专利名称：一种漆酶及其生产方法与专用生产菌株的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物发酵工业领域，特别是涉及一种生产漆酶的方法及其专用菌株。
背景技术：
漆酶(p-diphenol oxygen oxidoreductase，EC 1.10.3.2.)是一种蓝色、含有多个铜离子的酚氧化酶，能催化酚类物质的氧化还原反应，其反应底物包括酚类及其衍生物、芳胺及其衍生物、芳香羧酸及其衍生物等。目前通过不断研究，漆酶可氧化的非酚底物范围还在不断扩大。漆酶可降解木质素中的酚类和非酚类结构，在木质素的生物降解中发挥着重要的作用，也可以用于降解芳香族化合物。漆酶还能使木素类多酚物质以游离基方式进行氧化聚合，可以替代传统木材工业所应用的合成树脂胶粘剂或其它化学品，用这种无污染的酶学方法取代污染严重的化学方法，可以把污染消除在源头。因此，漆酶在生物技术和环境保护方面有着巨大的应用潜力。
白腐菌能够产生漆酶、木质素过氧化物酶(LiP)和锰氧化物酶(MnP)等，是目前能够将木质素彻底降解为二氧化碳和水的唯一生物。其产生的漆酶比木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶热稳定性更好。因此，这一生物类群引起了世界生物学家的极大兴趣。白腐菌中的血红密孔菌被认为是研究漆酶的理想菌株，然而现有国内已知菌株的漆酶酶活力都较低，最高达到21U/ml。
发明内容
本发明的目的是提供一株产漆酶的血红密孔菌。
本发明所提供的血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus)mk528已于2004年03月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC № 1124。
该血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus)mk528 CGMCC № 1124是从血红密孔菌G5分离获得的，其在固体培养基上的生长状况如图1所示，菌丝细胞的Giemsa染色如图2所示。该菌株与其亲本菌株G5的形态学差异如表1所示。
表1菌丝形态学差异
本发明所提供的血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus)mk528 CGMCC № 1124是一种需氧菌，最适生长温度为30℃，发酵培养时分泌漆酶到培养基中，并伴随着有大量的色素产生。
本发明的另一个目的是提供一种漆酶及其生产漆酶的方法。
本发明所提供的漆酶，是发酵血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus)mk528 CGMCC№ 1124得到的。
生产漆酶的方法，包括发酵培养血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus)mk528CGMCC № 1124，和从发酵培养基中提取漆酶。
发酵培养过程需要在有氧和避光条件下进行，培养至第4天需要向培养基中加入诱导物2，5二甲基苯胺，加入2，5二甲基苯胺的量以10μM为宜。所用的发酵培养基可以用麦芽糖、蔗糖或葡萄糖等作为碳源，对于菌丝的生长速度影响不大，但用麦芽糖时漆酶产量要高；培养基通常以酒石酸铵作为氮源，还包括有多种无机组份，如硫酸亚铁、硫酸镁、硫酸锰、硫酸锌、硫酸铜、氯化钙、氯化钴等，和一些营养成分，如维生素B1、B2、B6等。在培养基中加入小麦麸皮，漆酶产量可以提高2-3倍。
在实际应用中，所述发酵培养基优选由下列物质组成，麦芽糖1.0-2.0％；酒石酸铵0.1-0.3％，KH2PO40.132-0.134％；NaH2PO4·12H2O0.038-0.040％；MgSO4·7H2O0.04-0.06％；琥珀酸钠(CH2COONa)2·6H2O0.117-0.119％；FeSO4·7H2O0.00314-0.00316％；CaCl2·2H2O0.009-0.011％；MnSO4·H2O0.0034-0.0036％；CH3COONa·3H2O0.0407-0.0409％；CoCl2·6H2O0.005-0.007％；ZnSO4·7H2O0.0027-0.0029％；CuSO4·5H200.0167-0.0169％；小麦麸皮5-7克；Tween-800.9-1.1ml；VitaminB110μg；VitaminB25μg；VitaminB65μg，加水至1升，其中，所述的百分比是以水为基质的固体重量对水体积的百分比。
所述从发酵培养基中提取漆酶包括以下步骤离心分离、超滤浓缩、硫酸铵分级沉淀、离子交换柱和凝胶过滤柱。
离心分离发酵液，用截留分子量为10000万道尔顿的超滤柱超滤所得上清液，用两步硫酸铵沉淀超滤浓缩液，所述两步硫酸铵沉淀的硫酸铵饱和度分别为30％-40％和70％-90％。
本发明所提供的血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus)mk528 CGMCC № 1124经发酵培养，得到的漆酶酶活可高达63U/ml，而且该菌株在培养过程中不产生木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶，便于漆酶的提取，简化了提取工艺，提取得到的漆酶酶活高，可广泛应用于酚类、芳胺、芳香羧酸及其衍生物的生物降解，造纸制浆生物漂白和废水处理中，并且还可以在木材加工中替代化学胶合剂。
图1为血红密孔菌mk528 CGMCC № 1124的菌落形态照片图2为血红密孔菌mk528 CGMCC № 1124的Giema染色(×1100)显微镜照片具体实施方式
实施例1、血红密孔菌mk528的分离血红密孔菌mk528是从血红密孔菌G5双核菌丝分离获得，而血红密孔菌G5是从血红密孔菌子实体中获得的双核菌丝(唐舜，Lomascolo A，郭林等(2001)Isolationof white-rot fungi from China for screening laccase-hyperproducing strains.菌物系统20520-525)。
血红密孔菌G5在含有琼脂20g/l-1和麦芽抽提物20g/l-1的培养皿中30℃培养，培养7天后，将培养皿倒置并置于室温中继续培养3-4周。然后用高温灭菌的蒸馏水从培养皿盖中收集担孢子，再将这些担孢子悬浮液稀释适当的倍数，涂布到含有琼脂20g/l-1和麦芽抽提物20g/l-1的培养皿中，室温培养，在第二天或第三天，再将可见的担孢子小菌落从培养皿中单孢分离，再用丁香醛连氮的方法筛选漆酶高活性菌株，得到血红密孔菌mk528。
实施例2、发酵培养血红密孔菌mk528生产漆酶一、血红密孔菌mk528的发酵固体种子培养基2％麦芽抽提物，2％琼脂。
发酵培养基麦芽糖15g，酒石酸铵2g，KH2PO41.333g，NaH2PO4·12H2O 0.39g，MgSO4·7H2O 0.5g，琥珀酸钠(CH2COONa)2·6H2O 1.18g，FeSO4·7H2O 0.0315g，CaCl2·2H2O0.1g，MnSO4·H2O 0.035g，CH3COONa·3H2O 0.408g，CoCl2·6H2O 0.06g，ZnSO4·7H2O 0.028g，CuSO4·5H2O 0.168g，小麦麸皮6g，Tween-80 1ml，维生素B110μg，维生素B25μg，维生素B65μg，加水至1L，在8磅高压湿热灭菌30分钟。
将血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus(LFr)Murr.(MK528))接种至固体种子培养基上。30℃下培养6-8天。取菌落最边沿的菌块(直径1cm，10块)，接种到装有100ml的经高压湿热灭菌的发酵培养基的三角瓶内，在30℃和200rpm摇床中避光培养。培养至第4天加入诱导物2，5二甲基苯胺(2，5-Dimethylaniline)，使其终浓度为10μM，再培养8天，收取发酵液，测其酶活为63U/ml。
二、漆酶的提取取发酵液，5000rpm离心除去发酵沉淀物，取上清液经真空抽滤，获得的抽滤液经PLGC膜(10000D)超滤，收集超滤浓缩液。随后采用两步硫酸铵沉淀法沉淀浓缩液第一步用35％(W/V)的饱和硫酸铵在4℃下搅拌沉淀，10000rpm离心1小时，弃沉淀，留上清；第二步向第一步所得的上清液加80％(W/V)的饱和硫酸铵，在4℃下搅拌沉淀，4℃静至2小时，然后10000rpm离心1小时，弃上清，留沉淀。将第二步得到的沉淀用两倍体积的100mM磷酸钾缓冲液(pH 5.7)溶解，在10mM的磷酸钾缓冲液中进行透析过夜，得到粗漆酶制剂。其中超滤步骤得率为81.82％，硫酸铵沉淀步骤得率为88.89％，磷酸钾缓冲液透析得率为96.46％。
取10ml所得粗漆酶制剂用于离子交换柱层析纯化。离子交换介质选用DEAESepharose F.F.，平衡缓冲液为20mM的组氨酸缓冲液(pH6.0)。洗脱过程采用梯度洗脱，梯度为0.1-0.6M NaCl的组氨酸洗脱液，流速为1mL/分钟。将收集到的漆酶部分经过Sephadex G-100，所用洗脱液为水，流速为0.5mL/分钟。然后将漆酶收集液冷冻干燥，得蓝色漆酶。
本实施例中，漆酶活力的测定采用国际通用的2，2’-连氮-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS){2，2'-azino-bis-[3-ethylthiazoline-6-sulphonate]}方法来测定。
酶活力的计算公式为U＝ΔA·V/(ε·L·T)在上述公式中，ΔA表示紫外分光光度计吸收值的变化，V表示反应体系的体积(单位ml)，ε＝3.6×104M·cm-1＝36(μmol/ml)-1·cm-1，为氧化型ABTS的摩尔消光系数，L为比色皿的光径(单位cm)，T为反应的时间(单位分钟)。
本发明中酶活力测定条件为反应体积V＝1mL，比色皿的光径L＝0.5cm，反应时间T＝30秒。其中反应体系的体积1mL内含有的500μL 50mM的酒石酸缓冲液(pH 4)，390μL的水，100μL500μM的ABTS和10μL的发酵液，选用波长为420nm。如果发酵液中漆酶活力太高，可适当稀释。
权利要求
1.血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus)mk528 CGMCC № 1124。
2.一种漆酶，是发酵血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus)mk528 CGMCC № 1124得到的。
3.一种生产漆酶的方法，包括发酵培养血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus)mk528 CGMCC № 1124，和从发酵培养基中提取漆酶。
4.根据权利要求3所述的生产漆酶的方法，其特征在于所述发酵培养在有氧和避光条件下进行；发酵培养的培养基包括麦芽糖、酒石酸铵和无机组分，所述无机组分包括硫酸亚铁、硫酸镁、硫酸锰、硫酸锌、硫酸铜、氯化钙和氯化钴。
5.根据权利要求4所述的生产漆酶的方法，其特征在于所述发酵培养基由下列物质组成，麦芽糖1.0-2.0％；酒石酸铵0.1-0.3％，KH2PO40.132-0.134％；NaH2PO4·12H2O0.038-0.040％；MgSO4·7H2O0.04-0.06％；琥珀酸钠(CH2COONa)2·6H2O0.117-0.119％；FeSO4·7H2O0.00314-0.00316％；CaCl2·2H2O0.009-0.011％；MnSO4·H2O0.0034-0.0036％；CH3COONa·3H2O0.0407-0.0409％；CoCl2·6H2O0.005-0.007％；ZnSO4·7H2O0.0027-0.0029％；CuSO4·5H2O0.0167-0.0169％；小麦麸皮5-7克；Tween-800.9-1.1ml；VitaminB110μg；VitaminB25μg；VitaminB65μg，加水至1升，其中，所述的百分比是以水为基质的固体重量对水体积的百分比。
6.根据权利要求3或4或5所述的生产漆酶的方法，其特征在于所述发酵培养3-5天后向培养基中加入2，5-二甲基苯胺。
7.根据权利要求6所述的生产漆酶的方法，其特征在于所述加入2，5二甲基苯胺的量为10μM。
8.根据权利要求3所述的生产漆酶的方法，其特征在于，所述从发酵培养基中提取漆酶包括以下步骤离心分离、超滤浓缩、硫酸铵分级沉淀、离子交换柱和凝胶过滤柱。
9.根据权利要求8所述的生产漆酶的方法，其特征在于所述超滤浓缩用截留分子量为10000万道尔顿的超滤柱超滤；所述硫酸铵分级沉淀采用两步硫酸铵沉淀的硫酸铵饱和度分别为30％～40％和70％～90％。
全文摘要
本发明公开了一种漆酶及其生产方法与专用生产菌株，涉及微生物发酵工业领域。本发明所提供的菌株为血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus)mk528 CGMCC №1124。本发明所提供的漆酶，是发酵血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus)mk528 CGMCC № 1124得到的。生产漆酶的方法，包括发酵培养血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus)mk528 CGMCC № 1124，和从发酵培养基中提取漆酶。本发明所提供的血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus)mk528 CGMCC № 1124经发酵培养，得到的发酵液漆酶酶活高达63U/ml；而且该菌株在培养过程中不产生木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶，便于漆酶的提取，提取得到的漆酶可广泛应用于造纸废水处理，和木材加工行业中取代甲醛等化学药品。
文档编号C12N1/00GK1690186SQ20041003401
公开日2005年11月2日 申请日期2004年4月21日 优先权日2004年4月21日
发明者郭林, 王文惠, 张虎成, 李伟 申请人:中国科学院微生物研究所