专利名称：应用于水稻白叶枯病菌检测的探针和引物序列的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于植物病原细菌检测的核酸序列
背景技术：
水稻白叶枯病是水稻上一种主要的细菌性病害，最早于1884年在日本冈县发现，现已在亚洲、非洲、美洲和澳大利亚等地发生。该病在亚洲为害最为严重，尤其在周年种植水稻的南亚和东南亚地区。我国大部分地区均有发生，一般减产10％-30％，严重可达50％以上。是许多国家的检疫对象。水稻细菌性条斑病亦是水稻上一种重要的细菌性病害，在亚洲广泛分布。在我国部分地区此病发生严重，一般发病轻的减产5％-10％，严重发病可减产20％以上。是我国内检对象。由于细菌性病害一旦发生，目前在农业上还没有有效的防治方法，并且种子带菌是两病重要的初侵染来源与传播途径。因此及早检测发现种子上的病原菌及无症状病害，对于预防及采取相应措施加以防治，指导生产，减少经济损失，有着重要的意义。
水稻白叶枯病的病原为Xanthomonas oryzae pv.oryzae，水稻细菌性条斑病的病原为Xanthomonas oryzae pv.oryzicola，为黄单胞菌属细菌同一种下的不同变种。目前水稻白叶枯病菌检测的最大困难是难以将其与稻细菌性条斑病区分。区分这两种病原的检测鉴定主要依据是其症状特点、寄主范围、致病性、血清学反应、形态、培养、生理生化特性等。这些方法费时费力，需要对病原进行分离纯化，往往因为样品带菌少和分离纯化过程复杂等而失败，从而造成漏检及病菌的扩散。因此生产上迫切需要建立快速、简单、灵敏、准确的检测鉴定这两种病菌的方法。
近年来，PCR技术用于水稻白叶枯病菌的检测已有许多报道，但由于水稻白叶枯病菌与水稻细菌性条斑病菌这两种病原亲缘性极高。这些方法仍无法直接区分鉴别这两种菌，并且所采用的普通PCR过程复杂，需要PCR后处理，易造成污染和假阳性，涉及溴化乙锭等对人体有害物质。
在植物病原细菌的分子诊断中，常被选用的靶基因有16SrRNA基因(16SrDNA)23SrRNA基因(23SrDNA)，16S-23SrRNA间区，IS1113扦入序列等。而水稻白叶枯菌和水稻细菌性条斑病菌两菌的这些基因完全相同，用这些基因根本无法对这两个亲缘关系密切的变种进行检测鉴定。因此我们根据含铁细胞接受子基因序列中两菌的差异性设计了两种特异性的引物和探针。以此引物和探针为基础，利用实时PCR技术对该两种病原和水稻样品进行了检测鉴定。本方法可以快速直接的对白叶枯病菌进行鉴定，而且无需从水稻种子中分离病菌和核酸提取，直接以种子浸出液为模板进行检测。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种快速灵敏准确的检测鉴定并区分水稻白叶枯菌和水稻细菌性条斑病菌的特异性方法。
(1)技术方案为实现本发明的目的，本发明分为以下几个步骤以水稻白叶枯病菌DNA或直接以病原菌作为模板，以引物PSRGF和PSRGR进行PCR扩增，利用引物PSRGF(5′-GAATATCAGCATCGGCAACAG-3′)和PSRGR(5′-TACCGGAGCTGCGCGTT-3′)，扩增含铁细胞接受子基因的保守序列，利用特异性探针Baiprobe(5′-FAM-CATCGCCTGCTCGGCTA CCAGC-TAMRA-3′)对白叶枯菌进行鉴定。杂交温度为60-70℃水稻种子在0.01％Tween 20溶液中4℃过夜，浸泡液直接作模板或16000rpm(16886g)4℃离心20分钟，去上清，沉淀用灭菌双蒸水10μl溶解，取1μl悬浮液作模板进行实时荧光PCR.反应体系10×PCR缓冲液2.5μl，25mmol/LMgCl2 5μl，10mMdATP、dUTP、dGTP、dCTP各0.5μl，20μmol/L引物各0.5μl，20μlmol/L探针1μl，1U/μl UNG酶0.15μl，5U/μl Taq DNA聚合酶0.5μl，模板DNA 1μl，加灭菌双蒸水使总体积为25μl。优化后的退火温度为68℃(2)技术效果能够利用该探针和引物对水稻种子、叶片、植株等样品进行水稻白叶枯和水稻细菌性条斑病菌检测的特异性检测。
(3)实施例模板的制备
按照CTAB抽提法提取植物总DNA，种子在0.01％Tween 20溶液中4℃过夜，浸泡液直接作模板或16000rpm(16886g)4℃离心20分钟，去上清，沉淀用灭菌双蒸水10μl溶解，取1μl悬浮液作模板。
实时荧光PCR检测反应体系10×PCR缓冲液2.5μl，25mmol/LMgCl2 5μl，10mMdATP、dUTP、dGTP、dCTP各0.5μl，20μmol/L引物各0.5μl，20μlmol/L探针1μl，1U/μl UNG酶0.15μl，5U/μl Taq DNA聚合酶0.5μl，模板DNA 1μl，加灭菌双蒸水使总体积为25μl。以水稻条斑病菌及其他属典型菌的DNA作对照。
样品检测将样品放入ABIPRISM7700 96孔反应板上打开SequenceDetection 1.71，设置PCR反应条件，第一个循环为50℃，2min，95℃，10min；后40个循环为94℃，15S；68℃，1min。点击运行，进行PCR反应，1小时56分钟反应结束，保存文件，打开分析软件，仪器自动分析试验结果。给出ΔRn(第n循环时的荧光信号增加值)与循环数图象。
结果分析从荧光信号收集图上可明显看出，Baiprobe探针仅能检测到感染白叶枯菌的种子及白叶枯菌质粒产生增加信号，健叶与水对照均无荧光信号，其他菌亦未检测到荧光信号。说明该探针和引物能准确的区分开白叶枯菌和其他病原菌。
权利要求
1.病原菌鉴定检测用探针和引物，其特征在于利用特定序列的探针和引物对水稻白叶枯病菌进行检测。
2.根据权利要求1的探针和引物，通过基因芯片对水稻白叶枯病菌进行检测。
3.根据权利要求1的检测用探针和引物，通过实时PCR方法对水稻白叶枯病菌进行检测。
4.根据权利要求1的检测用探针和引物，探针为寡核苷酸或肽核酸。
5.根据权利要求1的检测用探针和引物，检测的基因为含铁细胞接受子基因。
6.根据权利要求1的检测用探针和引物，实时PCR检测中，退火温度为60-70℃。
7.根据权利要求1的检测用探针和引物，探针为荧光标记探针。
8.根据权利要求1的检测用探针和引物，引物序列为5′-GAATATCAGCATCGGCAACAG-3′和5′-TACCGGAGCTGCGCGTT-3′，探针序列为5′-FAM-CATCGCCTGCTCGGCTA CCAGC-TAMRA-3′
9.根据权利要求1的检测用探针和引物，扩增序列为GAATATCAGCATCGGCAACAGCGCTCGGTGCCGGGCTATCAACTGCTGGGTGGCACGCAGGTGCCGCGTGATATCGATGTGCATCGCCTGCTCGGCTACCAGCCGTGGGCACGTCCGGTGGAAATGGATTCGCTCAACGCGCAGCTCCGGTA
全文摘要
水稻白叶枯病是水稻上一种主要的细菌性病害，由于其与水稻细菌性条斑病菌亲缘性极高，目前难以直接区分。根据含铁细胞接受子基因序列差异性设计了特异性引物和探针。利用该探针对带菌水稻种子和叶片进行了检测。该探针可以快速直接的对白叶枯病菌进行鉴定，而且无需从水稻种子中分离病菌和核酸提取，直接以种子浸出液为模板进行检测。利用该探针检测特异性强，可以直接鉴定到亚种。
文档编号C12Q1/04GK1524964SQ03105358
公开日2004年9月1日 申请日期2003年2月26日 优先权日2003年2月26日
发明者朱水芳, 廖晓兰, 赵文军 申请人:国家质量检验检疫总局动植物检疫实验所, 国家质量检验检疫总局动植物检疫实验