专利名称：人呼吸道合胞病毒荧光定量pcr试剂盒及其检测方法
技术领域：
本发明属于病毒核酸的检测技术领域，特别是涉及一种人呼吸道合胞病毒荧光定量PCR试剂盒，同时，本发明还涉及一种荧光定量PCR试剂盒检测人呼吸道合胞病毒的方法，荧光定量PCR是通过实时监控收集PCR体系中的荧光信号，对样品中的初始模板进行定量，可广泛应用于医学、生物学等相应领域。
背景技术：
呼吸道合胞病毒感染是仅次于流行性感冒病毒感染的一种常见的急性呼吸道疾病，如婴幼儿重症肺炎和毛细支气管炎。近年来由于抗生素的广泛应用，细菌性呼吸道感染率降低，使得人的急性呼吸道感染病例中90％以上是由病毒引起，以病毒性肺炎和毛细支气管炎为特征。我国调查资料表明，肺炎是城乡婴幼儿死亡的首要原因，占儿童死亡率的20％。每年45％-50％住院的婴幼儿毛细支气管炎及25％婴幼儿肺炎是由呼吸道合胞病毒直接感染所致。
呼吸道合胞病毒有A和B两个亚型，亚型之间各基因变异比较大，暴发性流行时以某一亚型占优势，具有地域性的特点。流行开始的预兆是住院儿童中毛细支气管炎和肺炎人数大量增多，尤其是小于6个月的婴幼儿占多数。流行期间1岁以内儿童50％被感染。我国很多省、市都有流行报道。在流行季节，医院内的工作人员有60％感染，并携带和传播呼吸道合胞病毒。儿科病房和婴儿室有45％通过医生、护士携带病毒引起感染。幼儿园和家庭也是传播场所之一。
呼吸道合胞病毒通过鼻、眼表面粘膜接触感染，病毒在呼吸道粘膜上皮细胞和巨噬细胞中复制，无病毒血症。易感者为3岁以内的婴幼儿。6周到6个月以内的婴幼儿感染后，25％-40％发展成严重的下呼吸道疾病，其中引起肺炎和支气管炎占5％-40％，毛细支气管炎占50％-90％。婴幼儿是呼吸道合胞病毒感染的高危人群，如为早产儿、新生儿、有先天性心脏病、肺支气管发育异常、免疫缺陷、艾滋病患儿等，病死率增高达37％，平均为3％-5％。值得注意的是出生后1-3周的新生儿、早产儿感染后不表现临床症状，突发性发作成典型的毛细支气管炎，常常误诊，病死率更高。
目前呼吸道合胞病毒的临床检验常用病毒分离培养法、免疫学方法和普通RT-PCR法。病毒分离培养虽有“金色指标”之称，但其技术复杂、费时长(通常需1周)，而且其灵敏度容易受病毒不稳定性的影响，不适合用于早期诊断。免疫学方法虽能达到快速诊断目的，但其灵敏度和特异性变化较大，容易出现假阳性，且某些底物具有致癌作用，使临床应用受到一定限制。普通RT-PCR法只能定性或半定量检测，无法评价治疗方案的效果，且操作步骤繁琐，技术要求高，易造成产物污染，出现假阳性，无法标准化，不利推广。
近年来发展起来的荧光定量PCR(Fluorogenetic Quantitative PCR，FQ-PCR)技术以其灵敏度高、速度快、特异性强等优点，已在病原体的定性检测(McGoldrick A，Lowings J P，Ibata G，et al.A Novel Approach to the Detectlon ofClassical Swine Fever Virus by RT-PCR wih a Fluorogenic Probe(TaoMan)[J].JVirol Methods，1998，72125-135；Bhudevi B，Weinstock D.Fluorogenic RT-PCRassay(TaqMan)for Detection and Classification of Bovine Viral Diarrhea Virus[J].Vet.Microbiol.，2001，831-10)、定量检测(Desire N，Dehee A，Schneider V，etal.Quantification of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Proviral Load by aTaqMan Real-Time PCR Assay[J].J.Clin.Microbiol，2001，391303-1310；MartellM，Gomez J，Esteban JI，et al.High-Throughput Real-Time ReverseTranscription-PCR Quantitation of Hepatitis C Virus RNA[J].J.Clin.Microbiol，1999，37327-332；Kearns AM，Turner AJL，Eltringham GJA，et al.Rapid Detectionand Quantification of CMV DNA in Urine using Lightcycler-based Real-time PCR[J].J.Clin.Virol，2002，24131-134；Florence KP，Glaucia PB，Mireille S，et al.Quantitation of HCV RNA using real-time PCR and fluorimetry[J].J.Virol.Methods，2001，95111-119)、肿瘤基因检测(Gelmini S et al.Clin Chem.1997，43(5)752-758；Bieche I et al.Int J Cancer.1998，78(5)661-666)、免疫分析(Lang R et al.J Immunol Methods.1997，203(2)181-192)、基因表达水平分析(Hirayama Yetal.Blood，1998，92(1)46-52；Shimokama T et al.Biochem Biophys Res Commun，1998，246(1)287-292；Nellemann C，Vinggaard AM，Dalgaard M，et al.Quantification of Antiandrogen Effect Determined by LightCycler Technology[J].Toxicology，2001，16329-38)及其多态性(Ibrahim MS et al.Mol Cell Probes，1997，11(2)143-147)的研究等多个领域得到应用。对感染者体内病毒活性的直接检测和定量研究，不仅对于了解患病程度，预测、评价治疗效果有十分重要意义，同时也使对病毒感染发病机制的研究进入量化阶段，而且对新药的研究与试用等极为重要。国外在相关的这些方面研究很多，但仅停留在实验室研究阶段。经检索尚无检测人呼吸道合胞病毒的荧光定量PCR试剂盒的开发与应用。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种人呼吸道合胞病毒荧光定量PCR试剂盒，能快速、灵敏、准确的检测人呼吸道合胞病毒。
本发明的另一个目的在于提供了一种荧光定量PCR呼吸道合胞病毒检测方法，该方法简便，检测速度快，操作方便安全，省时效率高。
本发明的荧光定量PCR试剂盒在快速定量检测人呼吸道合胞病毒中可广泛应用。
为了解决上述任务，本发明采取以下措施一种快速定量检测人呼吸道合胞病毒的荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒包括(a)RNA提取液，(b)逆转录酶M-MLV(10-1000U每个反应体系)(c)RNA酶抑制剂RNasin(10-100U每个反应体系)，(d)逆转录反应液，(e)标准阳性模板，(f)HotStart Taq DNA聚合酶(1-10U每个反应体系)，(g)荧光定量反应液，(h)标准阴性参控液。该试剂盒中的(a)RNA提取液使用Trizol一步法；(d)逆转录反应液含有引物P1(浓度0.1-10umol/L)5’TTAGCAAAGTCAAGTTGAATGAT 3’，RT5×buffer，dNTPs(浓度0.1-10mmol/L)，灭菌双蒸水；(e)标准阳性模板是含有人呼吸道合胞病毒核衣壳N蛋白基因3’端195个碱基片段SEQ ID NO.1与PGEM-T Easy载体构成的PGEMT195重组质粒，SEQ ID NO.1序列为5’TTAGCAAAGTCAAGTTGAATGATACACTCAACAAAGATCAACTTCTGTCATCCAGCAAATACACCATCCAACGGAGCACAGGAGATAGTATTGATACTCCTAATTATGATGTGCAGAAACACATCAATAAGTTATGTGGCATGTTATTAATCACAGAAGATGCTAATCATAAATTCACTGGGTTAATAGGTATGT 3’，该质粒转化大肠杆菌DH5α增殖后用超纯质粒提取试剂盒提取纯化，用紫外分光光度计测A260定量并稀释至1×107拷贝/uL，-20℃保存，使用前10倍稀释至1×106拷贝数/uL、1×105拷贝数/uL、1×104拷贝数/uL。(g)荧光定量反应液含有引物P1(0.1-10umol/L)5’TTAGCAAAGTCAAGTTGAATGAT 3’，引物P2(0.1-10umol/L)5’ACATACCTATTAACCCAGTGAAT3’和荧光探针FP(0.01-10umol/L)5’FAM-TCATCCAGCAAAT(TAMRA)ACACCATCCAACG 3’，荧光探针5’端标记的荧光报告基团是FAM，5’和3’中间标记有荧光淬灭基团TAMRA，以及MgCl2(0.1-10mmol/L)，dNTPs(0.1-10mmol/L)，灭菌双蒸水(h)标准阴性参控液只含有(f)和(g)。
根据本发明提供的试剂盒，按照荧光定量PCR试剂盒对人呼吸道合胞病毒进行检测的方法，该方法包括下列步骤(1)用(a)RNA提取液从浓缩过的待测标本咳痰抽提液、鼻拭子抽提液或咽拭子抽提液中提取RNA，然后加(b)逆转录酶，(c)RNA酶抑制剂和(d)逆转录反应液将病毒RNA逆转录成cDNA；(2)将(e)标准阳性模板10倍稀释至1×106拷贝数/uL、1×105拷贝数/uL、1×104拷贝数/uL。
(3)分别取第(1)步中的cDNA和第(2)步中稀释好的阳性标准品，加入到含(f)Taq DNA聚合酶和(g)荧光定量反应液的PCR反应体系中与(h)标准阴性参控液一起用荧光定量PCR检测仪进行PCR检测；(4)通过比较待测样品和标准品的循环域值而对待测样品的起始拷贝数进行定量；在定量PCR仪自带软件给出的标准曲线上找出待测样品对应的拷贝数浓度。
在本发明提供检测呼吸道合胞病毒的荧光定量PCR试剂盒中，有一条两端标记有荧光基团和淬灭基团的特异性荧光探针，在探针完整时，两基团在空间结构上距离相互靠近，5’端荧光报告基团产生的荧光因为荧光共振能量转移(FRET)而被3’端淬灭基团淬灭，故体系中没有荧光信号的变化。在PCR退火和延伸过程中，探针与模板特异性结合，随引物的延伸，Taq DNA聚合酶利用其5’→3’外切酶活性对探针进行切割，释放出报告基团，破坏了两基团之间的FRET，从而脱离了3’端荧光淬灭基团的屏蔽，报告基团所释放的荧光可以被内置在定量检测仪内的荧光计检测，荧光量的增加与PCR产物的积累量呈比例关系。对HRSV的定量可通过与标准品的循环域值(Ct，Threshold Cycle)相比较得出。Ct值与起始模数呈一定比例关系，Ct值越小，起始模板数越多，相反，Ct值越大，起始模板数越少。利用阳性梯度标准模板的Ct值制成标准曲线，再根据待测样品的Ct值可准确测出该样品的起始拷贝数。
在本发明提供检测呼吸道合胞病毒的荧光定量PCR试剂盒中，针对呼吸道合胞病毒检测中的特殊性，对不同的靶片段进行反应体系(引物和探针浓度、Mg2+浓度、退火温度等)的优化，并将FQ-PCR技术和定量检测系统相结合，将其用于人呼吸道合胞病毒的定量检测。通过优化方案，反复实验，建立了定量检测HRSV的方法，并研制出人呼吸道合胞病毒定量检测的试剂盒，该试剂盒的灵敏度可在每个反应体系中检出10个病毒粒子。
本发明与现有技术相比，具有下列优点(1)特异性更强，灵敏度更高。由于多使用了一条可与模板互补配对的荧光探针，提高了特异性，而且所设计的引物和探针与HRSV特异性结合，与其他呼吸道病毒无明显的同源性，特异性极高，且适合于检测各种亚型的HRSV(A、B亚型)。另外由自动化仪器收集荧光信号，避免了肉眼判断的主观性，结果可靠，又进一步提高了灵敏度，即使仅存在单个拷贝的目的片段液可得到有效的检测。
(2)全封闭反应，无须PCR后处理，避免污染，保证了结果的可靠可重复。
(3)分析PCR产物的对数期，摒弃常规PCR受多因素干扰的终点分析法，使得定量更准确可靠，而且定量范围可宽达10个数量级。
(4)在线式实时监测荧光，结果客观又直观。
(5)可实现单管双检或多检，还可设计针对性内标，监控模板抽提效率及排除抑制剂干扰。
(6)不接触有毒试剂，操作安全，省时高效。
(7)检测速度快，约需1小时，加上核酸的提取，总共仅需3-4小时。
(8)可以同时进行大批量的样品检测，有利于规模化，自动化。
(9)目前使用最广的荧光定量仪器主要有四种PE公司生产的ABI系列定量检测仪；Roche公司生产的LightCycler定量检测仪；iCycler iQ系统，BioRad公司；Corbett公司的Rotor Gene系统。这四种检测系统均可以用TaqMan类型的探针，从而使得我们所设计的含有TaqMan探针的检测试剂盒能够得到大面积的推广使用。
具体实施例方式
实施例1人呼吸道合胞病毒荧光定量PCR检测试剂盒的配置(1)RNA提取液，M-MLV逆转录酶(200U/uL)，dNTPs(10mM)、HotStart TaqDNA聚合酶(2.5U/uL)、RNA酶抑制剂(40U/uL)、MgCl2(25mM)。
(2)M-MLV 5×Buffer组成50mM Tris-HCl(PH8.3，25℃)、3mM MgCl2、75mM KCl、10mM DDT；(3)荧光PCR 10×Buffer组成200mM KCl、200mM Tris-HCl(PH8.4，25℃)(4)逆转录反应液引物P1 2uL(10umol/L)，M-MLV 5×buffer 4uL，dNTPs3uL(10mmol/L)，灭菌双蒸水9uL。
(5)荧光定量反应液PCR 10×buffer 2uL，P1，P2各0.5uL(10umol/L)，荧光探针FP 1uL(1umol/L)，MgCl22uL(25mmol/L)，dNTPs 0.5uL(10mmol/L)，灭菌双蒸水8uL。
实施例2用荧光定量PCR检测试剂盒检测呼吸道合胞病毒(1)取离心处理过的咳痰抽提液、鼻拭子抽提液或咽拭子抽提液300μl，加入900uLRNA提取液，再加入200ul氯仿，振荡15s，室温孵化10min。4℃ 12000g离心10min，RNA位于上层。将上层更换至新的1.5ml的EP管，加入500ul异丙醇，-20℃下孵化10min，再室温下12000g离心10min。弃上清，加入1ml 75％的乙醇洗RNA沉淀，振荡混匀，4℃12000g离心3min。弃上清，37℃干燥5min。用18uL逆转录反应液溶解沉淀，从而得到病毒RNA。
(2)加入RNA酶抑制剂1uL，M-MLV逆转录酶1uL。42℃ 60min，95℃5min灭活M-MLV逆转录酶，得到的cDNA于4℃保存。
(3)将阳性标准模板10倍稀释为1×106拷贝数/uL、1×105拷贝数/uL、1×104拷贝数/uL。
(4)取荧光定量PCR反应液14.5uL，分别加0.5uL hotstrat TaqDNA聚合酶，再加入第2步所得cDNA和第3步稀释好的阳性标准模板各5uL，另外一管加(h)标准阴性参控液，在荧光定量PCR检测仪(Rotor-Gene)上平行做PCR检测。循环条件为94℃预变性5min；94℃ 20s，55℃ 25s，72℃ 30s，扩增45个循环。在每个循环的第三步结束时进行荧光检测，检测波长为510nm。
(5)循环结束后，运行Rotor Gene PCR检测仪自带软件，读取待检样品拷贝数。
(6)结果为阳性标准模板1×106拷贝数/uL、1×105拷贝数/uL、1×104拷贝数/uL其CT值分别为20.21、23.41、26.61。检测的样品的CT值为33.01，换算为每mL检测样品中含有2.2×103拷贝个病毒粒子。
SEQUENCE LISTING<110>武汉大学武汉市儿童医院<120>人呼吸道合胞病毒荧光定量PCR检测试剂盒及其方法<130>人呼吸道合胞病毒荧光定量PCR检测试剂盒及其方法<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>3212<212>DNA<213>人工合成<400>1gggcgaattg ggcccgacgt cgcatgctcc cggccgccat ggcggccgcg ggaattcgat60tttagcaaag tcaagttgaa tgatacactc aacaaagatc aacttctgtc atccagcaaa120tacaccatcc aacggagcac aggagatagt attgatactc ctaattatga tgtgcagaaa180cacatcaata agttatgtgg catgttatta atcacagaag atgctaatca taaattcact240gggttaatag gtatgtaatc actagtgaat tcgcggccgc ctgcaggtcg accatatggg300agagctccca acgcgttgga tgcatagctt gagtattcta tagtgtcacc taaatagctt360ggcgtaatca tggtcatagc tgtttcctgt gtgaaattgt tatccgctca caattccaca420caacatacga gccggaagca taaagtgtaa agcctggggt gcctaatgag tgagctaact480cacattaatt gcgttgcgct cactgcccgc tttccagtcg ggaaacctgt cgtgccagct540gcattaatga atcggccaac gcgcggggag aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc600ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca660ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg720agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca780taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa840cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc900tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc960gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct1020gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg1080tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag1140gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta1200cggctacact agaagaacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg1260aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt1320tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt1380ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag1440attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat1500ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc1560
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1.一种人呼吸道合胞病毒荧光定量PCR试剂盒，其特征是该试剂盒包括(a)RNA提取液，使用Trizol一步法；(b)逆转录酶M-MLV，使用浓度为10-1000U每个反应体系；(c)RNA酶抑制剂，使用浓度为10-100U每个反应体系；(d)逆转录反应液，使用的引物P1为5’TTAGCAAAGTCAAGTTGAATGAT 3’，使用浓度为0.1-10umol/L，还包括有RT 5×buffer溶液，dNTPs溶液，使用的浓度为0.1-10mmol/L和无菌双蒸水；(e)标准阳性模板，含有人呼吸道合胞病毒核衣壳N蛋白基因3’端195个碱基片段SEQ ID NO.1与PGEM-T Easy载体构成的PGEMT195重组质粒；(f)Hotstart Taq DNA聚合酶，使用浓度为1-10U每个反应体系；(g)荧光定量PCR反应液；(h)标准阴性参控液，即无模板荧光定量反应液，由(f)和(g)组成。
2.根据权利要求1所述的一种人呼吸道合胞病毒荧光定量PCR试剂盒，其特征是荧光定量PCR反应液中引物P1为5’TTAGCAAAGTCAAGTTGAATGAT 3’，使用浓度为0.1-10umol/L，引物P2为5’ACATACCTATTAACCCAGTGAAT3’，使用浓度为0.1-10umol/L，荧光探针FP为5’FAM-TCATCCAGCAAAT(TAMRA)ACACCATCCAACG 3’，使用浓度为0.01-10umol/L，荧光探针5’端标记的荧光报告基团，5’与3’端之间或者3’末端标记荧光淬灭基团，以及PCR 10×buffer溶液，MgCl2的使用浓度为0.1-10mmol/L。
3.根据权利要求1所述的一种人呼吸道合胞病毒荧光定量PCR试剂盒，其特征是PGEMT195重组质粒的序列为5’GGGCGAATTGGGCCCGACGTCGCATGCTCCCGGCCGCCATGGCGGCCGCGGGAATTCGATTTTAGCAAAGTCAAGTTGAATGATACACTCAACAAAGATCAACTTCTGTCATCCAGCAAATACACCATCCAACGGAGCACAGGAGATAGTATTGATACTCCTAATTATGATGTGCAGAAACACATCAATAAGTTATGTGGCATGTTATTAATCACAGAAGATGCTAATCATAAATTCACTGGGTTAATAGGTATGTAATCACTAGTGAATTCGCGGCCGCCTGCAGGTCGACCATATGGGAGAGCTCCCAACGCGTTGGATGCATAGCTTGAGTATTCTATAGTGTCACCTAAATAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGAAATTGTAAGCGTTAATATTTTGTTAAAATTCGCGTTAAATTTTTGTTAAATCAGCTCATTTTTTAACCAATAGGCCGAAATCGGCAAAATCCCTTATAAATCAAAAGAATAGACCGAGATAGGGTTGAGTGTTGTTCCAGTTTGGAACAAGAGTCCACTATTAAAGAACGTGGACTCCAACGTCAAAGGGCGAAAAACCGTCTATCAGGGCGATGGCCCACTACGTGAACCATCACCCTAATCAAGTTTTTTGGGGTCGAGGTGCCGTAAAGCACTAAATCGGAACCCTAAAGGGAGCCCCCGATTTAGAGCTTGACGGGGAAAGCCGGCGAACGTGGCGAGAAAGGAAGGGAAGAAAGCGAAAGGAGCGGGCGCTAGGGCGCTGGCAAGTGTAGCGGTCACGCTGCGCGTAACCACCACACCCGCCGCGCTTAATGCGCCGCTACAGGGCGCGTCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATA3’共3212bp，其中下划线代表的序列为SEQ ID NO.1(共195bp)。
4.利用权利要求1所述的一种人呼吸道合胞病毒荧光定量PCR试剂盒的检测方法，该方法包括下列步骤(1)用RNA提取液从浓缩过的待测标本咳痰抽提液、鼻拭子抽提液或咽拭子抽提液中提取RNA，然后加逆转录酶，RNA酶抑制剂和逆转录反应液将病毒RNA逆转录成cDNA；(2)将标准阳性模板10倍稀释至1×106拷贝数/uL、1×105拷贝数/uL、1×104拷贝数/uL；(3)分别取第(1)步中的cDNA和第(2)步中的阳性标准品，加入到含Taq DNA聚合酶和荧光定量反应液的PCR反应体系中与标准阴性参控液一起用荧光定量PCR检测仪进行PCR检测；(4)通过比较待测样品和标准品的循环域值而对待测样品的起始拷贝数进行定量，在荧光定量PCR仪自带软件生成的标准曲线上找出待测样品对应的拷贝数浓度。
全文摘要
本发明公开了一种人呼吸道合胞病毒(HumanRespiratory Syncytial Virus，HRSV)荧光定量PCR试剂盒及其检测方法，该试剂盒包括RNA提取液、逆转录酶、RNA酶抑制剂、逆转录反应液、标准阳性模板、Taq DNA聚合酶、荧光定量反应液和标准阴性参控液。利用该试剂盒，首先提取待测样品中病毒总RNA，逆转录成cDNA，然后与标准阳性模板一起作荧光定量PCR，根据荧光定量PCR仪器所带的软件计算出待测样品中呼吸道合胞病毒的起始浓度。本发明检测速度快，操作方便安全，省时效率高，可有效的对婴幼儿及成人病毒性呼吸道感染患者进行病毒RNA的检测，从而达到了早期诊断和有效预防呼吸道合胞病毒感染。
文档编号C12Q1/68GK1544656SQ20031011138
公开日2004年11月10日 申请日期2003年11月14日 优先权日2003年11月14日
发明者张楚瑜, 张其威, 游上游 申请人:武汉大学, 武汉市儿童医院