专利名称：一种禽流感预防用病毒株及其动物感染模型的制作方法
技术领域：
本发明涉及涉及微生物领域，特别是一种禽流感预防用病毒株及其动物感染模型。
背景技术：
禽流感是由正粘科A型病毒引起的禽类呼吸道传染病。禽流感病毒变异频繁，血清亚型众多，包括H1-H15，N1-N9，几乎感染所有的鸟类。
禽流感于1878年首次发现于意大利，自报道100多年来，目前已遍布于世界上许多国家和地区，给养禽业造成了巨大的经济损失。在香港1997年3～5月间引起的一次3个鸡场的禽流感暴发流行中，鸡的死亡率达70％～100％，仅销毁鸡就损失6000余万元。这些流感病毒基因变异可能导致其传给人类。在1997年暴发的香港禽流感中，H5N1亚型流感病毒曾导致6位香港居民死亡。揭示禽流感病毒可能跨越种属障碍而直接由鸟类传给人。由于人类并不具备对这些病毒的免疫力，因此这类流感病毒致病力高，可在人群中传播。人类应该加强对动物病毒的监测和预防。大多禽流感病毒株对鸟类的发病率高，致死性低，有时不表现症状，这使得病毒广泛传播。但高致病性的病毒死亡率达100％，一般为H5和H7型，绝大多数病毒也是温和的。哺乳类感染禽流感通常不表现临床特征，这对分离病毒，控制病情的发展提出了难题。而高致病性的禽流感H5N1型病毒致死率高，鸡胚甚至不能扩增，选作病毒株是不合适的，而且需要P3实验条件。
目前预防禽流感还没有理想的疫苗，现有的疫苗有弱毒疫苗，灭活油乳佐剂疫苗和病毒载体疫苗。弱毒疫苗虽很快产生免疫保护作用，但培育众多亚型且遗传不稳定的禽流感弱毒株并非易事，还存在着弱毒变强毒的重组可能性。灭活油乳佐剂疫苗安全性好，无重组危险性，但用油乳佐剂后，鸡40天内不能供应，而且免疫方式需要较大的劳动力，还有可能影响免疫检测。禽流感痘病毒载体疫苗通过穿刺注射免疫，强毒攻击后仍能感染并排毒。禽流感DNA疫苗作为一种新型的疫苗，突出优点是抗原蛋白由细胞内部合成，可通过MHC-I和MHC-II类分子直接提呈给免疫系统，与病毒自然感染相似，不但可诱导体液免疫，还可诱导相应的细胞免疫，既克服了灭活疫苗和普通的亚单位疫苗的缺点，同时又避免了弱毒苗潜在的危险性和重组病毒疫苗的免疫原复杂性。更令人感兴趣的是DNA疫苗抗原在机体内的有效表达至少可以持续180d(DankoI，1994)。预防人类的禽流感病毒和禽类的禽流感，需要分离和选择禽流感实验病毒株以及疫苗生产的病毒株，研究疫苗这对预防下一次禽流感的流行起着至关重要的作用。禽流感几乎感染所有的鸟类，分离病毒时，一般采集鸡、鸭的泄殖腔棉拭子，然后鸡胚接种分离鉴定。
禽流感的预防传统的观点模型选择肯定是禽类，而且也广泛应用来研究高致病性的H5N1病毒的感染和预防，但禽类模型存在个体大，养殖困难，实验需要人手多，个体差异太大，免疫系统不成熟等缺点。自从1997年香港发生了禽流感直接由禽类传给人之后，科学家们一直在寻找哺乳类动物模型，这对控制禽流感在人类传播意义非凡。遗憾的是一般的禽流感病毒对哺乳类是温和的，通常不表现临床特征，甚至对鸟类的致病性也不强。而高致病性的禽流感H5N1型病毒致死率高，需要特定的实验条件(P3实验室)培养和实验。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种禽流感预防用病毒株，并且为预防人类禽流感提供一种哺乳动物模型。
本发明所采用的技术方案如下禽流感预防用病毒株由鸡场泄殖腔拭子分离，在10日龄鸡胚中扩增得到，具体步骤包括a.分离禽流感病毒株为鸡场采集泄殖腔拭子，放入1ml PBS+0.1％BSA+120mg/l的卡那霉素溶液中，充分混合，取出拭子拧干；病料-80℃冻存备用。
b.病料接种10日龄鸡胚，80-96小时后收集尿囊液，尿囊液病毒分装-80℃冻存备用。
c.提取从尿囊液病毒中提取病毒RNA，再经逆转录反应得到单链cDNA。
d.扩增以单链cDNA为模板，对HA和NA基因进行PCR扩增，得到禽流感预防用病毒株H9N2。
e.鉴定将禽流感预防用病毒株由血清学鉴定，再经AB公司377 DNA测序仪测序确定。
禽流感预防用病毒株的动物感染模型它是一种禽流感预防用病毒株的小鼠感染模型。该模型是用禽流感预防用病毒株H9N2或H5N1，攻击6～8周龄小鼠，使之感染而建立的，本模型用于在禽类传播的禽流感疫苗，或用于控制禽流感在人类传播的禽流感疫苗的研究或药物评价。
本发明同现有技术相比，具有以下主要优点其一.用此病毒株攻击小鼠，攻击后小鼠有耸毛、体重丢失等症状，传代症状更明显。
其二.可作为禽流感疫苗候选株。
其三.可评价灭活疫苗、DNA疫苗免疫保护效果。
其四.具有明显的应用前景选择BALB/C小鼠做模型，使禽流感病毒株成为小鼠的适应株，对禽流感疫苗的开发有重要作用。对评价疫苗的效果提供了不同的选择。对开发人类禽流感疫苗提供了一条有希望的途径。
其五.工艺简单，操作方便，利于推广。
附图是用ELISA法检测小鼠血清中IgG抗体的效果示意图。
具体实施例方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步说明。
一.禽流感预防用病毒株禽流感预防用病毒株是禽流感预防用病毒株H9N2或H5N1。
禽流感病毒株为鸡场采集泄殖腔拭子，放入1ml PBS+0.1％BSA+120mg/l的卡那霉素溶液中，充分混合，取出拭子拧干。病料-80℃冻存备用。病料接种10日龄鸡胚，96小时后收集尿囊液，血凝实验表明病毒滴度为210。尿囊液病毒分装-80℃冻存备用。病毒经血清学鉴定为禽流感H9N2型。病毒RNA是从在10日龄鸡胚中增殖得到的病毒中提取。RNA经逆转录反应得到单链cDNA。以cDNA为模板，对HA和NA基因进行PCR扩增。经ABI公司377DNA测序仪证实有99％的同源性。
二.禽流感预防用病毒株的动物模型1.禽流感预防用病毒株的动物模型是一种禽流感预防用病毒株的小鼠感染模型。
它是从鸡场分离的禽流感病毒H9N2作为病毒株，用其攻击6～8周龄BALA/C小鼠，使之感染而建立起来的。攻击后小鼠有耸毛、体重丢失等症状。传代症状更明显，三代后攻毒小鼠死亡。肺部病毒经鸡胚扩增证实为禽流感病毒。实验结果证明，该模型可用于控制禽流感在禽类传播的禽流感疫苗，或用于控制禽流感在人类传播的流感疫苗。
2.禽流感小鼠模型的建立方法选择6-8周BALB/C小鼠。腹腔注射麻醉药(盐酸氯胺酮、盐酸洛贝林混合物)使小鼠全身麻醉，H9N2病毒滴鼻攻击小鼠15只，攻击三天后小鼠出现耸毛症状，体重下降10.5％，攻击五天后，5只小鼠用氯仿麻醉小鼠，从心脏采血。使小鼠背卧于实验桌面，在剑状软骨下方微偏左处以15～20度角插入注射器针头，缓慢的抽取心血直至血流停止。收集的血液置于室温1小时左右。凝固后析出血清。8000转/分离心10分钟。在无菌条件下吸出血清，-20度冰箱保存。取出小鼠的气管和肺，PBS(含0.1％BSA)注洗三次。漂洗液离心去细胞碎片用于攻击下一代小鼠。另5只小鼠取出气管和肺用15％的福尔马林保存，-80℃冻存用于电镜观察病毒颗粒。第一代小鼠攻击后三天体重丢失为10.5％，第二代小鼠攻击三天后体重丢失为11.4％，第三代小鼠攻击三天后体重丢失为14.3％，第四代小鼠攻击三天后体重丢失为12.6％。第二代小鼠攻击后10天有40％的死亡，第三代和第四代小鼠攻击后7-10天内全部死亡。至此，禽流感病毒株H9N2可作为小鼠的攻毒株，建立一种禽流感哺乳动物模型。
还有5只小鼠于攻毒后10天，20天尾部取血，凝固后析出血清。8000转/分离心10分钟。在无菌条件下吸出血清，-20度冰箱保存。用酶联免疫吸附实验(ELISA)测H9N2型HA特异性IgG抗体。用10μg/mL的灭活疫苗包被96孔酶标板，37℃2小时；PBS-T(1升溶液中含有NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na2HPO41.15g，KH2PO40.2g，Tween-20 0.454ml)洗三次后加入封闭液(1升溶液中含有NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na2HPO41.15g，KH2PO40.2g，1g牛血清白蛋白)，4℃过夜。用封闭液以2的倍数稀释抗血清后，加入酶标板，37℃温育1小时。PBS-T洗三次后，加入用生物素(Biotin)标记的山羊抗鼠IgG二抗(γ-chain specific，Southern Biotechnology Associates，Inc.USA)，37℃温育1小时，。PBS-T洗三次后，加入碱性磷酸酶标记的链菌蛋白(Southern Biotechnology Associates，Inc.USA)，37℃温育1小时。最后，PBS-T洗三次后，加入10mg/ml PNPP(Southern Biotechnology Associates，Inc.USA)显色。在30分钟内，用酶标仪(Labsystems Multiskan Ascent芬兰产)利用双波长(414nm-405nm)测出OD值，最终确定抗体IgG的最高稀释度，以此来确定抗体量的高低。
用血凝抑制(Hemagglutinin inhibition)实验测HI抗体。按照常规方法进行。生理盐水为0.09gNaCl溶于100ml的纯水中，高压灭菌-4℃保存。2％的柠檬酸钠为2g柠檬酸钠溶于100ml的纯水中，高压灭菌-4℃保存。1％的鸡红细胞为健康三黄公鸡静脉取血，按血液，2％的柠檬酸钠4∶1混合，用前加50倍生理盐水漂洗三次，2000转/分钟离心去上清，配成1％的红细胞-4℃保存备用。对照和样品血清用生理盐水按1∶12.5，1∶25，1∶50，1∶100，1∶200，1∶400，1∶800，1∶1600稀释，在96孔-V血凝反应板每个样品五个样，每孔20ul样品+20ul病毒(H9病毒10-2稀释)静置1小时后加40ul 1％的鸡红细胞，放37度1小时后观察结果。HI抗体的滴度用完全抑制病毒的最高稀释度来表示。
3.实验结果(1)用ELISA法测血清中的IgG抗体，其结果是攻击后10天，20天产生了高滴度的针对H9 HA的IgG抗体(见附图)。图中横坐标第一组为对照组，第二组为实验组(攻击后20天)。纵坐标为1∶32倍稀释血清的针对HA的IgG抗体量，小鼠攻击后20天的抗体量与对照组相比有明显的升高。
(2)用血凝抑制(Hemagglutinin inhibition)实验测HI抗体，第一代小鼠攻毒后20天的HI抗体与对照相比，有所上升第一组为对照组，第二组为实验组(攻击后20天)。对照抑制病毒的最高稀释度是1∶200，第一代小鼠攻毒后20天的抑制病毒的最高稀释度为1∶800。
总之，用禽流感病毒株攻击小鼠，攻击后小鼠有耸毛、体重丢失等症状。传代症状更明显。经鸡胚扩增证实为禽流感病毒。实验结果证明该病毒株可作为禽流感疫苗候选株，以此病毒株评价灭活疫苗、DNA疫苗免疫保护效果。
权利要求
1.一种禽流感预防用病毒株，其特征在于所述的禽流感预防用病毒株，由鸡场泄殖腔拭子分离，在10日龄鸡胚中扩增得到，具体步骤包括a.分离禽流感病毒株为鸡场采集泄殖腔拭子，放入1ml PBS+0.1％BSA+120mg/l的卡那霉素溶液中，充分混合，取出拭子拧干；病料-80℃冻存备用，b.病料接种10日龄鸡胚，80-96小时后收集尿囊液，尿囊液病毒分装-80℃冻存备用，c.提取从尿囊液病毒中提取病毒RNA，再经逆转录反应得到单链cDNA，d.扩增以单链cDNA为模板，对HA和NA基因进行PCR扩增，得到禽流感预防用病毒株H9N2，e.鉴定将禽流感预防用病毒株由血清学鉴定，再经AB公司377 DNA测序仪测序确定。
2.根据权利要求1所述的禽流感预防用病毒株，其特征在于所述的禽流感病毒株是禽流感预防用病毒株H9N2，或禽流感预防用病毒株H5N1。
3.一种禽流感预防用病毒株的动物感染模型，其特征是一种禽流感预防用病毒株的小鼠感染模型，它是用禽流感预防用病毒株H9N2或H5N1，攻击6～8周龄小鼠，使之感染而建立的，该模型用于在禽类传播的禽流感疫苗，或用于控制禽流感在人类传播的禽流感疫苗的研究或药物评价。
4.根据权利要求3所述的禽流感预防用病毒株的动物感染模型，其特征在于禽流感小鼠模型的建立步骤包括a.用腹腔注射麻醉药盐酸氯胺酮或盐酸洛贝林混合物，使实验小鼠全身麻醉，H9N2或H5N1病毒滴鼻攻击小鼠若干只，b.攻击五天后，用氯仿麻醉5只小鼠，取出小鼠的气管和肺，再用含0.1％BSA的PBS注洗三次，c.漂洗液离心去细胞碎片用于攻击下一代小鼠，d.取出另外5只小鼠气管和肺，用15％的福尔马林保存，-80℃冻存，用于电镜观察病毒颗粒，e.观察第一代、第二代、第三代和第四代小鼠受到攻击三天后的体重丢失情况，f.继续观察攻击10天后，有40％的第二代小鼠死亡；攻击7-10天内，第三代和第四代小鼠全部死亡，g.至此，禽流感病毒株H9N2或H5N1作为小鼠的攻毒株，已形成一种禽流感哺乳动物模型。
5.根据权利要求4所述的禽流感预防用病毒株的动物感染模型，其特征在于实验小鼠采用BALB/C小鼠。
全文摘要
本发明是一种禽流感预防用病毒株及其动物感染模型。本发明包括禽流感病毒株的分离、鉴定、扩增，得到禽流感预防用病毒株；还包括建立了一种禽流感预防用病毒株的小鼠感染模型，它是用禽流感预防用病毒株H9N2或H5N1，攻击6～8周龄小鼠，使之感染而建立的，该模型用于在禽类传播的禽流感疫苗，或用于控制禽流感在人类传播的禽流感疫苗的研究或药物评价。本发明提供的病毒株可作为禽流感疫苗候选株，提供的哺乳动物模型具有明显的应用前景，为评价各种疫苗的有效性提供了一种新方法，为人类禽流感疫苗提供了一条有希望的途径。
文档编号C12Q1/70GK1618956SQ200310111418
公开日2005年5月25日 申请日期2003年11月20日 优先权日2003年11月20日
发明者陈则 申请人:中国科学院武汉病毒研究所