专利名称：一株特基拉芽孢杆菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，涉及一株特基拉芽孢杆菌及其应用。
背景技术：
芽孢杆菌种类繁多，分布广泛，主要存在于土壤、水、空气以及动物的肠道等处。且胞外酶种类丰富，具有很好的研究前景。由于生长环境的复杂性，芽孢杆菌也会分泌产生纤维素酶，如￠-葡聚糖酶。￠-葡聚糖酶在啤酒酿造中有着广泛的应用在糖化过程中使用^ -葡聚糖酶，可以降低麦汁的粘度，使过滤速度加快，从而降低能耗；另外，在麦汁中加入^ -葡聚糖酶还能减少葡聚糖含量，防止啤酒浑浊，从而提高啤酒 的非生物稳定性。麦类饲料中由于含有较高的￠-葡聚糖，阻碍了饲料中有效成分在动物肠道中的消化吸收，成为一种抗营养因子，并且为致病菌的寄居繁殖提供丰富的营养，会引起畜禽腹泻等问题，在饲料中添加适量的3 -葡聚糖酶将有效解决上述问题，从而提高饲料的利用率。我国为啤酒生产大国，2011年啤酒产量达4610万千升，啤酒产量的不断攀升意味着葡聚糖酶需求量也逐日增加。目前国内使用的酶制剂除少量饲料用酶制剂为国内生产，大部分酶制剂都依赖于进口产品，由于生产技术属于商业机密，这在极大程度上限制了啤酒及饲料工业的发展，发展具有独立知识产权的工业酶制剂技术具有重大意义。分离筛选高产3 -葡聚糖酶的微生物是酶技术的基础，我国地域辽阔，环境状况复杂，造就了丰富的微生物资源，为分离筛选工作的开展提供了多种可能。以分离的一株产￠-葡聚糖酶野生菌为资源，结合育种技术，获得高产3 -葡聚糖酶的工业生产菌株，最终为工业酶制剂的生产提供新的思路与资源。
发明内容
本发明提供了一株特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis) CGX5-1。本发明所提供的特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)CGX5-l,已于2012年3月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CGMCCNo. 5935。本发明提供了一种所述特基拉芽孢杆菌的应用，从培养好的特基拉芽孢杆菌中调取@ -I, 3-1，4-葡聚糖酶基因、酸性、中性及碱性蛋白酶类基因等进行外源表达，构建工业酶制剂的基因工程菌。所述特基拉芽孢杆菌为从马蜂巢穴残片中筛选，其保藏条件如下从生长良好的平板上取I环芽孢杆菌移入LB培养基中，37 °C摇瓶培养15h，取0. 75mL移入盛有0. 25mL无菌40%甘油的甘油管中，放_70°C冰箱保存。所述LB培养基为TryptoneIOg L S Yeast Extract 5g L17Nacl IOg L S pH7. O0发酵培养基为玉米粉40g L—1，豆饼粉61. Ig L—1，大麦粉68.4g L'磷酸氢二钾IgL'氯化钙0. Ig L—1，硫酸镁Ig L—1，高温淀粉酶16 u L/L。所述特基拉芽孢杆菌培养条件为将甘油管保藏的芽孢杆菌接入LB液体培养基，在37°C 200rpm摇瓶培养15h至对数中后期，作为种子液。以2%接种量将种子液转接至发酵培养基中，37°C 200rpm培养，分别于12、24、36、48、60h为取样点，测定样品中￠-1,3-1,4-葡聚糖酶的活力。生物材料保藏本发明所提供的特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequi lensi s)CGX5-l,已于2012年3月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CGMCCNo. 5935。
具体实施例方式实施例I特基拉芽孢杆菌筛选及酶活测定方法从马蜂巢穴的残片中取一定样品加入到30mL无菌生理盐水，玻璃珠打散制成悬浊液，80°C处理lOmin。将悬浊液梯度稀释，涂布于添加2%刚果红的MRS平板，37°C培养箱中培养24h。挑取使刚果红变色圈明显的的单菌落。反复进行平板划线分离，重复三次得到纯化的单菌落，供下一步鉴定用。 鉴定主要通过1)菌落特征观察用肉眼直接观察，挑选菌落直径在1-1. 5mm之间，圆形，表面光滑稍有褶皱，乳白色等符合芽孢杆菌菌落特征的菌株。2)个体形态观察用光学显微镜革兰氏染色观察。挑选革兰氏阳性、有芽孢的菌株。将满足鉴定条件的菌株挑出甘油管保藏。以2%接种量取_70°C甘油贮存液接种于LB培养基中，37°C 200rpm摇瓶培养15h。以2%接种量取37°C 200rpm摇瓶培养物，转接至发酵培养基中37°C 200rpm摇瓶培养36小时。取发酵液离心5min (8000rpm，4°C)得到上清液。将上清液用双蒸水稀释合适倍数，取0. ImL稀释液，加入经40°C预热的蓝色葡聚糖底物(使用前和0. 2M的pH5. 5的醋酸缓冲液等体积混合)，在40°C反应IOmin,每个反应样品中加入3. OmL反应终止液,摇匀后8000rpm离心5min, Icm的比色杯测定清夜在590nm处的吸光值，以0. ImL的双蒸水代替酶液做空白对照。通过测定发酵液中￠-1, 3-1，4-葡聚糖酶的活力，筛选到一株具有较强产^ -I, 3-1，4-葡聚糖酶能力的菌株，通过16SrDNA序列分析可知该菌株为特基拉芽孢杆菌，于2012年3月26日保藏于中国普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo. 5935。实施例2发酵生产P -I, 3-1，4-葡聚糖酶的工艺特基拉芽孢杆菌发酵生产P -I, 3-1，4-葡聚糖酶所使用的培养基分为种子培养基和发酵培养基。其中种子培养基为LB培养基为Tryptone IOg L-1, Yeast Extract 5gL'Nacl IOg L'pI^.O。发酵培养基成分主要有玉米粉40g L—1，豆饼粉61. Ig L-1，大麦粉68.4g L—1，磷酸氢二钾Ig L—1，氯化钙0. Ig L'硫酸镁Ig L—1，高温淀粉酶16UL/L。装液量均为30mL每250mL三角瓶。培养基灭菌条件为121°C，20min。从平板上挑取特基拉芽孢杆菌的单菌落于斜面上活化8h后，从斜面上挑取一环菌接至LB培养基中，37°C 200rpm摇瓶培养15h至对数中后期，作为种子液。以2%接种量将种子液转接至发酵培养基中，37°C 200rpm培养，分别于12、24、36、48、52、56、60h为取样点，测定样品中￠-1, 3-1，4-葡聚糖酶的活力。结果表明，该菌在发酵培养基中生长52h后其发酵液中P -I, 3-1，4-葡聚糖酶酶活达到最高值，为191. 96U/mL。实施例3应用于构建基因工程菌根据NCBI 中 Bacillus amyIoliquefaciens LL3 (NC_017190. I)中 bglS 设计引物克隆其中P -I, 3-1，4-葡聚糖酶基因用于构建表达质粒，表达在提可以使用大肠杆菌系列或毕氏酵母系列，用于高效发酵表达生产P -I, 3-1，4-葡聚糖酶。可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。·
权利要求
1.一株特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)CGX5-l，于2012年3月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 5935。
2.培养权利要求I所述特基拉芽孢杆菌的方法，是在LB培养基或者营养肉汤培养基中摇瓶培养特基拉芽孢杆菌。
3.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于优选pH7. 0 ;优选培养温度37°C。
4.权利要求I所述特基拉芽孢杆菌应用于克隆￠-1,3-1，4-葡聚糖酶基因，构建工业酶制剂的基因工程菌。
5.权利要求I所述特基拉芽孢杆菌应用于发酵生产￠-1,3-1，4-葡聚糖酶。
全文摘要
本发明公开了一株特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)CGX5-1，已于2012年3月26日保藏于中国普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.5935。该菌株具有较高的产β-1,3-1,4-葡聚糖酶能力，将该菌株及其优良基因用于工业酶制剂的生产领域，具有降低产β-1,3-1,4-葡聚糖酶身产成本、提高酶制剂质量的良好前景。
文档编号C12N1/20GK102719379SQ20121019737
公开日2012年10月10日 申请日期2012年6月15日 优先权日2012年6月15日
发明者刘春凤, 刘晓玲, 李崎, 李永仙, 王金晶, 郑飞云 申请人:江南大学