专利名称：猪黑素皮质素-3受体基因及其单核苷酸多态性检测方法
技术领域：
本发明属于猪的分子生物学技术领域，涉及猪MC3R基因的克隆和测序以及单核苷酸多态性的检测方法。与猪的分子技术育种有关。
背景技术：
黑素皮质素受体是G-蛋白耦联受体(G-protein coupled receptors，GPCRs)超家√√族的成员之一。迄今，人、鼠和鸡的5个MCRs亚型(MC1R-MC5R)已被克隆和鉴定，其组织分布和生物学功能各不相同。
MC3R是5个MCRs中克隆和鉴定最晚的一个受体，人、鼠和鸡的MC3R基因已被克隆和鉴定，分别编码360、323和325个氨基酸。编码人MC3R基因位点被定位在人染色体20q，该位点与控制体重指数(body mass index)，皮下脂肪量和禁食胰岛素水平连锁。最近一个影响雌激素水平的数量性状位点也被定位在该区域，但人们对MC3R功能的认识仍然不太清楚。MC3R可能与不依赖胰岛素肥胖的候选基因受体有关，也许对调节采食行为有重要作用。为了确定MC3R在能量稳态中的作用，Butler等人从鼠基因组中删除绝大多数MC3R基因编码序列，并用敲除MC4R基因鼠作为对照。研究结果表明MC3R-/-(MC3R基因敲除)鼠呈现出独有的代谢综合征，虽然其体重没有明显的增加，但脂肪含量却增加50％到60％，并降低能量消耗。据此，Butler等人认为MC3R可能参与调节能量稳态(Butler AA等.2000，A unique metabolic syndrome causes obesity in the melanocortin-3receptor-deficient mouse.Endocrinology.141(9)3518-21)。Chen等人的研究也发现同野生型鼠比较，4-6月龄MC3R-/-鼠体脂含量增加，瘦肉量降低，饲料效率较高，而体重没有差异；同时缺乏MC3R和MC4R基因鼠，由于MC3R基因缺失，加剧了MC4R基因缺失引起的肥胖(Chen AS等.2000，Inactivation of the mouse melanocortin-3 receptor results inincreased fat mass and reduced lean body mass.Nat Genet.26(1)97-102)。通过高体重和低体重系杂交鸡MC3R基因遗传学分析研究，发现了5个新的单核苷酸多态性，建立了MC3R基因PCR-RFLP分析技术。通过762只F2代鸡分析，该基因多态性与鸡体重(2、4、6、8、和10周龄)和公鸡腹脂存在显著相关，可以作为鸡体重的候选基因(蒋思文等，2002，参考家系鸡黑素皮质素受体3基因多态性与体重关系研究.遗传学报，No.4322～325)。
同人、鼠和鸡研究相比，猪MCRs研究报道很少。1998年，Andersson及其同事报道了MC1R基因突变与外表颜色的关系，通过序列分析揭示了4个等位基因变异(E+、ED、EP、e)。E+控制欧洲野猪毛色，为野生型外表颜色；ED1控制黑色(欧洲大黑猪和梅山猪毛色)；ED2控制黑色有白带(猪的品种为汉普夏)；EP控制白色(猪的品种为大白猪)或白色有黑斑(猪的品种为皮特兰)；e控制红色(猪的品种为杜洛克)(Kijas等，1998，Melanocortin receptor 1(MC1R)mutations and coat color in pigs.Genetics.150(3)1177-85)。Hiendleder等人(1999)用人的MC2R基因作探针，发现了猪MC2R基因基于SacI酶RFLP多态性。MC4R在控制人和鼠采食行为和体重的重要作用阐明，导致了MC4R作为猪重要生产性状候选基因的研究。猪MC4R基因编码332个氨基酸，定位在1号染色体，与微卫星标记S03113和S0082紧密连锁。通过序列比较分析，发现了一个无意义突变位点，并建立了基于TaqI限制性内切酶的PCR-RFLP鉴别猪MC4R基因型方法。通过来自PIC公司5个系商品猪，共1800头分析，显示MC4R基因型与背膘厚、生长率和采食量显著相关，可以作为与肥胖性状相关的候选基因，也可作为人类疾病研究研究的动物模型(Kim等，2000，A missense variant of the porcine melanocortin-4receptor(MC4R)gene is associated with fatness，growth，and feed intake traits.Mamm Genome.11(2)131-5)。Kim等人还报道了猪MC5R基因多态性、连锁和物理图谱。刘桂兰等(2002)采用PCR-RFLP技术，分析了MC4R基因部分片段在猪资源家系群体中的TaqI酶切片段多态性分布。MC4R基因多态性与生长肥育性状、肉质性状、胴体性状的相关性分析的结果表明，MC4R基因型频率在不同品种群体中的分布不同；MC4R基因与猪胸腰椎间膘厚、臀部膘厚、平均背膘、眼肌宽度、眼肌面积、皮率呈显著性相关(刘桂兰等，2002，猪资源家系MC4R基因扫描及其与脂肪性状的相关分析.遗传学报，No.6497～501)。但猪MC3R基因研究尚未见任何报道。
发明内容
本发明的目的在于获得猪MC3R基因(DNA)，通过序列比较分析获得单核苷酸多态性；据此建立适宜的单核苷酸多态性分型方法，为猪采食量和能量稳态的标记辅助选择提供有用的分子标记。
本发明通过以下技术方案实现猪黑素皮质素-3受体(melanocortin-3 receptor，MC3R)基因，它的编码核苷酸序列如SEQ ID No.1和序列表SEQ ID No.2所示。在MC3R基因PCR扩增的核苷酸480位有一个单核苷酸多态性(SNP)。
一种制备猪黑素皮质素-3受体(MC3R)基因的方法，按照以下步骤从猪血液基因组提取DNA，根据人和鼠MC3R基因保守区设计引物，PCR扩增，PCR产物纯化和直接测序，通过序列比较分析获得如序列表SEQ ID No.1和序列表SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。
用于猪MC3R基因SNP分型检测的方法是采用特异等位基因双向PCR扩增(Bi-PASA)步骤。为了实现上述方法，设计了四种引物的DNA序列，它们分别如序列表SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6所示序列表SEQ ID No.3F15’-GCC TTC TGT GAG CAG GTC TTC-3’序列表SEQ ID No.4R15’-GAC GGA GTT GCA CAT GAT GAG-3’序列表SEQ ID No.5F25’-AAG ATG GTC ATC GTG TGC CTT-3’序列表SEQ ID No.6R25’-GGC GAA GAA GAT GAC GAC G-3’猪MC3R基因的克隆和测序，其步骤包括选择中国地方品种血统的梅山猪和外来品种大白猪作为典型试验材料，从猪的血液中提取基因组DNA，根据人和鼠MC3R基因保守区设计了两个外引物(F15’-GCC TTC TGT GAG CAG GTC TTC-3’，R15’-GAC GGA GTT GCA CAT GAT GAG-3’)，PCR扩增，PCR产物纯化和直接测序，序列比较分析。其特征在于获得猪MC3R基因编码区部分DNA序列。其中梅山猪和大白猪MC3R基因DNA序列分别见序列表SEQ ID No.1.和序列表SEQ ID No.2所示。
比较序列表SEQ ID No.1.和序列表SEQ ID No.2的DNA序列，发现了MC3R基因PCR扩增产物的核苷酸480位C→T的SNP位点，据此采用特异等位基因双向PCR扩增(bi-directional PCR amplification of specific alleles，Bi-PASA)方法，建立了MC3R基因SNP多态性检测方法。其特征在于特异外引物和内引物的碱基序列如上所述。
序列表及其说明1、序列表SEQ ID No.1是来源于中国地方猪种血统“梅山猪”克隆的编码核苷酸序列；2、序列表SEQ ID No.2是来源于国外的猪种“大白猪”克隆的编码核苷酸序列；3、序列表SEQ ID No.3是实施MC3R基因SNP多态性检测方法所用特异外引物的核苷酸序列；4、序列表SEQ ID No.4是实施MC3R基因SNP多态性检测方法所用的特异外引物核苷酸序列；5、序列表SEQ ID No.5)是实施MC3R基因SNP多态性检测方法所用的特异内引物核苷酸序；6、序列表SEQ ID No.6是实施MC3R基因SNP多态性检测方法所的特异内引物的核苷酸序列。
附图及其说明
图1是猪和人MC3R基因序列比较；图2猪MC3R基因的部分核苷酸序列和SNP位点。本发明具有以下效果本发明的基因标记和SNP快速检测方法可用于不同猪品种的MC3R基因多态性分析，以及研究基因与猪采食量和能量稳态的关系。
具体实施例方式
实施例1选择中国地方品种梅山猪和外来(国外)品种大白猪作为典型试验材料，采用比较基因组学方法，根据人和鼠MC3R基因保守区设计引物(外引物)。
上游引物F15′-GCC TTC TGT GAG CAG GTC TTC-3′下游引物R15′-GAC GGA GTT GCA CAT GAT GAG-3′PCR反应在含有50ng基因组DNA、15mmol/L Tris-HCl、50mmol/L KCl(pH8.0)、2mmol/L MgCl2，200μmol/L dNTPs、引物F1和R15μmol/L、4％二甲亚砜和0.5 U TaqDNA聚合酶的25μl反应体系中进行，反应条件是95℃5min、35循环(94℃ 45S、60℃45S和72℃ 90S)、72℃延长5min。扩增的PCR产物(783bp)被纯化后直接进行序列测定。DNA序列用SequencherTM3.0软件(Gene Codes Corporation)进行排列和比较，梅山猪和大白猪MC3R基因DNA序列见序列表SEQ ID No.1和序列表SEQ ID No.2。用BLAST软件比较，PCR产物的序列确证PCR产物是MC3R基因，在DNA水平上与对应的人的序列有90％的同源性(见图1)。
实施例2经过DNA序列测定和序列比较分析，在MC3R基因PCR扩增产物的核苷酸480位发现了1个碱基改变(C→T)，即SNP(见图2)在猪的品种梅山猪是C，而大白猪是T。据此，设计特异内引物(F25’-AAG ATG GTC ATC GTG TGC CTT-3’，R25’-GGCGAAGAAGATGACGACG-3’)，与外引物(F15’-GCCTTCTGTGAGCAGGTCTTC-3’，R15’-GACGGAGTTGCACATGATGAG-3’)一起，采用Bi-PASA分析技术进行SNP分型。PCR反应在含有50ng基因组DNA、15mmol/L Tris-HCl、50mmol/L KCl(pH8.0)、2mmol/L MgCl2，200μmol/L dNTPs、外引物F1和R15μmol/L、内引物F2和R22.5μmol/L、4％二甲亚砜和0.5 U Taq DNA聚合酶的25μl反应体系中进行，反应条件是95℃5min、35循环(94℃ 60S、65℃ 60S和72℃ 90S)、72℃延长10min。PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测等位基因1(纯合基因型CC)条带为783和498bp，等位基因2(另一纯合基因型TT)条带为783和324bp；杂合基因型(CT)条带为783、498和324bp。对中国地方品种梅山猪和清平猪，外来(国外)品种大白猪、长白猪和杜洛克猪，以及大白猪×梅山猪杂交猪进行了检测，其基因型和基因频率见表1。
表1 不同品种猪MC3R基因型和基因频率基因型频率(％)基因频率(％)品种样品数CC CT TT C T梅山猪(Meishan)12100 100清平猪(Qingping) 14100 100大白猪(Large White)8 100 100长白猪(Landrace) 10100 100杜洛克猪(Duroc)8 100 .100大白猪×梅山猪 10100 5050
表2 MC3R基因不同基因型对性状的影响性状 基因型CC 基因型CT 基因型TT肩部膘厚3.11±0.072.86±0.25 2.86±0.166-7肋处膘厚 2.45±0.062.25±0.17 2.30±0.17胸腰部膘厚 1.81±0.051.60±0.21 1.71±0.14臀部膘厚1.52±0.051.27±0.20 1.48±0.16平均膘厚1.61±0.041.43±0.15 1.51±0.11眼肌面积30.11±0.49 29.23±1.9629.74±1.10肥肉率 19.05±0.44 18.04±1.7719.20±1.27瘦肉率 57.85±0.37 58.17±1.4056.60±0.89眼肌pH值6.34±0.026.25±.102 6.33±0.06股二头肌pH值6.42±0.026.46±0.06 6.41±0.03头半棘肌pH值6.45±0.026.43±0.05 6.45±0.04系水力 91.29±0.55 87.36±3.7788.62±2.25背最长肌色值21.81±0.35 22.72±1.2423.32±1.26股二头肌色值20.51±0.14 20.72±0.2521.05±0.41肌内脂肪2.46±0.072.28±0.11 2.28±0.133
序列表Organization Applicant----------------------Street狮子山街City武汉State湖北省Country中国PostalCode430070PhoneNumber027-87282038FaxNumber027-87397735EmailAddresszhanghb@mail.hzau.edu.cn<110>OrganizationName华中农业大学Application Project-------------------<120>Title猪黑素皮质素-3受体基因及其单核苷酸多态性检测方法<130>AppFileReference<140>CurrentAppNumber<141>CurrentFilingDate2002-09-04Sequence--------<213>OrganismName猪(Sus Scroft)<400>PreSequenceString1gccttctgtg agcaggtctt catcaagccc gaagtcttcc tggctctggg catcctcagc 60ctgctggaga acgtgctggt catcctggcc gtggccagga acggcaacct gcactcgccc120atgtacctct tcctctgcag cctggccgtg gccgacctgc tggtgagcgt gtccaacgcc180ctggagacca tcatgatcgc cgtggtcaac agcgacgccc tgaccttcga ggaccagttc240gtccagcaca tggacaacgt cttcgactcc atgatctgca tctcgctggt ggcctccatc300tgcaacctct tggccatcgc cgtggacagg tacgtcacca tcttctacgc gctgcgctac360cacagcatca tgaccgtgcg gaaggcgggg gccctgatcg cggccatctg ggtgtgctgc420ggcgtctgcg gcgtggtctt catcgtctac tccgagagca agatggtcat cgtgtgcctc480gtcgtcatct tcttcgccat gctgctcctc atgggcaccc tctacgtgca catgtttctc540ttcgcccggc tgcacgtcca gcgcatcgcc gcgctgccgc ccgccgacgg ggggcccccc600ccgcagcgct cgtgcctgaa gggggccgtg accatctccc tcctgctggg ggtcttcatc660ttctgctggg cccccttctt tctccacctg gttctcatca tcacctgccc cacccacccc720tactgcatct gctacaccgc ccacttcaac acctacctgg tcctcatcat gtgcaactcc780gtc 783<212>TypeDNA<211>Length783SequenceNameSEQ ID No..1SequenceDescriptionFeature-------SequenceSEQ ID No..1<221>FeatureKeyexon<222>LocationFrom1<222>LocationTo783Other InformationCDSJoinNoSequence---------<213>OrganismName猪(Sus scrofa)<400>PreSequenceString2gccttctgtg agcaggtctt catcaagccc gaagtcttcc tggctctggg catcctcagc 60ctgctggaga acgtgctggt catcctggcc gtggccagga acggcaacct gcactcgccc120atgtacctct tcctctgcag cctggccgtg gccgacctgc tggtgagcgt gtccaacgcc180ctggagacca tcatgatcgc cgtggtcaac agcgacgccc tgaccttcga ggaccagttc240gtccagcaca tggacaacgt cttcgactcc atgatctgca tctcgctggt ggcctccatc300tgcaacctct tggccatcgc cgtggacagg tacgtcacca tcttctacgc gctgcgctac360cacagcatca tgaccgtgcg gaaggcgggg gccctgatcg cggccatctg ggtgtgctgc420ggcgtctgcg gcgtggtctt catcgtctac tccgagagca agatggtcat cgtgtgcctt480gtcgtcatct tcttcgccat gctgctcctc atgggcaccc tctacgtgca catgtttctc540ttcgcccggc tgcacgtcca gcgcatcgcc gcgctgccgc ccgccgacgg ggggcccccc600ccgcagcgct cgtgcctgaa gggggccgtg accatctccc tcctgctggg ggtcttcatc660ttctgctggg cccccttctt tctccacctg gttctcatca tcacctgccc cacccacccc720tactgcatct gctacaccgc ccacttcaac acctacctgg tcctcatcat gtgcaactcc780gtc 783<212>TypeDNA<211>Length783SequenceNameSEQ ID No..2SequenceDescriptionFeature-------SequenceSEQ ID No..2<221>FeatureKeyexon<222>LocationFrom1<222>LocationTo783Other InformationCDSJoinNoSequence--------<213>OrganismName猪(Sus Scroft)<400>PreSequenceString3gccttctgtg agcaggtcttc 21<212>TypeDNA<211>Length21SequenceNameSEQ ID No..3SequenceDescriptionFeature--------SequenceSEQ ID No..3<221>FeatureKeyexon<222>LocationFrom1<222>LocationTo21Other InformationCDSJoinNoSequence--------<213>OrganismName猪(Sus Scroft)<400>PreSequenceString4gacggagttg cacatgatga g 21<212>TypeDNA<211>Length21SequenceNameSEQ ID No.4SequenceDescriptionFeature--------SequenceSEQ ID No.4<221>FeatureKeyexon<222>LocationFrom1<222>LocationTo21Other InformationCDSJoinNoSequence--------<213>OrganismName猪(Sus Scroft)<400>PreSequenceString5aagatggtca tcgtgtgcct t 21<212>TypeDNA<211>Length21SequenceNameSEQ ID No.5SequenceDescriptionFeature-------SequenceSEQ ID No.5<221>FeatureKeyexon<222>LocationFrom1<222>LocationTo21Other InformationCDSJoinNoSequence--------<213>OrganismName猪(Sus Scroft)<400>PreSequenceString6ggcgaagaag atgacgacg19<212>TypeDNA<211>Length19SequenceNameSEQ ID No.6SequenceDescriptionFeature-------SequenceSEQ ID No.6<221>FeatureKeyexon<222>LocationFrom1<222>LocationTo19Other InformationCDSJoinNo
权利要求
1.猪黑素皮质素-3受体(MC3R)基因，它的编码核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。
2.根据权利1所述的DNA序列，其特征在于MC3R基因PCR扩增的核苷酸480位有一个单核苷酸多态性(SNP)。
3如权利要求1或2所述的方法，其特征按照以下步骤从猪血液基因组提取DNA，根据人和鼠MC3R基因保守区设计引物，PCR扩增，PCR产物纯化和直接测序，通过序列比较分析获得如序列表SEQ ID No.1和序列表SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于用于猪MC3R基因SNP分型检测的方法是采用特异等位基因双向PCR扩增(Bi-PASA)步骤。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于四种引物的DNA序列分别如序列表SEQID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6所示序列表SEQ ID No.3F15’-GCC TTC TGT GAG CAG GTC TTC-3’序列表SEQ ID No.4R15’-GAC GGA GTT GCA CAT GAT GAG-3’序列表SEQ ID No.5F25’-AAG ATG GTC ATC GTG TGC CTT-3’序列表SEQ ID No.6R25’-GGC GAA GAA GAT GAC GAC G-3’
全文摘要
本发明属于猪分子生物学技术领域，具体涉及猪黑素皮质素－3受体(melanocortin－3 receptor，MC3R)基因及其单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)检测技术领域。其步骤包括从猪血液基因组提取DNA、根据人和鼠MC3R基因保守区设计引物、PCR扩增、PCR产物直接测序、序列比较分析、单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)检测。本发明公开了猪MC3R基因DNA序列和SNP分型的检测技术，为猪的标记辅助育种提供了新的标记。
文档编号C12N15/16GK1480532SQ0213900
公开日2004年3月10日 申请日期2002年9月4日 优先权日2002年9月4日
发明者蒋思文, 彭健, 刘桂兰, 熊远著, 郑嵘 申请人:华中农业大学