专利名称：人巨细胞病毒荧光定量试剂盒及检测方法
技术领域：
本发明涉及病毒核酸的检测技术领域，更具体涉及一种人巨细胞病毒荧光定量检测试剂盒，同时，本发明还涉及一种人巨细胞病毒荧光定量试剂盒的检测方法，适用于人巨细胞病毒的临床或实验室定量检测，人巨细胞病毒感染的早期诊断，监视和预测巨细胞病毒流行性，以及对疗效进行监测、评估。
背景技术：
HCMV在人群中感染非常普遍，但大多数呈临床非显性感染或潜伏感染，在绝大多数免疫正常个体，常呈无症状感染；但在免疫缺陷个体、胎儿和婴幼儿可出现明显病症。HCMV是引起新生儿先天性感染的重要病原微生物之一。在孕妇，原发或新的HCMV复发感染均可引起新生儿宫内感染或围生期感染，可导致死胎、流产及先天性畸形，智力发育障碍，严重的可引起巨细胞包涵体病。HCMV还会引起器官移植及骨髓移植并发症，并与一些肿瘤的发生相关。因此，早期准确检测HCMV，对防止其传播具有重要意义。
目前HCMV的临床检测主要采用血清学诊断方法，即酶联免疫检测技术(ELISA检测)，可分别检测抗HCMV IgM和抗HCMV IgG，前者阳性结果表明活动性感染，是主要的参考指标，如同时抗HCMV IgG阴性，则表明为原发性感染；后者主要用于了解人群感染情况。ELISA法快速、简单，因此在临床上应用最为广泛。但新生儿免疫保护力低，不产生或滞后产生IgM，易造成假阴性[Yan SS，Fedorko PF.Recent advances in laboratory diagnosis of humancytomegalovirus infection[J].Clin.Applied Immunol Rev.2002，2155-167]，免疫缺陷患者免疫系统不健全，也易造成假阴性。同时受患儿体内IgG和类风湿因子等的干扰，又易造成假阳性。该法检测抗体，时间上具有滞后性，当病患被病原体感染一段时间后产生抗体才能检测到；且该法只能定性，不能定量，因而需要一种更简单、快速、高灵敏度和高特异的检测方法。
另一种CMV感染常用的检测方法是病毒培养法。传统的培养法需7-12天，改良后的方法可在16小时左右获得结果。该法可判定CMV活动性感染，是诊断HCMV感染的标准方法，但周期较长，不适合于快速诊断。
实验室常用的检测方法是PCR法，该法是一种定性检测法，快速、成本低，但由于极易非特异性扩增人类基因组片段，因此假阳性率高，在临床上不易普及。
总之，目前已有巨细胞病毒临床检测方法普遍有假阳性率、假阴性率高，灵敏度低，操作时间长的缺点。
荧光定量PCR(Fluorogenetic Quantitative PCR，FQ-PCR)技术发展出多个分支，可采用外参照定量方法，也可采用内参照定量方法。扩增后产物采用荧光显示，定量方法多样化，算法更为精确。其中最有代表性的有Taqman技术和荧光染料嵌入技术。其它荧光定量PCR技术还有双重标记的序列特异性荧光探针或能量信号转移探针等。
荧光染料嵌入技术利用荧光染料SYBR Green I嵌入双链DNA后荧光强度增加的特性，将荧光信号带入双链DNA，以荧光强度的变化率显示扩增产物的量。优点是广谱适用于所有双链DNA，缺点是特异性不高。
Taqman探针采用双荧光标记技术，其5’端标记报告基团(R)，3’端标记淬灭基团(Q)。其中报告基团与淬灭基团在探针完整的条件下会产生荧光能量转移现象，即报告基团受激发产生的荧光会被淬灭基团完全吸收，表现为报告基团受激发后不能产生荧光的现象。而若PCR扩增过程中有特异靶基因存在，标记探针在退火过程中与目标基因特异性结合，PCR延伸过程中，当引物延伸到探针位置时，Taq酶便以其5’-3’外切酶的活性将探针酶解，从而使5’端的报告基团摆脱了3’端淬灭基团的抑制，恢复荧光特性，其荧光强度随扩增过程而动态增强，据此构成定量体系。在扩增过程中，或扩增完成后，只要通过适当的设备检测产物的荧光强度即可推算出扩增产物的量，实现实时跟踪自动化检测或终点分析PCR检测的目的。
在定量计算的方法上，Martell等将荧光量增至扩增前10倍时所进行的循环数定为CT点[Maril Martell，et al.J Clin Microbiol，1999；37(2)327-332]。PCR条件相同时，模板量越高，CT值越低，CT值与模板量的对数值呈线形关系，依据CT值用已知浓度的DNA或RNA制作标准曲线进行检测。
发明内容
本发明的目的在于提供一种人巨细胞病毒荧光定量试剂盒，该试剂盒准确、灵敏、快速的检测人巨细胞病毒。
本发明的另一个目的在于提供了一种人巨细胞荧光定量试剂盒的检测方法，方法简便，操作时间短，对病毒感染早期准确诊断。
为了达到上述任务，本发明采取以下技术措施一种用于快速检测人巨细胞病毒的荧光定量PCR试剂盒，它包括a)标准阳性模板；b)阴性参控品；c)阳性参控品；d)Taq DNA聚合酶；e)PCR引物和特异性荧光探针；f)荧光定量反应液；g)DNA提取液。
标准阳性模板是含有插入人巨细胞病毒136个核苷酸特异序列的pMD18-T载体质粒。pMD18-T载体购自TaKaRa公司，由该公司经pUC18载体改建而成，是一种高效克隆PCR产物的专用载体，具有同pUC18载体完全相同的功能，且能大大提高PCR产物的连接、克隆效率。将人巨细胞病毒136个碱基克隆到该载体中，转化大肠杆菌DH5α增殖后用碱裂解法提取[具体实验条件和方法见J.萨姆布鲁克等主编，科学出版社，1992，分子克隆实验指南(第二版)]，经DNA纯化试剂盒纯化(购自Clonetec公司)，用分光光度计测A260定量并稀释至1×1010拷贝/μl，-20℃保存。其中，插入的人巨细胞病毒136个碱基序列为1 GACTATCCCT CTGTCCTCAG TAATTGTGGC TGAGAACAGT GATCAGGAAG51 AAAGTGAGCA GAGTGATGAG GAAGAGGAGG AGGGTGCTCA GGAGGAGCGG101 GAGGACACTG TGTCTGTCAA GTCTGAGCCA GTGTCT.
并在其中选择了一对PCR引物，和一条荧光探针，探针位于一对PCR引物之间，荧光聚合酶链式反应液中镁离子在每个反应体系中终浓度为0.2-10mM，Taq酶用量为1-7单位/反应。
阴性参控品是指阴性质控标准品，最好是经确证的阴性血清，也可用无菌双蒸水替代。
阳性参控品是指阳性质控标准品，是人巨细胞病毒AD169株经人胚肺成纤维细胞增殖后的培养物冻干粉，使用前用无菌双蒸水溶解。
荧光聚合酶链式反应液中镁离子在每个反应体系中终浓度为0.2-10mM，Taq酶(购自华美公司)用量为1-7单位/反应。
PCR引物和荧光探针是根据人巨细胞病毒Towne株Major IE基因exon4序列区段设计，上游始于987碱基处，下游终止于1122碱基处1 GACTATCCCT CTGTCCTCAG TAATTGTGGC TGAGAACAGT GATCAGGAAG51 AAAGTGAGCA GAGTGATGAG GAAGAGGAGG AGGGTGCTCA GGAGGAGCGG101 GAGGACACTG TGTCTGTCAA GTCTGAGCCA GTGTCT.
根据上述136碱基序列选择了一对PCR引物和一条荧光探针，荧光探针5’端标记的荧光报告基团是FAM，3’端标记的荧光受体基团为ROX。
在本发明的一个优选方案中，PCR引物序列为引物15’GACTATCCCTCTGTCCTCAGTA 3’，引物25’AGACACTGGCTCAGACTTGA 3’.
在本发明的一个优选方案中，荧光探针为5’cctcatcactctgctcactttcttc 3’.
在本发明的一个优选方案中，荧光定量反应液由PCR 10×buffer 2μl，10μmol/LPCR引物1和引物2各0.5μl，25mmol/L MgCl25μl，2.5mmol/L dNTPs 1.2μl，无菌双蒸水4.1μl组成。
在本发明的一个优选方案中，裂解液包括10mM尿素，6M盐酸胍，10mMTrisHCl(pH4.4)，20％TritonX-100在本发明的一个优选方案中，定量PCR条件为1.95℃ 0-20秒；2.94℃ 15-20秒，50℃ 20-30秒，72℃ 20秒，40循环。
该试剂盒的检测方法包括以下步骤
a、双蒸水溶解阳性参控品；b、使用DNA提取液分别从待测标本、阴性参控品、溶解的阳性参控品中提取人巨细胞病毒核酸；c、分别取步骤b中的核酸、标准阳性模板和双蒸水，加入到含有Taq DNA聚合酶、PCR引物和特异性荧光探针、荧光定量反应液，目的是组成PCR反应体系d、使用荧光定量检测仪对c中的反应体系进行PCR循环检测，目的是测定循环域值；e、通过比较待测样品和标准阳性模板的循环域值而对待测样品的起始拷贝数进行定量，该步骤由仪器自动完成或操作员手动完成。
本发明提供的用于检测人巨细胞病毒的荧光定量PCR检测试剂盒，适用于适用于人巨细胞病毒的临床或实验室定量及定性检测，人巨细胞病毒感染的早期诊断，监视和预测巨细胞病毒流行性，以及对疗效进行监测、评估。
本发明与现有技术相比具有以下优点和效果1、定量准确。与传统的ELISA法、病毒培养法或PCR法等定性方法比较，该试剂盒的优势在于可以准确定量检测病毒核酸。
2、灵敏度及特异性高。由于采用了一对特异性引物和一条特异性探针的“双保险”设计，灵敏度及特异性均较常规法大大提高。应用该技术可比病毒培养法及ELISA法更早检测到病毒感染，甚至在出现临床症状之前即可检测。
3、检测速度快，仅1小时，加上核酸的提取，共仅需3-4小时；4、步骤简单；5、可同时进行高通量的样品检测；具体实施方式
下列实施例中未注明具体实验条件和方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等主编，科学出版社，1992，分子克隆实验指南(第二版)；D.L.斯佩克特等，科学出版社，2001，细胞实验指南；吕鸿声，科学出版社，1982，或接照制造厂商所建议的条件。
实施例1人巨细胞病毒的荧光定量PCR检测试剂盒组成及配制1.PCR引物序列为引物15’GACTATCCCTCTGTCCTCAGTA 3’，22bases引物25’AGACACTGGCTCAGACTTGA3’，20bases2.荧光探针序列为5’cctcatcactctgctcactttcttc 3’，25bases定量PCR扩增片段长136bp。
3.10×PCR buffer50mM Tris-HCl(pH8.0)、250mM KCl、1mg/ml明胶
4.荧光定量反应液(每人份)10×PCR buffer2μldNTPs(2.5mM) 1.2μlMgCl2(25mM) 5μlPCR引物1(10μM) 0.5μlPCR引物2(10μM) 0.5μl双蒸水4.1μl总量 13.3μl5.标准阳性模板的制备实验室细胞增殖HCMV标准株AD169，待出现明显的致细胞病变效应后，提取DNA，选用PCR引物1、引物2进行PCR反应，反应条件为95℃预变性3min；95℃ 15s，50℃ 25s，70℃30s，扩增30个循环；72℃ 7min延伸。将产物克隆到pMD18-T载体(购自TaKaRa公司)，大肠杆菌DH5α中增殖，测序验证。提取质粒，紫外分光光度计定量，稀释至1×1010拷贝/μl，-20℃保存。使用时系列稀释为1×105拷贝/μl、1×104拷贝/μl、1×103拷贝/μl。
6.阴性参控品取HCMV阴性血清，经ELISA测定为阴性，采用引物1、引物2 PCR检查也为阴性。
7.阳性参控品取HCMV阳性血清，经ELISA测定为阳性，采用引物1、引物2 PCR检查也为阳性。
8.DNA提取液1)裂解液10mM尿素，6M盐酸胍，10mMTrisHCl(pH4.4)，20％TritonX-1002)蛋白酶K购自Merk公司，溶解为20mg/ml3)玻璃奶购自Pharmarcia公司4)抑制剂去除液5M盐酸胍，20mM TrisHCl(pH6.6)，加乙醇至36％(V/V)5)洗涤液1mMEDTA，20mM TrisHCl(pH6.6)，加乙醇至70％(V/V)实施例2人巨细胞病毒的荧光定量PCR检测试剂盒检测临床血清其检测步骤如下a、双蒸水溶解阳性参控品；b、使用DNA提取液分别从待测血清标本、阴性参控品、溶解的阳性参控品中提取人巨细胞病毒核酸；DNA提取1)1.5ml离心管加入200μl血清(或阴性参控品，又或阳性参控品)，200μl裂解液及50μl蛋白酶K(20mg/ml)，立即混匀。
2)72℃水浴10分钟。
3)加入玻璃奶10μl，摇匀，室温放置5分钟。
4)30秒最大转速离心，去上清。
5)加入抑制剂去除液500μl，摇匀。
6)30秒最大转速离心，去上清。
7)加入洗液450μl，摇匀。
8)30秒最大转速离心，去上清。
9)重复步骤7)、8)一次。
10)晾干离心管，加入25μl溶解液，摇匀，室温放置5分钟。
11)1分钟最大转速离心，收集上清。
c、分别取步骤b中的核酸、标准阳性模板和双蒸水，加入到含有Taq DNA聚合酶、PCR引物和特异性荧光探针、荧光定量反应液的PCR反应体系；反应体系荧光定量反应液 13.3μl荧光探针(1uM) 1μlTaq酶(3U/μl) 0.7μl处理样本上清/标准阳性模板/双蒸水 5μl总量 20μld、使用荧光定量检测仪对c中的反应体系进行PCR循环检测，测定循环域值；在荧光定量检测仪上设定程序为1.95℃ 0秒，2.94℃ 18秒，50℃ 20秒72℃ 20秒，35cycles；3.40℃0秒。把荧光检测的程序设置在每个循环的第二步结束时进行，检测波长为530nm。将反应管放入荧光定量检测仪开始反应。
e、通过比较待测样品和标准阳性模板的循环域值而对待测样品的起始拷贝数进行定量。定量结果软件计算得出定量结果。根据稀释倍数换算实际结果。
SEQUENCE LISTING<110>武汉大学武汉市儿童医院<120>人巨细胞病毒荧光定量试剂盒及检测方法<130>人巨细胞病毒荧光定量试剂盒及检测方法<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>136<212>DNA<213>人工合成<400>1gactatccct ctgtcctcag taattgtggc tgagaacagt gatcaggaag aaagtgagca60gagtgatgag gaagaggagg agggtgctca ggaggagcgg gaggacactg tgtctgtcaa120gtctgagcca gtgtct136<210>2<211>22<212>DNA<213>人工合成<400>2gactatccct ctgtcctcag ta 22<210>3<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>3agacactggc tcagacttga20<210>4<211>25<212>DNA<213>人工合成
<400>4cctcatcact ctgctcactt tcttc 2权利要求
1.一种人巨细胞病毒荧光定量试剂盒，它由标准阳性模板、阴性参控品、阳性参控品、Taq DNA聚合酶、PCR引物和特异性荧光探针、荧光聚合酶链式反应液、DNA提取液组成，其特征在于所述的待测巨细胞病毒特异性核酸序列为136碱基1 GACTATCCCT CTGTCCTCAG TAATTGTGGC TGAGAACAGT GATCAGGAAG51 AAAGTGAGCA GAGTGATGAG GAAGAGGAGG AGGGTGCTCA GGAGGAGCGG101 GAGGACACTG TGTCTGTCAA GTCTGAGCCA GTGTCT.并在其中选择了一对PCR引物，和一条荧光探针，探针位于一对PCR引物之间，荧光聚合酶链式反应液中镁离子在每个反应体系中终浓度为0.2-10mM，Taq酶用量为1-7单位/反应。
2.根据权利要求1所述的一种人巨细胞病毒荧光定量试剂盒，其特征在于所述的PCR引物序列为引物15’GACTATCCCTCTGTCCTCAGTA 3’，22碱基引物25’AGACACTGGCTCAGACTTGA 3’，20碱基。
3.根据权利要求1所述的一种人巨细胞病毒荧光定量试剂盒，其特征在于所述的荧光探针的序列为5’cctcatcactctgctcactttcttc 3’，25碱基。
4.根据权利要求1所述的一种人巨细胞病毒荧光定量试剂盒，其特征在于标准阳性模板含有插入人巨细胞病毒特异序列的pMD18-T载体质粒，所述的特异性插入序列为136碱基1 GACTATCCCT CTGTCCTCAG TAATTGTGGC TGAGAACAGT GATCAGGAAG51 AAAGTGAGCA GAGTGATGAG GAAGAGGAGG AGGGTGCTCA GGAGGAGCGG101 GAGGACACTG TGTCTGTCAA GTCTGAGCCA GTGTCT.
5.根据权利要求1所述的一种人巨细胞病毒荧光定量试剂盒，其特征在于阴性参控品为HCMV阴性血清。
6.根据权利要求1所述的一种人巨细胞病毒荧光定量试剂盒，其特征在于阳性参控品为巨细胞病毒AD169株细胞培养物冻干粉。
7.根据权利要求1所述的一种人巨细胞病毒荧光定量试剂盒，其特征在于DNA提取液包括I)裂解液尿素，盐酸胍，TrisHCl的pH4.4，TritonX-100；II)蛋白酶K；III)玻璃奶；IV)抑制剂去除液盐酸胍，TrisHCl的pH6.6，加乙醇至36％；V)洗涤液EDTA，TrisHCl的pH6.6，加乙醇至70％。
8.一种利用权利要求1所述的一种人巨细胞病毒荧光定量试剂盒检测方法，包括以下步骤a、双蒸水溶解阳性参控品；b、使用DNA提取液分别从待测标本、阴性参控品、溶解的阳性参控品中提取人巨细胞病毒核酸；c、分别取步骤b中的核酸、标准阳性模板和双蒸水，加入到含有Taq DNA聚合酶、PCR引物和特异性荧光探针、荧光定量反应液的PCR反应体系；d、使用荧光定量检测仪对c中的反应体系进行PCR循环检测，测定循环域值；e、通过比较待测样品和标准阳性模板的循环域值而对待测样品的起始拷贝数进行定量。
全文摘要
本发明公开了一种人巨细胞病毒荧光定量试剂盒及检测方法，该试剂盒包括标准阳性模板、阴性参控品、阳性参控品、Taq DNA聚合酶、PCR引物和特异性荧光探针、荧光聚合酶链式反应液、DNA提取液。该试剂盒从血清中提取人巨细胞病毒DNA，采用一对特异性引物及一条特异性荧光标记探针在定量PCR仪上反应，同时进行定量检测。利用该试剂盒及方法可准确、快速、有效、方便地对人巨细胞病毒进行定性及定量检测，对病毒感染进行早期诊断，监视和预测巨细胞病毒流行性，以及对疗效进行监测、评估。
文档编号C12Q1/68GK1544655SQ20031011138
公开日2004年11月10日 申请日期2003年11月14日 优先权日2003年11月14日
发明者张楚瑜, 邹俊煊, 游上游 申请人:武汉大学, 武汉市儿童医院