩增包括S区已知突变位点在内的区域。上游引物1与下游引物1用于扩增前C区1762、1764位点联合突变，上游引物2与下游引物2来扩增前C区其它突变位点。液相混合物中的上游引物分别和其相应的反义链上的寡核苷酸检测探针，即固相下游引物配对。液相混合物中的下游引物分别和其相应的正义链上的寡核苷酸探针，即固相上游引物配对。从而扩增出不同长短、包含突变位点信息的带有荧光标记的片段。
本发明中，乙肝每一个突变位点在DNA的正、反义链上分别设计有相应的检测探针，同时还有与检测探针相对应，仅缺少3′末端待检测碱基在内的阳性对照探针。所以，每一突变位点设计有6条寡核苷酸探针，阳性对照探针2条、突变检测探针2条、野生检测探针2条，均分别设计在DNA的正、反义链上。根据阳性对照，如果某一位点的在正、反义链上的突变探针的阳性信号强度远高于野生探针，证明该位点为纯合突变位点M/M；反之为纯合野生位点W/W。如果同一位点在正、反义链上的探针信号强度相近，证明该位点为杂合位点M/W。
本发明的寡核苷酸检测芯片，包括玻璃基片和阵列式分布的寡核苷酸探针与对照的点涂层，所述点涂层是在玻璃基片上阵列式均匀分布的，含有包括乙肝前核心抗原区和表面抗原区已知的12个突变位点和其相对应的野生位点的72条寡核苷酸探针。
上述玻璃基片为硅烷化玻璃载片，或是经过三甲氧基丙基-乙烯亚胺修饰、丁二酸-N-羟化丁二酰亚胺酯活化的玻璃载片。
上述寡核苷酸芯片上的所有探针通过5′末端氨基己烷连接在修饰后的玻片上。
上述寡核苷酸探针所在阵列与对照的点涂层的大小可以根据点的大小，点间距的变化而变化；阵列的排列和分布数量可以根据待分析样品的数目而变化。
上述寡核苷酸探针排列如附图3所示，探针点直径为100μm，点间距为300μm时，肽核酸探针所在阵列与相应的点涂层大小为2.2mm×2.5mm。
上述的72条寡核苷酸探针包含的12个突变位点是，乙肝表面抗原区已知的5个突变位点546C-T、551A-G、552T-C、585A-C、587G-A；前核心抗原区7个已知的突变位点1896G-A、1762A-T与1764G-A联合突变、1858C-T、1862G-T、1898G-A、1899G-A、1901G-A。
上述的72条寡核苷酸探针，每一个待检测位点包括6条探针，突变位点和野生位点的正、反义链探针共计4条。阳性对照探针2条，分别位于正、反义链，它缺少3′末端的待检测碱基。
上述的寡核苷酸探针的长度为14-19mer，Tm值相差不超过10℃，GC碱基百分含量为50％-70％。
本发明寡核苷酸芯片在乙型肝炎病毒突变位点检测中的应用，方法包括(1)乙肝突变位点检测寡核苷酸探针的设计及合成；(2)玻璃基片的修饰和寡核苷酸探针的固定；(3)乙肝样品DNA的提取；(4)固相PCR扩增；(5)寡核苷酸芯片的洗涤和信号检测分析。
上述的固相PCR是在寡核苷酸芯片上进行的；固相引物为寡核苷酸芯片上的探针，液相引物为上游引物1、2、3与下游引物1、2、3的混合物；PCR扩增之中采用Cy3-dCTP荧光掺入标记。
上述的固相PCR扩增中的3对液相引物，分别是用于扩增包括S区已知突变位点在内的区域的上游引物3与下游引物3，用于扩增前C区1762、1764位点联合突变的上游引物1与下游引物1，用于扩增前C区其它突变位点的上游引物2与下游引物2；3对液相引物具体如下
Tm值为解链温度，GC％为鸟嘌呤与胞嘧啶百分含量。
本发明所述的寡核苷酸芯片在乙型肝炎病毒突变位点检测中的应用，具体包括以下步骤1、乙肝突变位点检测寡核苷酸探针的设计及合成采用奥理勾5.0(Oligo5.0)软件来设计探针。检测探针采用寡脱氧核苷酸，长度为14-19mer，每一突变位点的探针包括2条突变检测探针、2条野生检测探针、2条阳性对照探针，分别设计在乙肝DNA的正、反义链。4条检测探针的3′末端最后一个碱基分别为正、反义链上待检测突变位点，2条阳性对照探针缺少3′末端待检测碱基。(附图2为S区546位点探针设计示意图)，所有探针的Tm值按GC百分比计算，在65℃-75℃间。寡核苷酸芯片中所用探针(由上海生工生物工程公司合成)信息见表1。探针的5′端连接有氨基己烷NH2-(CH2)6以与活化的玻璃基片结合。氨基己烷通过polyT15与寡核苷酸探针相连，多聚胸腺嘧啶的加入，可以减少寡核苷酸探针与玻璃基片之间的空间阻遏，利于PCR的进行。2、玻璃基片的修饰和寡核苷酸探针的固定用硅烷化试剂处理干净的空白玻片，得到的硅烷化玻片可以直接用于点样。或是将玻片用1％-3％三甲氧基丙基-乙烯亚胺(95％的乙醇配制)溶液处理玻片1小时，然后用丁二酸-N-羟化丁二酰亚胺酯溶液(用9∶1V/V的DMSODMF配置)处理5个小时。
寡核苷酸探针采用pH9.0的碳酸钠盐缓冲液溶液作为点样液，寡核苷酸探针在基片上的分布原则是每一位点的六条探针为一组，阵列面积可以根据探针的排列以及点、点间距的变化而变化。附图3中，圆圈内的数字与表1中的探针编号一致，该阵列共计8行9列，探针点直径为100μm，点间距为300μm，总面积为2.2mm×2.5mm。1-6、7-12、13-18、19-24、25-30、31-36、37-42、43-48、49-54、55-60、61-66、67-72分别代表乙肝S区待检测位点546、551、552、585、587；前C区待检测位点1896、1762、1764、1858、1862、1898、1899、1901等12组72条寡核苷酸检测探针。每一组的6条探针分左右两排排列，左边的一排从上到下分别是该位点正义链上的阳性对照、野生探针和突变探针；右边的一排从上到下分别是该位点反义链上的阳性对照、野生探针和突变探针。点样后的阵列经水合后直接用于固相PCR扩增。3、乙肝样品DNA的提取取乙肝病人血清20-100μl，加入3倍体积的裂解液剧烈振荡混匀。然后加入等体积的氯仿、异戊醇溶液(24∶1)，混匀后离心。收集上清液，加入2倍体积的无水乙醇于-20℃放置2个小时，离心后所得沉淀用70％的乙醇清洗沉淀2次，自然干燥。4、固相PCR扩增固相PCR扩增中所用的固相引物为固定在阵列上的寡核苷酸探针，相引物为三对上、下游引物的混合物。扩增采用MJ Research PTC-200固相PCR扩增仪，应体系为10μl。
PCR扩增采程序为94℃ 6分钟 1个循环94℃ 15秒、60℃ 30秒、72℃ 45秒，50个循环5、寡核苷酸芯片的洗涤和信号检测分析固相PCR扩增后的寡核苷酸阵列用1×SSC(0.15M NaCI、17mM柠檬酸钠，pH7.0)，内含0.1％的SDS溶液清洗两次。清洗后的寡核苷酸阵列经激光扫描仪扫描或荧光显微镜观察并收集信号，分析检测结果。扫描结果显示如果某一位点的阳性对照有荧光信号，正、反义链的野生探针阳性信号远高于突变探针的信号强度，证明该位点为纯合野生位点W/W。反之为纯合突变位点M/M。如果同一位点在正、反义链的探针信号强度相近，证明该位点为杂合位点M/W。
表1 乙肝前S区与C区突变位点检测探针
其中，每一位点所标出的6条探针的排列次序按序号从低到高分别是正义链的阳性对照探针、野生检测探针和突变检测探针，反义链的阳性对照探针、野生检测探针和突变检测探针。同时，该表中还包含了探针的序列、长度、Tm值和GC百分比等内容。
本发明的优良效果如下1)本发明集固相PCR与寡核苷酸芯片于一体。与传统的突变检测技术，如PCR和RFLP等分子标记技术相比，它可以同时高通量地检测很多突变位点，平行分析多个样品。与常规的基因芯片相比，它直接在芯片上进行PCR扩增，PCR扩增结束后即可直接通过扫描检测结果而不必要经过杂交，从而缩短了检测时间。
2)本发明经多轮PCR扩增后，掺入标记的荧光信号的强度大大增加，使得该检测方法的灵敏度大大提高。
3)对于寡核苷酸芯片检测突变来说，待检测序列自身结构对杂交效率和杂交稳定性都有影响，因而难以实现对大量突变位点的同时检测。本发明利用TaqDNA聚合酶在3′末端存在错配时不能正确延伸的特点来检测突变，而不经过杂交。从而使之适用于高通量突变检测和单核苷酸多态性分析。
4)本发明利用寡核苷酸芯片的固相PCR反应来检测乙型肝炎病毒突变位点，可获得与突变位点相关的临床信息，指导临床用药。
图2是以S区546位点为例的正、反义探针设计示意图。其中，探针1、2、3为正义链上的三条探针，4、5、6为反义链上的三条探针。探针1、4分别为正、反义链上该位点的阳性对照。2、5分别为该位点在正、反义链上的野生型探针，3、6为该位点在正、反义链上的突变型探针。
图3为寡核苷酸探针在玻璃基片上的分布示意图。
其中，1为玻璃基片，2为寡核苷酸探针与对照的点涂层。圆圈内的数字与表1所列出的寡核苷酸探针序号相对应。
图4为利用激光共聚焦扫描仪ScanArray4000扫描(激光强度为80，PMT增益为80)经固相PCR扩增和清洗后的寡核苷酸芯片的结果图。寡核苷酸芯片上分布有乙肝1896和1901位点的12条探针。其中，1和2列是1896位点的6条探针，3和4列是1901位点的6条探针。A1、B1、C1分别是1896位点正义链上的阳性对照，野生位点检测探针和突变位点检测探针；A2、B2、C2分别是1896位点反义链上的阳性对照，野生位点检测探针和突变位点检测探针。1901位点的探针排列如1896位点，3、4列分别为正义链和反义链上的三条探针。
寡核苷酸探针与对照的点涂层2阵列共计8行9列，针点直径为100μm，间距为300μm，总面积为2.2mm×2.5mm。1-6、7-12、13-18、19-24、25-30、31-36、37-42、43-48、49-54、55-60、61-66、67-72分别代表乙肝S区待检测位点516、551、552、585、587；前C区待检测位点1896、1762、1764、1858、1862、1898、1899、1901等12组72条寡核苷酸检测探针。每一组的6条探针分左右两排排列，左边的一排从上到下分别是该位点正义链上的阳性对照、野生探针和突变探针；右边的一排从上到下分别是该位点反义链上的阳性对照、野生探针和突变探针。点样后的阵列经水合后直接用于固相PCR扩增。
固相PCR在寡核苷酸芯片上进行，寡核苷酸探针同时是固相PCR扩增的固相引物，三对液相引物包括了所有待检测突变位点在内的区域，且保证最长的扩增片段不超过150bp。在固相PCR扩增过程中采用Cy-3-dCTP荧光掺入标记。寡核苷酸芯片的固相PCR产物经激光共聚焦扫描仪扫描后分析各突变位点。
实施例2.如实施例1所述的寡核苷酸芯片，所不同的是在玻璃基片1是经过三甲氧基丙基-乙烯亚胺修饰、丁二酸-N-羟化丁二酰亚胺酯活化的玻璃载片。
实施例3.寡核苷酸检测芯片用于乙型肝炎病毒突变位点的检测1.乙肝突变位点检测寡核苷酸探针的设计及合成采用Oligo5.0软件来设计探针。检测探针采用寡脱氧核苷酸，长度为14-19mer，每一突变位点的探针包括2条突变检测探针、2条野生检测探针、2条阳性对照探针，分别设计在乙肝DNA的正、反义链。4条检测探针的3′末端最后一个碱基分别为正、反义链上待检测突变位点，2条阳性对照探针缺少3′末端待检测碱基。(附图2为S区546位点探针设计示意图)所有探针的Tm值按GC百分比计算，在65℃-75℃间。寡核苷酸芯片中所用探针(由上海生工生物工程公司合成)信息见表1。探针的5′端连有氨基己烷NH2-(CH2)6以与活化的玻璃基片结合。氨基己烷通过polyT15与寡核苷酸探针相连，加入多聚胸腺嘧啶，以减少寡核苷酸探针与玻璃基片之间的空间阻遏，利于PCR的进行。2.玻璃基片的表面化学修饰和寡核苷酸探针的固定(1)玻璃基片的表面化学修饰1)将载玻片用1MNaOH浸泡1小时，水洗后再用1MHCI浸泡1小时。纯水充分清洗后用乙醇清洗1次，甩干。
2)室温下将上述玻片用3％的3-氨基丙基三甲氧基硅烷(95％的乙醇溶液配制)、或是3％的三甲氧基丙基-乙烯亚胺(95％的乙醇配制)处理1小时，剧烈振荡。
3)室温下将玻片用95％的乙醇溶液清洗3次，每次5分钟。
4)使用平板离心机，800rpm离心8分钟，甩干玻片。
5)将玻片置于80℃，烘烤1小时。至此得到的3-氨基丙基三甲氧基硅烷硅化的玻璃基片可以直接用于结合寡核苷酸探针，3％的三甲氧基丙基-乙烯亚胺处理的基片继续进行以下处理6)室温下用20mM的丁二酸-N-羟化丁二酰亚胺酯溶液(9∶1V/V的DMSODMF配制)处理5个小时。
7)用乙醇清洗玻片两次，每次5分钟。
8)使用平板离心机，800rpm离心8分钟，甩干玻片。
(2)寡核苷酸探针的固定寡核苷酸探针采用pH9.0的碳酸盐缓冲液作为点样液，探针浓度为50μM。利用卡塔森5500(Cartesian Pixsys5500)点样仪把寡核苷酸探针点到活化的玻璃基片上，阵列的排列如附图3所示，点直径为100μm，点间距为300μm，阵列大小为2.2mm×2.5mm。点样后而得到的寡核苷酸芯片置于含饱和NaCI溶液的湿盒中，室温过夜。然后将玻片浸于150mM的乙醇胺(用100mM的Tris-CI配置，pH值为9.0)溶液，55℃反应20分钟以封闭未反应的丁二酸-N-丁二酰亚胺酯。3.寡核苷酸芯片上的固相PCR(1)乙肝病毒DNA的提取1)取100μl乙肝病人血清，加入3倍体积的裂解液(4M硫氰酸胍、巯基乙醇、0.1MTris-CI，pH7.5)混匀。2)加入等体积的仿、异戊醇溶液(24∶1)，充分混匀。室温下12000rpm离心15分钟。3)小心将上清液移入另一1.5ml离心管中，加入2倍体积的无水乙醇。-20℃放置2个小时。4)4℃，12000rpm离心15分钟。5)离心后所得沉淀用70％的乙醇清洗2次，每次在4℃，12000rpm离心10分钟。6)沉淀自然干燥后溶于5.55μl纯水中。(2)固相PCR扩增采用MJ Research PTC-200固相PCR扩增仪。1)PCR反应体系为10μl，其中包括10×PCR缓冲液1.0μl2mM dATP dGTP dTTP 混合物1.0μl2mM dCTP 0.65μl1mM dCTP 0.7μl3对液相液相引物混合物(5μM) 1.0μlTaq DNA聚合酶(5u/μl)0.1μl乙肝DNA 5.55μl10μl其中10×PCR缓冲液的成分为500mM Tris-CI(pH8.3)、20mM MgCI2、0.75％牛血清蛋白。2)PCR扩增采程序为94℃ 6分钟 1个循环94℃ 15秒、60℃ 30秒、72℃ 45秒， 50个循环4.寡核苷酸芯片的清洗、扫描和结果分析固相PCR扩增后的寡核苷酸阵列用1×SSC，内含0.1％的SDS溶液清洗两次，每次5分钟。清洗后的寡核苷酸阵列经激光共聚焦扫描仪ScanArray4000扫描并收集信号，分析检测结果。图4为根据本发明所提供的具体方法，使用经3-氨基丙基三甲氧基硅烷修饰的玻片固定探针，检测一未知的乙肝病毒DNA1896和1901位点突变的结果图。该寡核苷酸芯片包含了乙肝病毒1896和1901两个位点的12条探针，所用的液相引物为上游引物2和下游引物2。图中的1和2列是1896位点的6条探针，3和4列是1901位点的6条探针。A1、B1、C1分别是1896位点正义链上的阳性对照，野生位点检测探针和突变位点检测探针；A2、B2、C2分别是1896位点反义链上的阳性对照，野生位点检测探针和突变位点检测探针。1901位点的探针排列如1896位点，3、4列分别为正义链和反义链上的三条探针。根据扫描结果和阳性对照探针的荧光强度，1896位点的B1和B2的荧光信号强度均远高于C1和C2，因此该位点为野生纯合。1901位点中C3的荧光强度高于C2，证明1901位点在正义链上存在突变1901G-A。B4的荧光强度要强于C4，1901位点在反义链上不存在突变，所以该位点为野生杂合。
权利要求
1.一种寡核苷酸芯片，包括玻璃基片和阵列式分布的寡核苷酸探针与对照的点涂层，其特征在于所述的点涂层是在玻璃基片上均匀分布的、含有包括乙肝前核心抗原区和表面抗原区已知的12个突变位点和其相对应的野生位点的72条寡核苷酸探针。
2.如权利要求1所述的寡核苷酸芯片，其特征在于，所述的玻璃基片为硅烷化玻璃载片，或者是经过三甲氧基丙基-乙烯亚胺修饰和丁二酸-N-羟化丁二酰亚胺酯活化的玻璃载片。
3.如权利要求1或2所述的寡核苷酸芯片，其特征在于，所述的寡核苷酸探针通过5′末端的氨基己烷连接在修饰后的玻片上。
4.如权利要求1所述的的寡核苷酸检测芯片，其特征在于，所述寡核苷酸探针所在阵列与对照的点涂层的大小，可以根据点的大小，点间距的变化而变化；阵列的排列和分布数量可以根据待分析样品的数目而变化。
5.如权利要求4所述的寡核苷酸检测芯片，其特征在于，所述寡核苷酸探针点直径为100μm，点间距为300μm时，寡核苷酸探针所在阵列与对照点涂层大小为2.2mm×2.5mm。
6.如权利要求1所述的寡核苷酸检片，其特征在于，所述的72条寡核苷酸探针包含的12个突变位点是，乙肝表面抗原区已知的5个突变位点546C-T、551A-G、552T-C、585A-C、587G-A；前核心抗原区7个已知的突变位点18966-A、1762A-T与1764G-A联合突变、1858C-T、1862G-T、1898G-A、1899G-A、1901G-A。
7.如权利要求1或6所述的寡核苷酸芯片，其特征在于，所述的寡核苷酸探针，每一个待检测位点包括6条探针，突变位点和野生位点的正、反义链探针共计4条，阳性对照探针2条，分别位于正、反义链，它缺少3′末端的待检测碱基。
8.如权利要求1或6所述的寡核苷酸芯片，其特征在于，所述的寡核苷酸探针的长度为14-19mer，Tm值相差不超过10℃，GC百分含量为50％-70％。
9.一种权利要求1所述的寡核苷酸芯片在乙型肝炎病毒突变位点检测中的应用，包括(1)乙肝突变位点检测寡核苷酸探针的设计及合成；(2)玻璃基片的修饰和寡核苷酸探针的固定；(3)乙肝样品DNA的提取；(4)固相PCR扩增；(5)寡核苷酸芯片的洗涤和信号检测分析。
10.如权利要求9所述的寡核苷酸芯片在乙型肝炎病毒突变位点检测中的应用，其特征在于，所述的固相PCR是在寡核苷酸芯片上进行的；固相引物同时为寡核苷酸芯片上的探针，液相引物为上游引物1、2、3与下游引物1、2、3的混合物；PCR扩增之中采用Cy3-dCTP荧光掺入标记。
11.如权利要求10所述的寡核苷酸芯片在乙型肝炎病毒突变位点检测中的应用，其特征在于，所述的固相PCR扩增中的3对液相引物，分别是用于扩增包括S区已知突变位点在内的区域的上游引物3与下游引物3，用于扩增前C区1762、1764位点联合突变的上游引物1与下游引物1，用于扩增前C区其它突变位点的上游引物2与下游引物2，3对液相引物具体如下
全文摘要
寡核苷酸芯片及其在乙型肝炎病毒突变位点检测中的应用，属于基因芯片技术领域。本发明的寡核苷酸检测芯片，包括玻璃基片和阵列式分布的寡核苷酸探针与对照的点涂层，所述的寡核苷酸探针共72条，包含有乙肝前核心抗原区和表面抗原区已知的12个突变位点和其相对应的野生位点。以玻璃基片上的寡核苷酸探针作为固相引物，乙肝病毒DNA作为模板，三对液相引物混合后，通过荧光标记的Cy3－dCTP进行固相PCR扩增。根据寡核苷酸芯片上不同位点荧光信号的强弱来分析突变位点。本发明集寡核苷酸芯片和固相PCR于一体，具有快速、高效、准确、平行诊断的特点。
文档编号C12Q1/68GK1431317SQ0213562
公开日2003年7月23日 申请日期2002年10月14日 优先权日2002年10月14日
发明者鲁艳芹, 韩金祥 申请人:山东省医药生物技术研究中心