专利名称：M－csf的抗体的制作方法
本申请要求2003年9月10日提交的美国临时申请60/502,163的权益。
背景技术：
巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)是称为集落刺激因子(CSFs)的蛋白质家族的一员。M-CSF为一种分泌性或细胞表面糖蛋白，此种糖蛋白包括二个以二硫键连结的亚基，且其总分子量在40至90kD间变化(Stanley E.R.等人，Mol.Reprod.Dev.，464-10(1997))。如同其它CSFs，M-CSF是由巨噬细胞、单核细胞及人类关节组织细胞(如软骨细胞及滑膜成纤维细胞)对蛋白质(如白细胞介素-1或肿瘤坏死因子-α)反应而产生的。M-CSF刺激多潜能造血祖干细胞形成巨噬细胞集落(Stanley E.R.等人，Mol.Reprod.Dev.，464-10(1997))。
M-CSF通常与其受体c-fms结合以发挥生物作用。c-fms包含五种细胞外Ig结构域、一跨透膜结构域及具有二个激酶结构域的细胞内结构域。当M-CSF与c-fms结合时，受体会同-二聚体化并启始包含JAK/STAT、PI3K及ERK途径的信号转导途径级联。
M-CSF为单核细胞/巨噬细胞的功能、活化及存活的重要调节物。许多动物模型已证实M-CSF于多种疾病(包含类风湿性关节炎(RA)及癌症)中的作用。巨噬细胞包括RA中的关键效应细胞。在RA中滑膜巨噬细胞的浸润程度显示出与潜在关节破坏程度有密切关系。于类风湿病关节中，由单核细胞/巨噬细胞、成纤维细胞及内皮细胞所内源性产生的M-CSF可作用于单核细胞/巨噬细胞系的细胞以促进其存活并分化为可破坏骨质的破骨细胞并增加前-炎性细胞功能，如细胞毒性、超氧化物产生、吞噬作用、驱化性及次级细胞因子产生。例如在大鼠无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)超声处理-诱导的实验性关节炎模型中用M-CSF的处理导致病变增强(Abd，A.H.等人，LymphokineCytokine Res.1043-50(1991))。同样地，于胶原蛋白诱导的关节炎鼠模型(CIA)(其为一种RA模型)中以皮下注射M-CSF导致RA疾病的症状明显恶化(Campbell I.K.等人，J.Leuk.Biol.68144-150(2000))。此外，对RA及其它自身免疫疾病有高易感性的MRL/1pr鼠具有高的基础M-CSF血清浓度(Yui M.A.等人，Am.J.Pathol.139255-261(1991))。维持CIA需要内源性M-CSF，此可由M-CSF中和鼠单克隆抗体能显著减少已发生疾病的严重程度来证实(CampbellI.K.等人，J.Leuk.Biol.68144-150(2000))。
有关癌症方面，以反义寡核苷酸抑制集落刺激因子可通过减缓巨噬细胞-介导的ECM破坏而抑制肿瘤小鼠中胚胎和结肠肿瘤异种移植物中的肿瘤生长(Seyedhossein，A.等人，Cancer Research，625317-5324(2002))。
M-CSF与c-fms结合及其后续对单核细胞/巨噬细胞的活化作用对许多疾病状态十分重要。除RA与癌症外，其余M-CSF相关疾病状态实例包含骨质疏松症、破坏性关节炎、动脉粥样硬化生成、肾小球肾炎、川崎病(Kawasaki disease)及HIV-1感染，其中单核细胞/巨噬细胞与相关细胞类型发挥了重要作用。如破骨细胞类似巨噬细胞并部分由M-CSF调节。破骨细胞成熟初期由M-CSF所诱导的生长及分化信号对破骨细胞后续于骨中的活性为必要的。
病灶骨质侵蚀及更具扩散性的近-关节(juxta-articular)骨质疏松症二种形式的破骨细胞介导的骨丢失为RA主要未解决的问题。此种骨丢失后果包括关节畸形、功能残废、骨折风险增加及死亡率增高。对破骨细胞生成而言，M-CSF为非常必需的，且于关节炎的动物模型中实验性地阻断此种细胞因子可成功地阻止关节破坏。已知其它形式的破坏性关节炎(如牛皮癣性关节炎)中也有类似的破坏性途径运作，并可呈现类似的干预作用。
绝经后的骨丢失起因于缺陷性骨骼重塑，其继发于失衡的(uncoupling)骨质形成与因雌激素缺乏所导致的高度增生的破骨细胞介导的骨质再吸收。于小鼠活体内使用阻断性抗体来中和M-CSF显示完全预防破骨细胞数量增加、骨质重吸收增加及由卵巢切除术诱发所产生的骨质流失。
有多重证据显示M-CSF于动脉粥样硬化生成及机械性伤害动脉壁后的增殖性内膜增生中的重要作用。动脉粥样硬化病变中所有主要的细胞类型皆显示表达M-CSF，且其可通过暴露于氧化脂蛋白而进一步被上调。以中和c-fms抗体阻断M-CSF信号发生可减少以高脂肪食物喂食的载脂蛋白E缺陷性小鼠主动脉根部的巨噬细胞-衍生泡沫细胞的堆积。
于实验性及人类肾小球肾炎中，肾小球M-CSF的表达发现会与局部巨噬细胞堆积、活化及增殖共同存在(co-localize)且与肾小球损伤及蛋白尿程度有关。通过针对其受体c-fms的抗体阻断M-CSF信号发生可显著地下调于实验性单侧输尿管阻塞所诱导的肾炎症反应期间小鼠的局部巨噬细胞堆积。
川崎病(KD)为一种未知原因的急性、热性的儿科血管炎。其最常见及严重的并发症包含动脉瘤性扩张形式的冠状动脉血管系统。血清M-CSF水平在急性期川崎病中呈显著升高，而以静脉内免疫球蛋白治疗后呈正常化。巨细胞关节炎(GCA)为一种炎症性血管病变，主要发生于年长者，其中T细胞及巨噬细胞浸润中大型动脉壁所导致的临床后果包含失明及继发于动脉阻塞的中风。巨噬细胞于GCA中的活性作用可由血管损害中源自炎性介体的巨噬细胞浓度升高而证实。
已报告M-CSF可使人类单核细胞衍生的巨噬细胞体外更易受HIV-1感染。在近期的研究中，M-CSF增加单核细胞-衍生的巨噬细胞受感染的频率、每个受感染细胞中所表达的HIV mRNA的量及每个受感染的培养物中所表达的前病毒DNA的浓度。
由于M-CSF在多种疾病中的重要作用，故需要可抑制M-CSF活性的方法。
目前强烈需求治疗性抗M-CSF抗体。
发明简述本发明提供特异性结合人M-CSF并作为M-CSF拮抗剂的分离的人抗体或其抗原结合部分，以及包含所述抗体或部分的组合物。
本发明也提供组合物，其包含该治疗中有效的本发明的抗M-CSF抗体的重链及/或轻链、其可变区或其抗原结合部分，或编码该抗体、抗体链或其可变区的核酸分子，及药物可接受载体。于某些实施方案中，该组合物可进一步包含另一组分，如治疗剂或诊断剂。本发明亦提供诊断及治疗方法。于某些实施方案中，该组合物以治疗或预防特定疾病或病况所需的治疗有效量使用。
本发明亦提供以有效量的本发明抗M-CSF抗体或其抗原结合部分、编码该抗体或其重链及/或轻链、可变区或其抗原结合部分的核酸来治疗或预防各种疾病及病况的方法，如(但不限于)炎症、癌症、动脉粥样硬化生成、神经障碍及心脏疾患。
本发明提供分离的细胞系，如产生抗M-CSF抗体或其抗原结合部分的杂交瘤。
本发明还提供编码抗M-CSF抗体的重链及/或轻链、其可变区或其抗原结合部分的核酸分子。
本发明提供包含核酸分子的载体及宿主细胞以及重组产生由该核酸分子所编码的多肽的方法。
本发明还提供表达抗M-CSF抗体的重链及/或轻链或其抗原结合部分的非-人类转基因动物或植物。
附图简述
图1A及1B说明随时间变化的抗M-CSF抗体导致的雄猴及雌猴体内总单核细胞计数的剂量相关的下降情况。单核细胞计数通过使用Abbott Diagnostics Inc.Cell Dyn系统的光散射确定。单核细胞计数监测时间自给药后24小时直到3周，给药内容有载体或抗体8.10.3，0、0.1、1或5mg/kg，剂量体积为3.79mL/kg，给药时间约5分钟。
图1A为雄猴。
图1B为雌猴。
图2A及2B说明抗M-CSF治疗在雄猴及雌猴中导致CD14+CD16+单核细胞百分比下降。监测时间为给药后0-21日，给药内容有载体或抗体8.10.3，0、0.1、1或5mg/kg，剂量体积为3.79mL/kg，给药时间约5分钟。于8.10.3注射后第1、3、7、14及21日，于每次抽血后测定每只受测猴子CD14+CD16+亚型中的单核细胞比例。
图2A为雄猴。
图2B为雌猴。
图3A及3B说明与受测前的单核细胞水平相比，所有剂量的抗体8.10.3F及抗体9.14.4I的抗M-CSF治疗导致总单核细胞百分比变化减少。
图3A显示由使用抗体8.10.3F的实验所收集的数据。
图3B显示由使用抗体9.14.4I的实验所收集的数据。
图4为来自26种抗M-CSF抗体的轻链及重链可变区的预期氨基酸序列的序列与相应的可变区基因的种系氨基酸序列比较的序列比对。抗体序列与种系基因序列间的差异以粗体表示。虚线代表与种系无异。各比对中下划线的序列由左至右表示为FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4序列。
图4A显示抗体252的轻链可变区的预期氨基酸序列(SEQ ID NO4的残基21-127)与种系VkO12，Jk3序列(SEQ ID NO103)的比对。
图4B显示抗体88的轻链可变区的预期氨基酸序列(SEQ ID NO8的残基21-127)与种系VkO12，Jk3序列(SEQ ID NO103)的比对。
图4C显示抗体100的轻链可变区的预期氨基酸序列(SEQ ID NO12的残基21-127)与种系VkL2，Jk3序列(SEQ ID NO107)的比对。
图4D显示抗体3.8.3的轻链可变区的预期氨基酸序列(SEQ ID NO16的残基23-130)与种系VkL5，Jk3序列(SEQ ID NO109)的比对。
图4E显示抗体2.7.3的轻链可变区的预期氨基酸序列(SEQ ID NO20的残基23-130)与种系VkL5，Jk4序列(SEQ ID NO117)的比对。
图4F显示抗体1.120.1的轻链可变区的预期氨基酸序列(SEQ IDNO24的残基21-134)与种系VkB3，Jk1序列(SEQ ID NO112)的比对。
图4G显示抗体252的重链可变区的预期氨基酸序列(SEQ ID NO2的残基20-136)与种系VH3-11，DH7-27JH6序列(SEQ ID NO106)的比对。
图4H显示抗体88的重链可变区的预期氨基酸序列(SEQ ID NO6的残基20-138)与种系VH3-7，DH6-13，JH4序列(SEQ ID NO105)的比对。
图4I显示抗体100的重链可变区的预期氨基酸序列(SEQ ID NO10的残基20-141)与种系VH3-23，DH1-26，JH4序列(SEQ ID NO104)的比对。
图4J显示抗体3.8.3的重链可变区的预期氨基酸序列(SEQ ID NO14的残基20-135)与种系VH3-11，DH7-27，JH4序列(SEQ ID NO108)的比对。
图4K显示抗体2.7.3的重链可变区的预期氨基酸序列(SEQ ID NO18的残基20-137)与种系VH3-33，DH1-26，JH4序列(SEQ ID NO110)的比对。
图4L显示抗体1.120.1的重链可变区的预期氨基酸序列(SEQ IDNO22的残基20-139)与种系VH1-18，DH4-23，JH4序列(SEQ ID NO111)的比对。
图4M显示抗体8.10.3的轻链可变区的预期氨基酸序列(SEQ ID NO44的残基21-129)与种系VkA27，JK4序列(SEQ ID NO114)的比对。
图4N显示抗体8.10.3的重链可变区的预期氨基酸序列(SEQ ID NO30的残基20-141)与种系VH3-48，DH1-26，JH4b序列(SEQ ID NO113)的比对。
图40显示抗体9.14.4的轻链可变区的预期氨基酸序列(SEQ ID NO28的残基23-130)与种系VkO12，Jk3序列(SEQ ID NO103)的比对。
图4P显示抗体9.14.4的重链可变区的预期氨基酸序列(SEQ ID NO38的残基20-135)与种系VH3-11，DH7-27，JH4b序列(SEQ ID NO116)的比对。
图4Q显示抗体9.7.2的轻链可变区的预期氨基酸序列(SEQ ID NO48的残基23-130)与种系VkO12，Jk3序列(SEQ ID NO103)的比对。
图4R显示抗体9.7.2的重链可变区的预期氨基酸序列(SEQ ID NO46的残基20-136)与种系VH3-11，DH6-13，JH6b序列(SEQ ID NO115)的比对。
图4S显示抗体9.14.4I的轻链可变区的预期氨基酸序列(SEQ IDNO28的残基23-130)与种系VkO12Jk3序列(SEQ ID NO103)的比对。
图4T显示抗体9.14.4I的重链可变区的预期氨基酸序列(SEQ IDNO26的残基20-135)与种系VH3-11，DH7-27，JH4b序列(SEQ ID NO116)的比对。
图4U显示抗体8.10.3F的轻链可变区的预期氨基酸序列(SEQ IDNO32的残基21-129)与种系VkA27，Jk4序列(SEQ ID NO114)的比对。
图4V显示抗体8.10.3F的重链可变区的预期氨基酸序列(SEQ IDNO30的残基20-141)与种系VH3-48，DH1-26，JH4b序列(SEQ ID NO113)的比对。
图4W显示抗体9.7.2IF的轻链可变区的预期氨基酸序列(SEQ IDNO36的残基23-130)与种系VkO12，Jk3序列(SEQ ID NO103)的比对。
图4X显示抗体9.7.2I F的重链可变区的预期氨基酸序列(SEQ IDNO34的残基20-136)与种系VH3-11，DH6-13，JH6b序列(SEQ ID NO115)的比对。
图4Y显示抗体9.7.2C-Ser的轻链可变区的预期氨基酸序列(SEQID NO52的残基23-130)与种系VkO12，Jk3序列(SEQ ID NO103)的比对。
图4Z显示抗体9.7.2C-Ser的重链可变区的预期氨基酸序列(SEQID NO50的残基20-136)与种系VH3-11，DH6-13，JH6b序列(SEQ ID NO115)的比对。
图4AA显示抗体9.14.4C-Ser的轻链可变区的预期氨基酸序列(SEQID NO56的残基23-130)与种系VkO12，Jk3序列(SEQ ID NO103)的比对。
图4BB显示抗体9.14.4C-Ser的重链可变区的预期氨基酸序列(SEQID NO54的残基20-135)与种系VH3-11，DH7-27，JH4b序列(SEQ ID NO116)的比对。
图4CC显示抗体8.10.3C-Ser的轻链可变区的预期氨基酸序列(SEQID NO60的残基21-129)与种系VkA27，Jk4序列(SEQ ID NO114)的比对。
图4DD显示抗体8.10.3C-Ser的重链可变区的预期氨基酸序列(SEQID NO58的残基20-141)与种系VH3-48，DH1-26，JH4b序列(SEQ ID NO113)的比对。
图4EE显示抗体8.10.3-CG2的轻链可变区的预期氨基酸序列(SEQID NO60的残基21-129)与种系VkA27，Jk4序列(SEQ ID NO114)的比对。
图4FF显示抗体8.10.3-CG2的重链可变区的预期氨基酸序列(SEQID NO62的残基20-141)与种系VH3-48，DH1-26，JH4b序列(SEQ ID NO113)的比对。
图4GG显示抗体9.7.2-CG2的轻链可变区的预期氨基酸序列(SEQID NO52的残基23-130)与种系VkO12，Jk3序列(SEQ ID NO103)的比对。
图4HH显示抗体9.7.2-CG2的重链可变区的预期氨基酸序列(SEQID NO66的残基20-136)与种系VH3-11，DH6-13，JH6b序列(SEQ ID NO115)的比对。
图4II显示抗体9.7.2-CG4的轻链可变区的预期氨基酸序列(SEQID NO52的残基23-130)与种系VkO12，Jk3序列(SEQ ID NO103)的比对。
图4JJ显示抗体9.7.2-CG4的重链可变区的预期氨基酸序列(SEQID NO70的残基20-135)与种系VH3-11，DH6-13，JH6b序列(SEQ ID NO115)的比对。
图4KK显示抗体9.14.4-CG2的轻链可变区的预期氨基酸序列(SEQID NO56的残基23-130)与种系VkO12，Jk3序列(SEQ ID NO103)的比对。
图4LL显示抗体9.14.4-CG2的重链可变区的预期氨基酸序列(SEQID NO74的残基20-135)与种系VH3-11，DH7-27，JH4b序列(SEQ ID NO116)的比对。
图4MM显示抗体9.14.4-CG4的轻链可变区的预期氨基酸序列(SEQID NO56的残基23-130)与种系VkO12，Jk3序列(SEQ ID NO103)的比对。
图4NN显示抗体9.14.4-CG4的重链可变区的预期氨基酸序列(SEQID NO78的残基20-135)与种系VH3-11，DH7-27，JH4b序列(SEQ ID NO116)的比对。
图400显示抗体9.14.4-Ser的轻链可变区的预期氨基酸序列(SEQID NO28的残基23-130)与种系VkO12，Jk3序列(SEQ ID NO103)的比对。
图4PP显示抗体9.14.4-Ser的重链可变区的预期氨基酸序列(SEQID NO82的残基20-135)与种系VH3-11，DH7-27，JH4b序列(SEQ ID NO116)的比对。
图4QQ显示抗体9.7.2-Ser的轻链可变区的预期氨基酸序列(SEQID NO48的残基23-130)与种系VkO12，Jk3序列(SEQ ID NO103)的比对。
图4RR显示抗体9.7.2-Ser的重链可变区的预期氨基酸序列(SEQID NO86的残基20-136)与种系VH3-11，DH6-13，JH6b序列(SEQ ID NO115)的比对。
图4SS显示抗体8.10.3-Ser的轻链可变区的预期氨基酸序列(SEQID NO44的残基21-129)与种系VkA27，Jk4序列(SEQ ID NO114)的比对。
图4TT显示抗体8.10.3-Ser的重链可变区的预期氨基酸序列(SEQID NO90的残基20-141)与种系VH3-48，DH1-26，JH4b序列(SEQ ID NO113)的比对。
图4UU显示抗体8.10.3-CG4的轻链可变区的预期氨基酸序列(SEQID NO60的残基21-129)与种系VkA27，Jk4序列(SEQ ID NO114)的比对。
图4VV显示抗体8.10.3-CG4的重链可变区的预期氨基酸序列(SEQID NO94的残基20-141)与种系VH3-48，DH1-26，JH4b序列(SEQ ID NO113)的比对。
图4WW显示抗体9.14.4G1的轻链可变区的预期氨基酸序列(SEQ IDNO28的残基23-130)与种系VkO12，Jk3序列(SEQ ID NO103)的比对。
图4XX显示抗体9.14.4G1的重链可变区的预期氨基酸序列(SEQ IDNO102的残基20-135)与种系VH3-11，DH7-27，JH4b序列(SEQ ID NO116)的比对。
图4YY显示抗体8.10.3FG1的轻链可变区的预期氨基酸序列(SEQID NO32的残基21-129)与种系VkA27，Jk4序列(SEQ ID NO114)的比对。
图4ZZ显示抗体8.10.3FG1的重链可变区的预期氨基酸序列(SEQID NO98的残基20-141)与种系VH3-48，DH1-26，JH4b序列(SEQ ID NO113)的比对。
发明详述定义及一般技术除非在此另有定义，本发明所使用的科学及技术术语具有本领域普通技术人员所共同理解的含义。此外，除非是上下文所需，否则单数术语可包含复数型且复数术语可包含单数型。一般来说，在此所使用与细胞及组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学及蛋白质与核酸化学及杂交相关的命名和技术皆为本领域所熟知且常用于本领域中。
除非另有指定，否则本发明的方法及技术一般按照本领域中所熟知的常规方法进行，并如本专利说明书中所引用的和讨论的各种一般及比较特定的文献中所述。请见如Sambrook等人，Molecular CloningA Laboratory Manual，2d ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)与Ausubel等人，Current Protocolsin Molecular Biology，Greene Publishing Associates(1992)及Harlow与Lane AntibodiesA Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1990)，其是以引用的方式并入本文中。酶反应与纯化技术是依厂商说明书进行，以如本领域中通用方法或在此所述方法完成。在此所述的与分析化学、合成有机化学及医药与药物化学相关的命名法和实验方法及技术是所熟知且常用于本领域的。化学合成、化学分析、药物制备、调配及递送与患者治疗采用标准技术。
除非另外指定，下列名词具有下列意义术语″多肽″包括天然或人工蛋白质、蛋白质片段及蛋白质序列的多肽类似物。多肽可为单体或聚合物。
术语″分离的蛋白质″、″分离的多肽″或″分离的抗体″是指这样的蛋白质、多肽或抗体，其依其起源或衍生来源具有下列一至四种状况(1)不伴有在自然状态中会伴随其的天然相关组分，(2)不含其它源自相同物种的蛋白质，(3)是由源自不同物种的细胞所表达，或(4)不会天然产生。因此，化学合成或于与其自然产生的细胞不同的细胞系统中所合成的多肽为自其天然相关组分中″分离″的。蛋白质也可通过分离(使用本领域中所熟知的蛋白质纯化技术)使其实质上不含天然相伴随的组分。
分离的抗体实例包括已经使用M-CSF进行亲和纯化的抗M-CSF抗体、于由杂交瘤或其它细胞系体外合成的抗M-CSF抗体及源自转基因小鼠的人类抗M-CSF抗体。
当至少约60-75％的样本显示为单一种类多肽时，蛋白质或多肽为″实质上纯的″、″实质上同质的″或″实质上纯化的″。该多肽或蛋白质可为单体或多聚体。实质上纯的多肽或蛋白质典型地包含约50％、60％、70％、80％或90％W/W的蛋白质样品，更常为约95％且优选为99％以上纯的。蛋白质纯度或同质性可通过许多本领域中所熟知的方法显示，如蛋白质样品的聚丙烯酰胺凝胶电泳，再以本领域中所熟知的染色剂将凝胶染色以便显现单一多肽带。为某些目的，使用HPLC或其它本领域普通技术人员所熟知的纯化方法可得较高的分辨率。
在此所用的术语″多肽片段″意指具有氨基末端及/或羧基末端缺失的多肽，但其保留的氨基酸序列与自然产生序列中相应位置相同。在某些实施方案中，片段长度至少为5、6、8或10个氨基酸。于其它实施方案中，片段长度至少为14、至少20、至少50或至少为70、80、90、100、150或200个氨基酸。
在此所用的术语″多肽类似物″意指包括含有实质上与部分氨基酸序列相同的片段的多肽且其至少具有一种下列特性(1)于适当结合条件下与M-CSF特异性结合，(2)抑制M-CSF能力。
典型地，多肽类似物相对于自然产生的序列包含保守性氨基酸替代(或插入或缺失)。类似物长度典型为至少20或25个氨基酸，优选为至少50、60、70、80、90、100、150或200个氨基酸或者更长，且经常可以与全长多肽一样长。
于某些实施方案中，抗体或其抗原结合部分的氨基酸替代为(1)降低对蛋白水解的敏感性，(2)降低对氧化作用的敏感性，(3)改变形成蛋白复合物的结合亲和力，或(4)可赋予或修饰此种类似物其它理化或机能特性。类似物可以包括正常产生的肽序列以外的各种突变蛋白序列。如可于正常产生的序列中产生单个或多个氨基酸替代(优选为保守性氨基酸替代)，优选于形成分子间接触的结构域以外的多肽部分。
保守性氨基酸替代应不实质上改变亲本序列的结构特征，如取代氨基酸不应改变组成免疫球蛋白结合结构域的反平行β-折叠(于亲本序列中所产生)或中断构成亲本序列特征的其它二级结构形式。通常，甘氨酸及脯氨酸类似物不会用于反平行β-折叠中。本领域认可的多肽二级与三级结构的实例描述于Proteins，Structures and MolecularPrinciples(Creighton编辑，W.H.Freeman and Company，New York(1984))；Introduction to Protein Structure(C.Branden及J.Tooze编辑，Garland Publishing，New York，N.Y.(1991))；及Thornton等人，Nature 354105(1991)，各文以引用的方式并入本文中。
非肽类似物常用于医药工业作为与模板肽具有类似特性的药物。这些非肽化合物类型称为″肽模拟物(peptide mimetics)″或″peptidomimetics″Fauchere，J.Adv.Drug Res.1529(1986)；Veber及Freidinger，TINS 392页(1985)；及Evans等人，J.Med.Chem.301229(1987)，其是以引用的方式并入本文中。此种化合物通常是借助计算机化分子模建而开发。结构上类似治疗可用的肽的肽模拟物可用于产生等同疗效或预防作用。通常peptidomimetics结构上类似于范例多肽(即具有所需的生化特性或医药活性的多肽)，如人类抗体，但具有一个或多个任选通过本领域所熟知的方法由选自下列的键取代的肽键--CH2NH--、--CH2S--、--CH2-CH2--、--CH＝CH--(顺式及反式)、--COCH2--、--CH(OH)CH2--及-CH2SO--。以相同类型的D-氨基酸(如以D-赖氨酸代替L-赖氨酸)系统地替代共有序列中一个或多个氨基酸也可用于产生更稳定的肽。此外，包含共有序列或实质上与共有序列变异相同的限制性肽可通过本领域中已知的方法产生(Rizo及Gierasch，Ann.Rev.Biochem.61387(1992)，以引用的方式并入本文中)；如通过添加内半胱氨酸残基能形成环化肽的分子内二硫桥。
″抗体″意指完整抗体或可与完整抗体竞争特异性结合的抗原结合部分。一般请见Fundamental Immunology，第7章(Paul，W.编辑，第2版.Raven Press，N.Y.(1989))(以引用的方式将其针对所有目的的全部内容并入本文中)。抗原结合部分可通过DNA重组技术或通过酶促或化学裂解完整的抗体来制备。在某些实施方案中，抗原结合部分包括Fab、Fab′、F(ab′)2、Fd、Fv、dAb及互补决定区(CDR)片段、单链抗体(scFv)、嵌合抗体、二体(diabody)与至少包含足以赋予该多肽特异性抗原结合的抗体部分的多肽。
由N-末端至C-末端，成熟的轻链及重链可变区都包含FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4区。将氨基酸分配至各区是依照Kabat的定义，Sequences of Proteins of Immunological Interest(NationalInstitutes of Health，Bethesda，Md.(1987及1991))，Chothia及Lesk，J.Mol.Biol.196901-917(1987)或Chothia等人，Nature342878-883(1989)。
在此所用的以数字提及的抗体是与由相同数字的杂交瘤所获得的单克隆抗体相同。如单克隆抗体3.8.3与由杂交瘤3.8.3所获得的抗体相同。
在此所用的Fd片段意指由VH及CH1结构域所组成的抗体片段；Fv片段是由抗体的单臂的VL与VH结构域组成；而dAb片段(Ward等人，Nature341544-546(1989))是由VH结构域组成。
于某些实施方案中，抗体为单链抗体(scFv)，其中的VL及VH结构域通过能使其形成单一蛋白链的合成接头配对而形成单价分子(Bird等人，Science 242423-426(1988)及Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 855879-5883(1988)。于某些实施方案中，抗体为二体(即二价抗体)，其中的VH及VL结构域于单一多肽链上表达，但其所使用的接头过短无法供相同链上该两个结构域间的配对，从而迫使所述结构域与另一链的互补结构域配对并产生二个抗原结合部位(请见如Holliger P.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 906444-6448(1993)及Poljak R.J.等人，Structure 21121-1123(1994))。在某些实施方案中，一个或多个源自本发明抗体的CDR可共价或非共价并入一分子中形成可与M-CSF特异性结合的免疫粘附素(immunoadhesin)。在此类实施方案中，CDR(s)可合并为较大多肽链的一部分，其可共价连接至另一多肽链或其可为非共价性并入。
在具有一个或多个结合位点的实施方案中，结合位点可彼此相同或不同。
在此所用的术语″人类抗体″意指任何抗体，其中的可变区及恒定区序列为人类序列。该术语包含具有源自人类基因的序列的抗体，但其已经被改变，如以减少可能的免疫原性、增加亲和力、排除可能引起不希望的折叠的半胱氨酸等。该术语包含在非人类细胞中重组产生的抗体，其可能带来非典型人类细胞的蛋白质糖基化作用。这些抗体可通过下述各种方法制备。
在此所用的术语″嵌合抗体″意指抗体包括源自两个或多个不同抗体的区域。在一个实施方案中，一个或多个CDR是源自人类抗M-CSF抗体。于另一实施方案中，所有CDR皆源自人类抗M-CSF抗体。于另一实施方案中，源自一个以上人类抗M-CSF抗体的CDR组合于嵌合抗体中。例如，嵌合抗体可包括源自第一人类抗M-CSF抗体轻链的CDR1、源自第二人类抗M-CSF抗体轻链的CDR2及源自第三人类抗M-CSF抗体轻链的CDR3与源自一个或多个其它抗M-CSF抗体重链的CDR。此外，构架区可源自一种如下的抗M-CSF抗体，一个或多个CDR取自该抗体或取自一种或多种不同人类抗体。
抗体或免疫球蛋白分子的片段或类似物可容易地由本领域普通技术人员依照本专利说明书的指导来制备。优选片段或类似物的氨基末端与羧基末端存在于接近功能性结构域的边缘。结构性与功能性结构域可通过比较核苷酸及/或氨基酸序列数据与公共或专利序列数据库来鉴别。优选采用计算机化比较方法来鉴别出现于其它已知结构及/或功能的蛋白质中的序列基序或预期的蛋白质构象结构域。已知鉴别可折叠成为已知三维结构的蛋白质序列的方法。请见Bowie等人，Science 253164(1991)。
在此所用的术语″表面胞质共振(surface plasmon resonance)″意指一种光学现象，其可以通过检测生物感应基质内蛋白质浓度变化分析实时生物特异性交互作用，如使用BIACORETM系统(PharmaciaBiosensor AB，Uppsala，Sweden and Piscataway，N.J.)。进一步描述请见Jonsson U.等人，Ann.Biol.Clin.5119-26(1993)；Jonsson U.等人，Biotechniques 11620-627(1991)；Jonsson B.等人，J.Mol.Recognit.8125-131(1995)；及Johnsson B.等人，Anal.Biochem.198268-277(1991)。
″KD″一词意指特定抗体-抗原相互作用的平衡解离常数。
″表位″一词包含任何可与免疫球蛋白或T-细胞受体特异性结合或与分子互相作用的蛋白质决定簇。表位决定簇通常由化学活性的表面分子组(如氨基酸或糖类侧链等分子)构成且通常具有特异的三维结构特征以及特异的电荷特征。表位可为″线性″或″构象的(conformational)″。于线性表位中，所有蛋白质与相互作用分子(如抗体)间的相互作用的位点是沿着该蛋白质一级氨基酸序列线性地发生。于构象表位中，相互作用的位点是穿过蛋白质上互相分离的氨基酸残基。当解离常数≤1mM，优选为≤100nM且最优选为≤10nM时，可称抗体能与抗原特异性结合。于某些实施方案中，KD为1pM至500pM。于其它实施方案中，KD是介于500pM至1μM间。于其它实施方案中，KD是介于1μM至100nM间。于其它实施方案中，KD是介于100mM至10nM。一旦测定出抗原上所需的表位，即可使用如本发明中所述的技术产生该表位的抗体。或者，于发现表位期间，抗体产生及表征可说明所需的表位的信息。接着由该信息可竞争性筛选与相同表位结合的抗体。一种可达到此目的的方法为进行交叉竞争性研究以寻找互相竞争性结合的抗体，如竞争与抗原结合的抗体。一种根据交叉竞争性进行″binning″抗体的高通量方法描述于国际专利申请号WO 03/48731。
在此所用的20种常见氨基酸及其缩写遵循惯例使用。请见Immunology-A Synthesis(第2版，E.S.Golub及D.R.Gren，Eds.，Sinauer Associates，Sunderland，Mass.(1991))，其以引用的方式并入本文中。
″多核苷酸″一词在此是指长度至少为10个碱基的核苷酸聚合物形式，无论是核糖核苷酸或脱氧核苷酸或任一类型核苷酸的经修饰形式。该术语包含单链及双链形式。
在此所用的″分离的多核苷酸″一词意指基因组、cDNA或合成来源或其某些组合的多核苷酸，根据起源或衍生来源，该″分离的多核苷酸″包含有下列一至三项特征(1)与该″分离的多核苷酸″天然一起发现的全部或部分多核苷酸无关，(2)可操作地连接至在天然不会连接在一起的多核苷酸，或(3)天然情况下不会成为较大序列的一部分。
在此所用的″寡核苷酸″一词包含自然产生，及经修饰的核苷酸，其通过自然产生及非自然产生的寡核苷酸键连接在一起。寡核苷酸为多核苷酸的子集，其通常包括200个碱基或更少的长度。优选寡核苷酸长度为10至60个碱基且最优选长度为为12、13、14、15、16、17、18、19或20至40个碱基。寡核苷酸通常为单链，如引物及探针；但寡核苷酸也可为双链(如用于构建基因突变子)。本发明的寡核苷酸可为有义或反义寡核苷酸。
在此所用的″自然产生的核苷酸″一词包含脱氧核糖核苷酸及核糖核苷酸。在此所用的″经修饰核苷酸″包含具有经修饰或取代糖基等的核苷酸。在此所用的″寡核苷酸键″意指包含寡核苷酸键，如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、phosphoroanilothioate、phoshoraniladate、phosphoroamidate等。请见如LaPlanche等人，Nucl.Acids Res.149081(1986)；Stec等人，J.Am.Chem.Soc.1066077(1984)；Stein等人，Nucl.AcidsRes.163209(1988)；Zon等人，Anti-Cancer Drug Design6539(1991)；Zon等人，Oligonucleotides and AnaloguesAPractical Approach，87-108页(F.Eckstein，Ed.，Oxford UniversityPress，Oxford England(1991))；美国专利第5,151,510号；Uhlmann及Peyman，Chemical Reviews 90543(1990)，其公开内容以引用的方式并入本文中。若需要时寡核苷酸可包含标记以供检测。
″可操作地连接″的序列既包含邻近目的基因的表达控制序列还包含以反式或远距离来控制目的基因的表达控制序列。在此所用的″表达控制序列″一词意指实现其所连接的编码序列表达和加工所必需的多核苷酸序列。表达控制序列包含适当的转录起始、终止、启动子及增强子序列；有效的RNA加工信号(如剪接及多腺核苷酸化信号)；可稳定细胞质mRNA的序列、可提高翻译效率的序列(即Kozak共有序列)、可增加蛋白质稳定性的序列，且当需要时可包含能增加蛋白质分泌的序列。此种控制序列的性质依宿主生物而不同；于原核生物中，此种控制序列通常包含启动子、核糖体结合位点及转录终止序列；于真核生物中，此种控制序列通常包含启动子及转录终止序列。″控制序列″一词意欲包含至少所有表达及加工所必须的组分，且亦可包含其它的有益组分，如前导序列及融合配偶体序列。
在此所用的″载体″一词意指可运送与其连接的另一核酸的核酸分子。于某些实施方案中，载体为质粒，即另外DNA片段可连接至其中的环状双链DNA环。于某些实施方案中，载体为病毒性载体，其中另外的DNA片段可连接至病毒基因组中。于某些实施方案中，载体可在其所导入的宿主细胞中进行自我复制(如具有细菌性复制起点的细菌载体及游离型哺乳动物载体)。于其它实施方案中，载体(如非游离型哺乳动物载体)于导入宿主细胞后可整合入宿主细胞基因组，并因此可与宿主基因组一起复制。此外，某些载体可指导其操作性所连结的基因的表达。此种载体在此称为″重组表达载体″(或简称为″表达载体″)。
在此所用的″重组宿主细胞″(或简称″宿主细胞″)一词意指一已导入重组表达载体的细胞。应了解″重组宿主细胞″及″宿主细胞″不仅指特定的受试细胞，且亦指该细胞的子代。由于突变或环境影响，因此某些修饰可能发生在子代，事实上此种子代可能不会与亲代细胞完全相同，但仍包含于在此所用的″宿主细胞″一词范围内。
在此所用的″选择性杂交″一词意指进行可检测地且特异性结合。本发明的多核苷酸、寡核苷酸及片段可于杂交并洗涤条件下与核酸链进行选择性杂交，所述条件尽量减少大量的与非特异核酸的可检测结合。″高严格性″或″高度严格的″条件可用于达成本领域中已知且在在此讨论的选择性杂交条件。一″高严格性″或″高严格的″条件实例为将多核苷酸与另一种多核苷酸温育(其中的一种多核苷酸可附着于固体表面(如膜))于杂交缓冲液6X SSPE或SSC、50％甲酰胺(formamide)、5X Denhardt′s试剂、0.5％SDS、100μg/ml变性片段化的鲑精DNA中，杂交温度为42℃，12-16小时，随后再于55℃、使用1X SSC、0.5％SDS的洗涤缓冲液两次洗涤。亦见于Sambrook等人，前述，9.50-9.55页。
″序列相同性百分比″在描述核酸序列时，意指比较及比对第一连续序列与第二连续序列时其最大相同残基百分比。序列相同性比较的长度可大于至少约9个核苷酸，通常至少约18个核苷酸，更通常为至少约24个核苷酸，典型地至少约28个核苷酸，更典型地为至少约32个核苷酸，且优选为至少约36、48或更多个核苷酸。有一些本领域中已知的不同算法可用于测量核苷酸序列相同性。如多核苷酸序列的比对可使用FASTA、Gap或Bestfit，其为Wisconsin Package version 10.0的程序，Genetics Computer Group(GCG)，Madison，Wisconsin。包含如FASTA2及FASTA3的FASTA程序可提供查询及检索序列间最佳重叠区的比对及序列相同性(Pearson，Methods Enzymol.18363-98(1990)；Pearson，Methods Mol.Biol.132185-219(2000)；Pearson，Methods Enzymol.266227-258(1996)；Pearson，J.Mol.Biol.27671-84(1998)；以引用的方式并入本文中)。除非另外指定，否则使用特定程序或算法的缺省参数。例如，测定核酸序列间的序列相同性可使用FASTA及其缺省参数(字大小为6及供作评比基础的NOPAM系数)或使用Gap及其缺省参数(如GCG第6.1版所提供的)，其以引用的方式并入本文中。
除非另外指定，当提及一核苷酸序列时包含其补序列。因此，当提及具有特定序列核酸时应了解其是包含其互补链，及其互补性序列。
″序列相同性百分比″一词意指一种比例，其表示为相同残基数与所比较的残基数的百分比。
当提及核酸或其片段时，″实质上类似″或″实质上序列类似″等词意指当将具有适当核苷酸插入或缺失的核酸或片段与另一核酸(或其互补链)进行最佳化比对时，其核苷酸序列相同性为至少约85％，优选为至少约90％，且更优选为至少约95％、96％、97％、98％或99％核苷酸碱基，以上可以任何所熟知的上述序列相同性算法(如FASTA、BLAST或Gap)来测量。
当形容多肽时，″实质上相同″一词意指二个肽序列，当进行最佳化比对时(如以GAP或BESTFIT程序、依程序所提供使用的缺省gapweights)，共同拥有至少70％、75％或80％序列相同性，优选为至少90％或95％序列相同性，且更优选为至少97％、98％或99％的序列相同性。于某些实施方案中，不同的残基位置因保守性氨基酸替换而不同。″保守性氨基酸替换″意指其中的氨基酸残基以另一具有类似化学特性(如电荷或疏水性)的侧链R基的氨基酸残基所替换。保守性氨基酸替换通常并不会实质上改变蛋白质的功能特性。在二个或多个氨基酸序列因保守性替换而互异的情况下，其序列相同性可向上调整以修正替换的保守性本质。可进行该调整的方法为本领域普通技术人员所熟知。请见如Pearson，Methods Mol.Biol.243307-31(1994)。具有类似化学特性的侧链的氨基酸组的实例包含1)脂族侧链甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸及异亮氨酸；2)脂族-羟基侧链丝氨酸及苏氨酸；3)含酰胺的侧链天冬酰胺及谷氨酰胺；4)芳族侧链苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸；5)碱性侧链赖氨酸、精氨酸及组氨酸；6)酸性侧链天冬氨酸及谷氨酸；及7)含硫的侧链半胱氨酸及甲硫氨酸。保守性氨基酸替换组为缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸及天冬酰胺-谷氨酰胺。
或者，保守性置换为PAM250对数相似矩阵(log-likelihoodmatrix)中任何具有正值的改变，其描述于Gonnet等人，Science 2561443-45(1992)，其以引用的方式并入本文中。″适度保守性″置换为PAM250对数相似矩阵中任何具有非负值的改变。
多肽的序列相同性典型是使用序列分析软件来测量。蛋白质分析软件使用测量不同替换、缺失及其它修饰(包含保守性氨基酸替换)的相同性来匹配序列。例如包含如″Gap″及″Bestfit″等程序的GCG可采用程序特定的缺省参数来测定紧密相关的多肽间的序列同源性或序列相同性，如测定源自不同种生物的同源多肽或野生型蛋白质及其突变蛋白间的相同性。请见如GCG 6.1版。比较多肽序列亦可使用FASTA并采用缺省的或建议的参数，请见GCG 6.1版(University of WisconsinWI)。FASTA(如FASTA2及FASTA3)提供查询及检索序列间的最佳重叠区的比对及序列相同性百分比(Pearson，Methods Enzymol.18363-98(1990)；Pearson，Methods Mol.Biol.132185-219(2000))。当比较本发明序列与包含大量源自各种生物的序列的数据库时，另一优选算法为计算机程序BLAST，特别是blastp或tblastn，其使用该程序所提供的缺省参数。请见如Altschul等人，J.Mol.Biol.215403-410(1990)；Altschul等人，Nucleic Acids Res.253389-402(1997)。
比较多肽序列同源性所需的长度通常至少约16个氨基酸残基，通常为至少约20个残基，更常为至少约24个残基，典型为至少约28个残基，且优选为多于约35个残基。当检索包含大量源自各种生物的序列的数据库时，最好比较氨基酸序列。
在此所用的″标记″或″标记的″是指将另一分子掺入抗体中。于一实施方案中，标记为一种可检测的标记，如掺入放射标记的氨基酸或附着至生物素化部分的多肽，其可通过标记的抗生物素蛋白(如包含荧光标记或酶促活性的链霉抗生物素蛋白，其可由光学或比色法检测)进行检测。于另一实施方案中，标记或标记可具治疗性，如药物缀合物(drug conjugate)或毒素。标记多肽及糖蛋白的各种方法在本领域中已知且可运用。多肽的标记实例包含(但不限于)下列放射性同位素或放射性核素(如3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、荧光标记(如FITC、罗丹明(rhodamine)、镧系元素磷光体(lanthanidephosphors))、酶促标记(如辣根过氧化酶(horseradishperoxidase)、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光标记、生物素化基团、可由二级报告子(如亮氨酸拉链成对序列，二抗的结合位点、金属结合结构域、表位标签)识别的预先测定的多肽表位、磁性剂(如钆螯合物)、毒素，如百日咳毒素、紫杉醇、细胞松弛素B(cytochalasin B)、短杆菌肽D(gramicidin D)、溴化乙锭(ethidiumbromide)、吐根碱(emetine)、丝裂霉素(mitomycin)、鬼臼亚乙苷(etoposide)、替尼泊苷(tenoposide)、长春花新碱、长春花碱、秋水仙素、阿霉素、道诺红霉素(daunorubicin)、dihydroxy anthracindione、米托蒽醌(mitoxantrone)、光神霉素(mithramycin)、放线菌素D、1-脱氢睪酮、糖皮质激素、普罗卡因(procaine)、丁卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普萘洛尔(propranolol)及嘌呤霉素(puromycin)与其类似物或同源物。于某些实施方案中，标记通过不同长度的间隔臂附着以降低可能的空间障碍。
纵观本说明书及权利要求，应了解″包含(comprise)″等词或如″包含(comprises)″或″包含(comprising)″等变形意味着包含指定的整体或整体群但不排除任何其它整体或整体群。人类抗M-CSF抗体及其特性于一实施方案中，本发明提供人源化抗M-CSF抗体。于另一实施方案中，本发明提供人类抗M-CSF抗体。于某些实施方案中，人类抗M-CSF抗体的制备是通过免疫非人类转基因动物(如啮齿类动物)，其基因组包括人类免疫球蛋白基因以便啮齿类动物可产生人类抗体。
本发明抗M-CSF抗体可包括人类κ或人类λ轻链或由此衍生的氨基酸序列。于某些包括κ轻链的实施方案中，轻链可变区(VL)是部分由人类VkO12、VkL2、VkL5、VkA27或VkB3基因及Jk1、Jk2、Jk3或Jk4基因所编码。于本发明特定实施方案中，轻链可变区是由VkO12/JK3、VkL2/JK3、VkL5/JK3、VkL5/JK4、VkA27/JK4或VkB3/JK1基因编码。
于某些实施方案中，M-CSF抗体的VL相对于种系氨基酸序列包括一个或多个氨基酸替换。于某些实施方案中，抗M-CSF抗体的VL包括1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸替换(相对于种系氨基酸序列)。于某些具体实施方案中，一个或多个源自种系的替换位于轻链的CDR区。于某些具体实施方案中，相对于种系的氨基酸替换位于一个或多个与位于下列抗体中任一个或多个VL中的相对于种系的替换相同的位置上252、88、100、3.8.3、2.7.3、1.120.1、9.14.4I、8.10.3F、9.7.2IF、9.14.4、8.10.3、9.7.2、9.7.2C-Ser、9.14.4C-Ser、8.10.3C-Ser、8.10.3-CG2、9.7.2-CG2、9.7.2-CG4、9.14.4-CG2、9.14.4-CG4、9.14.4-Ser、9.7.2-Ser、8.10.3-Ser、8.10.3-CG4、8.10.3FG1或9.14.4G1。如抗M-CSF抗体的VL可包含一个或多个相对于种系的发现于抗体88的VL中的氨基酸替换，和相对于种系的见于抗体252的VL中的一个或多个其它氨基酸替换，其中抗体252使用与抗体88相同的VK基因。于某些具体实施方案中，其氨基酸改变位于参考抗体的一个或多个相同位置，但涉及不同于参考抗体的突变。
于某些具体实施方案中，相对于种系的氨基酸改变于一个或多个与抗体252、88、100、3.8.3、2.7.3、1.120.1、9.14.4I、8.10.3F、9.7.2IF、9.14.4、8.10.3、9.7.2、9.7.2C-Ser、9.14.4C-Ser、8.10.3C-Ser、8.10.3-CG2、9.7.2-CG2、9.7.2-CG4、9.14.4-CG2、9.14.4-CG4、9.14.4-Ser、9.7.2-Ser、8.10.3-Ser、8.10.3-CG4、8.10.3FG1或9.14.4G1的任一VL上的相同位置产生，但所述改变可能反映了在相对于参考抗体中的氨基酸位置上的保守性氨基酸替换基。如，若于这些抗体之一中的特定位置已相对种系发生改变且为谷氨酸，则可于该位置替代天冬氨酸。同样地，若相对于种系的氨基酸替换为丝氨酸，可于该位置以苏氨酸取代丝氨酸。保守性氨基酸替换先前已有叙述。
于某些具体实施方案中，人类抗M-CSF抗体的轻链包括与抗体252(SEQ ID NO4)、88(SEQ ID NO8)、100(SEQ ID NO12)、3.8.3(SEQID NO16)、2.7.3(SEQ ID NO20)、1.120.1(SEQ ID NO24)、9.14.4I(SEQ ID NO28)、8.10.3F(SEQ ID NO32)、9.7.2IF(SEQID NO36)、9.14.4(SEQ ID NO28)、8.10.3(SEQ ID NO44)、9.7.2(SEQ ID NO48)、9.7.2C-Ser(SEQ ID NO52)、9.14.4C-Ser(SEQID NO56)、8.10.3C-Ser(SEQ ID NO60)、8.10.3-CG2(SEQ ID NO60)、9.7.2-CG2(SEQ ID NO52)、9.7.2-CG4(SEQ ID NO52)、9.14.4-CG2(SEQ ID NO56)、9.14.4-CG4(SEQ ID NO56)、9.14.4-Ser(SEQ ID NO28)、9.7.2-Ser(SEQ ID NO48)、8.10.3-Ser(SEQ ID NO44)、8.10.3-CG4(SEQ ID NO60)8.10.3FG1(SEQ ID NO32)或9.14.4G1(SEQ ID NO28)的VL的氨基酸序列相同的氨基酸序列，或者具有多达1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个保守性氨基酸替换及/或总数多达3个的非-保守性氨基酸替换的该氨基酸序列。于某些具体实施方案中，轻链包括任何一种上述抗体的CDR1起点至CDR3末端的氨基酸序列。
于某些具体实施方案中，抗M-CSF抗体的轻链至少包括种系或在此所述的抗体序列的轻链CDR1、CDR2或CDR 3。于另一具体实施方案中，该轻链可包括独立地选自抗体252、88、100、3.8.3、2.7.3、1.120.1、9.14.4I、8.10.3F、9.7.2IF、9.14.4、8.10.3、9.7.2、9.7.2C-Ser、9.14.4C-Ser、8.10.3C-Ser、8.10.3-CG2、9.7.2-CG2、9.7.2-CG4、9.14.4-CG2、9.14.4-CG4、9.14.4-Ser、9.7.2-Ser、8.10.3-Ser、8.10.3-CG4、8.10.3FG1或9.14.4G1的CDR1、CDR2或CDR3区，或者各具有少于4个或少于3个保守性氨基酸替换及/或总计3个或更少非-保守性氨基酸替换的CDR区。于其它具体实施方案中，抗M-CSF抗体的轻链包括轻链CDR1、CDR2或CDR3，其各独立地选自具有包括选自SEQ IDNOS4、8、12、16、20、24、28、32、36、44、48、52、56或60的VL区氨基酸序列，或者由选自SEQ ID NOS3、7、11、27、31、35、43或47的编码VL区的核酸分子编码的轻链可变区的抗体的CDR1、CDR2及CDR3区。抗M-CSF抗体的轻链可包括抗体的CDR1、CDR2及CDR3区，该抗体包括选自252、88、100、3.8.3、2.7.3、1.120.1、9.14.4I、8.10.3F、9.7.2IF、9.14.4、8.10.3、9.7.2、9.7.2C-Ser、9.14.4C-Ser、8.10.3C-Ser、8.10.3-CG2、9.7.2-CG2、9.7.2-CG4、9.14.4-CG2、9.14.4-CG4、9.14.4-Ser、9.7.2-Ser、8.10.3-Ser、8.10.3-CG4、8.10.3FG1或9.14.4G1的VL区或SEQ ID NOS4、8、12、16、20、24、28、32、36、44、48、52、56或60的氨基酸序列。
于某些具体实施方案中，轻链包括抗体252、88、100、3.8.3、2.7.3、1.120.1、9.14.4I、8.10.3F、9.7.2IF、9.14.4、8.10.3、9.7.2、9.7.2C-Ser、9.14.4C-Ser、8.10.3C-Ser、8.10.3-CG2、9.7.2-CG2、9.7.2-CG4、9.14.4-CG2、9.14.4-CG4、9.14.4-Ser、9.7.2-Ser、8.10.3-Ser、8.10.3-CG4、8.10.3FG1或9.14.4G1的CDR1、CDR2及CDR3区，或者各自具有少于4个或少于3个保守性氨基酸替换及/或总数为3个或更少的非-保守性氨基酸替换的该CDR区。
关于重链，于某些具体实施方案中，重链可变区氨基酸序列是由人类VH3-11、VH3-23、VH3-7、VH1-18、VH3-33、VH3-48基因及JH4、JH6、JH4b或JH6b基因部分编码。于本发明特定具体实施方案中，重链可变区是由VH3-11/DH7-27/JH6、VH3-7/DH6-13/JH4、VH3-23/DH1-26/JH4、VH3-11/DH7-27/JH4、VH3-33/DH1-26/JH4、VH1-18/DH4-23/JH4、VH3-11/DH7-27/JH4b、VH3-48/DH1-26/JH4b、VH3-11/DH6-13/JH6b、VH3-11/DH7-27/JH4b、VH3-48/DH1-6/JH4b或VH3-11/DH6-13/JH6b基因编码。于某些具体实施方案中，抗M-CSF抗体的VH包含一个或多个相对于种系氨基酸序列的氨基酸替换、缺失或插入(添加)。于某些具体实施方案中，重链的可变区包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个相对于种系氨基酸序列的突变。于某些具体实施方案中，该突变为相对于种系氨基酸序列的非-保守性替换。于某些具体实施方案中，突变位于重链的CDR区。于某些具体实施方案中，氨基酸改变于一个或多个与源自任一个或多个抗体252、88、100、3.8.3、2.7.3、1.120.1、9.14.4I、8.10.3F、9.7.2IF、9.14.4、8.10.3、9.7.2、9.7.2C-Ser、9.14.4C-Ser、8.10.3C-Ser、8.10.3-CG2、9.7.2-CG2、9.7.2-CG4、9.14.4-CG2、9.14.4-CG4、9.14.4-Ser、9.7.2-Ser、8.10.3-Ser、8.10.3-CG4、8.10.3FG1或9.14.4G1的VH的种系的突变相同的位置上产生。于其它具体实施方案中，氨基酸改变是位于一个或多个参考抗体的相同位置，但包含不同的突变。
于某些具体实施方案中，重链包括抗体252(SEQ ID NO2)、88(SEQID NO6)、100(SEQ ID NO10)、3.8.3(SEQ ID NO14)、2.7.3(SEQID NO18)、1.120.1(SEQ.ID NO22)、9.14.4I(SEQ ID NO26)、8.10.3F(SEQ ID NO30)、9.7.2IF(SEQ ID NO34)、9.14.4(SEQ IDNO38)、8.10.3(SEQ ID NO30)、9.7.2(SEQ ID NO46)、9.7.2C-Ser(SEQ ID NO50)、9.14.4C-Ser(SEQ ID NO54)、8.10.3C-Ser(SEQ ID NO58)、8.10.3-CG2(SEQ ID NO62)、9.7.2-CG2(SEQ ID NO66)、9.7.2-CG4(SEQ ID NO70)、9.14.4-CG2(SEQ ID NO74)、9.14.4-CG4(SEQ ID NO78)、9.14.4-Ser(SEQ ID NO82)、9.7.2-Ser(SEQ ID NO86)、8.10.3-Ser(SEQ ID NO90)8.10.3-CG4(SEQ ID NO94)、8.10.3FG1(SEQ ID NO98)或9.14.4G1(SEQ ID NO102)的可变区(VH)的氨基酸序列，或者具有多达1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个保守性氨基酸替换及/或总共3个的非-保守性氨基酸替换的该氨基酸序列。于某些具体实施方案中，该重链包括任一前述抗体中自CDR1起点至CDR3末端的氨基酸序列。
于某些具体实施方案中，该重链包括抗体252、88、100、3.8.3、2.7.3、1.120.1、9.14.4I、8.10.3F、9.7.2IF、9.14.4、8.10.3、9.7.2、9.7.2C-Ser、9.14.4C-Ser、8.10.3C-Ser、8.10.3-CG2、9.7.2-CG2、9.7.2-CG4、9.14.4-CG2、9.14.4-CG4、9.14.4-Ser、9.7.2-Ser、8.10.3-Ser、8.10.3-CG4、8.10.3FG 1或9.14.4G1的重链CDR1、CDR2及CDR3区，或者各具有少于8个，少于6个，少于4个或少于3个保守性氨基酸替换及/或总共3个或更少的非-保守性氨基酸替换的该CDR区。
于某些具体实施方案中，重链如前所述包括了在此所述的抗体序列的种系或抗体CDR3，且亦可包括种系序列的CDR1及CDR2区，或者可包括抗体序列的CDR1及CDR2区，其各自独立地选自包括选自252、88、100、3.8.3、2.7.3、1.120.1、9.14.4I、8.10.3F、9.7.2IF、9.14.4、8.10.3、9.7.2、9.7.2C-Ser、9.14.4C-Ser、8.10.3C-Ser、8.10.3-CG2、9.7.2-CG2、9.7.2-CG4、9.14.4-CG2、9.14.4-CG4、9.14.4-Ser、9.7.2-Ser、8.10.3-Ser、8.10.3-CG4、8.10.3FG1或9.14.4G1抗体的重链的抗体。于另一具体实施方案中，重链包括在此所述的抗体序列的CDR3，且亦可包括CDR1及CDR2区，其各自独立地选自重链可变区的CDR1及CDR2区，该重链可变区包括选自SEQ ID NOS2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、46、50、54、58、62、66、70、74、78、82、86、90、94、98或102的VH区氨基酸序列，或者其可由选自SEQ IDNOS1、5、9、25、29、33、37、45、97或101的编码VH区的核酸序列编码。于另一具体实施方案中，该抗体包括如上所述的轻链及如上所述的重链。
一种可产生的氨基酸替换类型为将一个或多个抗体中的半胱氨酸(其可能为化学活性的)改变为另一种残基，如(不限于)丙氨酸或丝氨酸。于一具体实施方案中，存在非典型半胱氨酸的替换。该替换可位于可变区的构架区或抗体恒定区中。于另一具体实施方案中，该半胱氨酸是位于抗体的非典型(non-canonical)区。
另一种可产生的氨基酸替换类型为移除抗体中任何可能的蛋白质水解位点，特别是位于抗体中可变区的CDR或构架区或恒定区中的。替换半胱氨酸残基及移除蛋白质水解位点可减少抗体产物中任何异质性的风险并从而增强其同质性。另一类的氨基酸替换是移除可能形成脱胺作用位点的天冬酰胺-甘氨酸对，其是通过改变该残基的一或二个残基同时改变来完成。
于某些具体实施方案中，本发明抗M-CSF抗体重链的C-末端赖氨酸并不存在(Lewis D.A.等人，Anal.Chem，66(5)585-95(1994))。于本发明多个具体实施方案中，抗M-CSF抗体的重链及轻链任选包含信号序列。
一方面，本发明涉及抑制人类抗-M-CSF单克隆抗体及制备该抗体的改造的细胞系。表1列举编码下列单克隆抗体的重链及轻链的可变区的核酸及相对应的预期的氨基酸序列的序列识别码(SEQ ID NOS)252、88、100、3.8.3、2.7.3、1.120.1、9.14.4I、8.10.3F、9.7.2IF、9.14.4、8.10.3及9.7.2。另外的变异抗体9.7.2C-Ser、9.14.4C-Ser、8.10.3C-Ser、8.10.3-CG2、9.7.2-CG2、9.7.2-CG4、9.14.4-CG2、9.14.4-CG4、9.14.4-Ser、9.7.2-Ser、8.10.3-Ser、8.10.3-CG48.10.3FG1或9.14.4G1可通过本领域普通技术人员所知方法来制备。
表1
抗M-CSF抗体的种类及亚类抗M-CSF抗体的种类及亚类可通过任何本领域中已知的方法测定。通常，抗体的种类及亚类可使用对特定抗体的种类及亚类具特异性的抗体进行测定。此种抗体已商品化。种类及亚类可通过ELISA或Western印迹法(Western Blot)以及其它技术来测定。或者，种类及亚类可如下进行测定对所有或部分的抗体重链及/或轻链的恒定区进行测序，比较其氨基酸序列与已知的各种免疫球蛋白的种类及亚类的氨基酸序列，并确定抗体的种类及亚类。
于某些具体实施方案中，抗M-CSF抗体为单克隆抗体。抗M-CSF抗体可为IgG、IgM、IgE、IgA或IgD分子。于优选具体实施方案中，抗M-CSF抗体为IgG且为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚类。于另一优选具体实施方案中，该抗体为亚类IgG2或IgG4。于另一优选具体实施方案中，该抗体为亚类IgG1。
物种及分子选择性于本发明另一方面中，抗M-CSF抗体同时显示出物种及分子选择性。于某些具体实施方案中，抗M-CSF抗体可与人类、cynomologus猴及小鼠M-CSF结合。遵照说明书的教导，可使用本领域中所熟知的方法测定抗M-CSF抗体的物种选择性。例如可使用Western印迹法、FACS、ELISA、RIA、细胞增殖试验或M-CSF受体结合分析测定物种选择性。于一优选具体实施方案中，可使用细胞增殖试验或ELISA测定物种选择性。
于另一具体实施方案中，抗M-CSF抗体对M-CSF具有比其对GM-/G-CSF选择性至少大100倍的选择性。于某些具体实施方案中，抗M-CSF抗体并不会与除M-CSF外的任何其它蛋白质显示任何适宜的特异性结合。可依照说明书指示使用本领域中所熟知方法测定抗M-CSF抗体对M-CSF的选择性。例如可使用Western印迹法、FACS、ELISA或RIA测定选择性。
确认由抗M-CSF抗体识别的M-CSF表位本发明提供一种人类抗M-CSF单克隆抗体，其可与M-CSF结合并与同一表位竞争、交叉竞争及/或结合，及/或以与下列抗体相同的KD与M-CSF结合，(a)选自252、88、100、3.8.3、2.7.3、1.120.1、9.14.4I、8.10.3F、9.7.2IF、9.14.4、8.10.3、9.7.2、9.7.2C-Ser、9.14.4C-Ser、8.10.3C-Ser、8.10.3-CG2、9.7.2-CG2、9.7.2-CG4、9.14.4-CG2、9.14.4-CG4、9.14.4-Ser、9.7.2-Ser、8.10.3-Ser、8.10.3-CG4、8.10.3FG1或9.14.4G1的抗体；(b)抗体，其包括具有SEQ ID NO2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、46、50、54、58、62、66、70、74、78、82、86、90、94、98或102的氨基酸序列的重链可变区；(c)抗体，其包括具有SEQ ID NO4、8、12、16、20、24、28、32、36、44、48、52、56或60的氨基酸序列的轻链可变区；(d)抗体，其包括(b)中定义的重链可变区及(c)中定义的轻链可变区。
可通过使用本领域中已知的方法测定抗体是否可与相同表位进行结合、竞争结合、交叉竞争结合，或具有与一抗M-CSF抗体相同的KD。于一具体实施方案中，可使本发明的抗M-CSF抗体于饱和条件下与M-CSF结合，然后测量受试抗体与M-CSF结合的能力。若受试抗体与抗M-CSF抗体可于同一时间与M-CSF结合，则受试抗体与所述的抗M-CSF抗体结合不同表位。然而，若受试抗体不能同时与M-CSF结合，则受试抗体结合相同表位、重叠表位或位于人类抗M-CSF抗体所结合的表位邻近的表位。此实验可使用ELISA、RIA或FACS来进行。于一优选具体实施方案中，实验是使用BIACORETM进行。
抗M-CSF抗体对M-CSF的结合亲和力于本发明某些具体实施方案中，抗M-CSF抗体以高亲和力与M-CSF结合。于某些具体实施方案中，抗M-CSF抗体与M-CSF结合的KD为1×10-7M或以下。于其它优选具体实施方案中，抗体与M-CSF结合的KD为1×10-8M、1×10-9M、1×10-10M、1×10-11M、1×10-12M或以下。于某些具体实施方案中，KD为1pM至500pM。于其它具体实施方案中，KD为500pM至1μM。于其它具体实施方案中，KD为1μM至100nM。于其它具体实施方案中，KD为100mM至10nM。于一优选具体实施方案中，抗体以与选自下列的抗体实质相同的KD与M-CSF结合252、88、100、3.8.3、2.7.3、1.120.1、9.14.4I、8.10.3F、9.7.2IF、9.14.4、8.10.3、9.7.2、9.7.2C-Ser、9.14.4C-Ser、8.10.3C-Ser、8.10.3-CG2、9.7.2-CG2、9.7.2-CG4、9.14.4-CG2、9.14.4-CG4、9.14.4-Ser、9.7.2-Ser、8.10.3-Ser、8.10.3-CG4、8.10.3FG1或9.14.4G1。于另一优选具体实施方案中，抗体以与包括选自下列抗体的轻链CDR2和/或重链CDR3的抗体实质上相同的KD与M-CSF结合252、88、100、3.8.3、2.7.3、1.120.1、9.14.4I、8.10.3F、9.7.2IF、9.14.4、8.10.3、9.7.2、9.7.2C-Ser、9.14.4C-Ser、8.10.3C-Ser、8.10.3-CG2、9.7.2-CG2、9.7.2-CG4、9.14.4-CG2、9.14.4-CG4、9.14.4-Ser、9.7.2-Ser、8.10.3-Ser、8.10.3-CG4、8.10.3FG1或9.14.4G1。于另一优选具体实施方案中，抗体以与一种抗体实质上相同的KD与M-CSF结合，后者抗体包括具有SEQ ID NO2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、46、50、54、58、62、66、70、74、78、82、86、90、94、98或102的氨基酸序列的重链可变区，或者该抗体包括具有SEQ ID NO4、8、12、16、20、24、28、32、36、44、48、52、56或60的氨基酸序列的轻链可变区。于另一优选具体实施方案中，抗体以与一种抗体实质上相同的KD与M-CSF结合，后者抗体包括具有SEQ ID NO4、8、12、16、20、24、28、32、36、44、48、52、56或60的VL区氨基酸序列的轻链可变区的CDR2，且任选包括其CDR1及/或CDR3，或者该抗体包括具有SEQ ID NO2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、46、50、54、58、62、66、70、74、78、82、86、90、94、98或102的VH区氨基酸序列的重链可变区的CDR3，且任选包括其CDR1及/或CDR2。
于某些具体实施方案中，抗M-CSF抗体具有低解离速率。于某些具体实施方案中，抗M-CSF抗体的koff为2.0×10-4s-1或更低。于其它优选具体实施方案中，抗体以2.0×10-5或者2.0×10-6s-1或更低的Koff与M-CSF结合。于某些具体实施方案中，koff实质上与在此所述的抗体相同，如选自252、88、100、3.8.3、2.7.3、1.120.1、9.14.4I、8.10.3F、9.7.2IF、9.14.4、8.10.3、9.7.2、9.7.2C-Ser、9.14.4C-Ser、8.10.3C-Ser、8.10.3-CG2、9.7.2-CG2、9.7.2-CG4、9.14.4-CG2、9.14.4-CG4、9.14.4-Ser、9.7.2-Ser、8.10.3-Ser、8.10.3-CG4、8.10.3FG1或9.14.4G1的抗体。于某些具体实施方案中，抗体以与一种抗体实质上相同的koff与M-CSF结合，后一抗体包括(a)选自252、88、100、3.8.3、2.7.3、1.120.1、9.14.4I、8.10.3F、9.7.2IF、9.14.4、8.10.3、9.7.2、9.7.2C-Ser、9.14.4C-Ser、8.10.3C-Ser、8.10.3-CG2、9.7.2-CG2、9.7.2-CG4、9.14.4-CG2、9.14.4-CG4、9.14.4-Ser、9.7.2-Ser、8.10.3-Ser、8.10.3-CG4、8.10.3FG1或9.14.4G1的抗体的重链的CDR3，及任选包括其CDR1及/或CDR2；或(b)选自252、88、100、3.8.3、2.7.3、1.120.1、9.14.4I、8.10.3F、9.7.2IF、9.14.4、8.10.3、9.7.2、9.7.2C-Ser、9.14.4C-Ser、8.10.3C-Ser、8.10.3-CG2、9.7.2-CG2、9.7.2-CG4、9.14.4-CG2、9.14.4-CG4、9.14.4-Ser、9.7.2-Ser、8.10.3-Ser、8.10.3-CG4、8.10.3FG1或9.14.4G1的抗体轻链的CDR2，及任选包括其CDR1及/或CDR3。于某些具体实施方案中，抗体以与一种抗体实质上相同的koff与M-CSF结合，后一抗体包括具有SEQ ID NO2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、46、50、54、58、62、66、70、74、78、82、86、90、94、98或102的氨基酸序列的重链可变区；或者该抗体包括具有SEQ ID NO4、8、12、16、20、24、28、32、36、44、48、52、56或60的氨基酸序列的轻链可变区。于另一优选具体实施方案中，抗体以实质上与一种抗体相同的koff与M-CSF结合，后一抗体包括具有SEQ ID NO4、8、12、16、20、24、28、32、36、44、48、52、56或60的氨基酸序列的轻链可变区的CDR2，并任选包括其CDR1及/或CDR3；或者该抗体包括具有SEQ ID NO2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、46、50、54、58、62、66、70、74、78、82、86、90、94、98或102的氨基酸序列的重链可变区的CDR3，并任选包括其CDR1及/或CDR2。
抗M-CSF抗体对M-CSF的结合亲和力及解离速率可由本领域中已知的方法来测定。结合亲和力可由竞争性ELISAs、RLAs、表面胞质共振(如使用BIACORETM技术)来测量。解离速率可由表面胞质共振来测量。优选地，结合亲和力及解离速率可由表面胞质共振测量。更优选地，结合亲和力及解离速率可使用BIACORETM技术来测量。实施例VI中举例说明了通过BIACORETM技术测定抗M-CSF单克隆抗体的亲和力常数的方法。抗M-CSF抗体抑制M-CSF活性M-CSF与c-fms结合的抑制于另一具体实施方案中，本发明提供一种抗M-CSF抗体，其可抑制M-CSF与c-fms受体结合并阻断或防止c-fms的活化作用。于另一优选具体实施方案中，M-CSF属于人类。于另一优选具体实施方案中，抗M-CSF抗体为人类抗体。IC50可经由ELISA、RIA及基于细胞的分析如细胞增殖试验、全血单核细胞形状变化分析或受体结合抑制分析进行测量。于一具体实施方案中，抗体或其部分抑制细胞增殖，通过细胞增殖试验测量的IC50为不超过8.0×10-7M，优选为不超过3×10-7M，或者优选为不超过8×10-8M。于另一具体实施方案中，由单核细胞形状变化分析测量的IC50不超过2×10-6M，优选为不超过9.0×10-7M，或者更优选为不超过9×10-8M。于另一优选具体实施方案中，由受体结合分析测量的IC50不超过2×10-6M，优选为不超过8.0×10-7M，或者更优选为不超过7.0×10-8M。实施例III、IV及V举例了不同类型的分析。
另一方面，与无抗体的细胞增殖相比，本发明的抗M-CSF抗体抑制单核细胞/巨噬细胞响应M-CSF的增殖达至少20％，优选为40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％或100％。
制备抗体及可产生抗体的细胞系的方法免疫于某些具体实施方案中，人类抗体如下制备用M-CSF抗原对非人类动物进行免疫，其基因组中包括某些或完整的人类免疫球蛋白重链及轻链基因座。于一优选具体实施方案中，非人类动物为XENOMOUSETM动物(Abgenix Inc.，Fremont，CA)。另一种可利用的非-人类动物为Medarex制备的转基因小鼠(Medarex公司，Princeton，NJ)。
XENOMOUSETM为改造的小鼠品系，其包括大片段的人类免疫球蛋白重链及轻链基因座且小鼠抗体产生缺陷。请见如Green等人，NatureGenetics 713-21(1994)及美国专利号5,916,771、5,939,598、5,985,615、5,998,209、6,075,181、6,091,001、6,114,598、6,130,364、6,162,963及6,150,584。亦见于WO 91/10741、WO94/02602、WO 96/34096、WO 96/33735、WO 98/16654、WO 98/24893、WO 98/50433、WO 99/45031、WO 99/53049、WO 00/09560及WO 00/037504中。
另一方面，本发明提供一种由非-人类、非-小鼠动物制备抗M-CSF抗体的方法，其是以M-CSF抗原对包括人类免疫球蛋白基因座的非-人类转基因动物进行免疫。可使用上述引用的文件中的方法制造此种动物。叙述于这些文件中的方法可如美国专利5,994,619所述的方法加以修改。美国专利5,994,619描述了新颖的源自猪及牛的培养内细胞团(CICM)细胞及细胞系，及已插入异源DNA的转基因CICM细胞的制备方法。CICM转基因细胞可用于制造克隆的转基因胚胎、胎儿及后代。′619专利中亦描述制造转基因动物的方法，其可传递异源DNA至其子代。于优选具体实施方案中，非-人类动物为大鼠、绵羊、猪、山羊、牛或马。
XENOMOUSETM小鼠可产生完整人类抗体的类成人所有组成成分(adult-like human repertoire)并可产生抗原特异性人类抗体。于某些具体实施方案中，XENOMOUSETM小鼠通过导入兆碱基大小的人类重链基因座及κ轻链基因座的种系表形酵母人工染色体(YAC)片段后可包含近80％的人类抗体V基因所有组成成分。于其它具体实施方案中，XENOMOUSETM小鼠进一步包含近乎所有λ轻链基因座。请见Mendez等人，Nature Genetics 15146-156(1997)，Green和Jakobovits，J.Exp.Med.188483-495(1998)及WO 98/24893，其公开内容以引用的方式并入本文中。
于某些具体实施方案中，包括人类免疫球蛋白基因的非-人类动物为具有人类免疫球蛋白″微小基因座(minilocus)″的动物。于微小基因座研究中，藉由内含源自Ig基因座的单独基因来模拟外源性Ig基因座。依此，可将一种或多种VH基因、一种或多种DH基因、一种或多种JH基因、mu恒定区及第二恒定区(优选为γ恒定区)形成用以插入动物体中的构建体。该研究特别描述于美国专利号5,545,807、5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425、5,661,016、5,770,429、5,789,650、5,814,318、5,591,669、5,612,205、5,721,367、5,789,215及5,643,763，其以引用的方式并入本文中。
另一方面，本发明提供一种制备人源化抗M-CSF抗体的方法。于某些具体实施方案中，非-人类动物于可允许抗体产生的条件下，如下所述用M-CSF抗原免疫。从动物分离产生抗体的细胞，与骨髓瘤融合以产生杂交瘤，并分离出可编码目的抗M-CSF抗体的重链及轻链的核酸。随后使用本领域普通技术人员已知及如下进一步所述的技术改造这些核酸以降低非-人类序列含量，即，将抗体人源化以减少人体中的免疫反应。
于某些具体实施方案中，M-CSF抗原为分离及/或纯化的M-CSF。于优选具体实施方案中，M-CSF抗原为人类M-CSF。于某些具体实施方案中，M-CSF抗原为M-CSF的片段。于某些具体实施方案中，M-CSF片段为M-CSF的细胞外结构域。于某些具体实施方案中，M-CSF片段包括至少一种M-CSF的表位。于其它具体实施方案中，M-CSF抗原为一种细胞，其可于表面表达或过表达M-CSF或其免疫原性片段。于某些具体实施方案中，M-CSF抗原为一种M-CSF融合蛋白。M-CSF可使用已知技术由天然来源纯化。重组M-CSF是商业可获得的。
动物的免疫可由本领域中已知的任何方法进行。请见如Harlow和Lane，AntibodyA Laboratory Manual，New YorkCold Spring HarborPress，1990。免疫非-人类动物(如小鼠、大鼠、绵羊、山羊、猪、牛及马)的方法于本领域中所熟知。请见如前述的Harlow和Lane，及美国专利5,994,619号。于一优选具体实施方案中，M-CSF抗原是与佐剂一同给药以促进免疫应答。示范性佐剂包含弗氏(Freund′s)完全或不完全佐剂、RIBI(胞壁酰二肽)或ISCOM(免疫刺激复合物)。此种佐剂可通过将多肽隔离于局部沉积中以保护多肽免于快速消失，或者其可包含能刺激宿主分泌对巨噬细胞有趋化性的因子及其它免疫系统组分的物质。优选地，若给予多肽时，免疫方案中可包含给予一或多次多肽，延续至数周以上的时间。实施例I例示一种可于XENOMOUSETM小鼠中制备抗M-CSF单克隆抗体的方法。
抗体及抗体产生细胞系的制备以M-CSF抗原对动物进行免疫后，可由动物获得抗体及/或抗体产生细胞。于某些具体实施方案中，包含抗M-CSF抗体的血清是通过放血或处死动物由动物获得。血清可以其取自动物时的原样直接使用，可由血清获得免疫球蛋白部分，或者可由血清纯化出抗M-CSF抗体。
于某些具体实施方案中，产生抗体的无限增殖化细胞系是由免疫动物所分离的细胞所制造。免疫后，处死动物并将淋巴结及/或脾脏B细胞永生化。永生化细胞的方法包含(但不限于)以致癌基因对其进行转染、以致癌基因病毒对其进行感染、于可选择永生化细胞的条件下进行培养、以致癌性或致突变化合物处理、将其与已永生化的细胞(如骨髓瘤细胞)融合以及失活肿瘤抑制基因。请见如前述Harlow和Lane。若采用与骨髓瘤细胞融合的方法，骨髓瘤细胞优选为不分泌免疫球蛋白多肽(非-分泌性细胞系)的。永生化细胞是使用M-CSF、其部分或表达M-CSF的细胞来进行筛选。于一优选具体实施方案中，最初的筛选是使用酶联免疫分析法(ELISA)或放射免疫分析法进行。ELISA筛选的实例见于WO 00/37504，以引用的方式并入本文中。
将可产生抗M-CSF抗体的细胞(如杂交瘤)加以选择、克隆并进一步筛选其所需的特性，包含强劲生长力、高抗体产量及所需的抗体特性，如下进一步讨论的。杂交瘤可于同系的(syngeneic)动物、缺乏免疫系统的动物(如裸鼠)的体内或于体外细胞培养中来进行扩展。选择、克隆及扩展杂交瘤的方法为本领域普通技术人员所熟知。
于一优选具体实施方案中，该免疫动物为非-人类动物，其可表达人类免疫球蛋白基因且脾脏B细胞可与源自该非-人类动物相同物种的骨髓瘤细胞系融合。于一优选具体实施方案中，该免疫动物是XENOMOUSETM动物且该骨髓瘤细胞系为一种非-分泌性小鼠骨髓瘤。于一优选具体实施方案中，骨髓瘤细胞株为P3-X63-AG8-653。请见实施例I。
因此于一具体实施方案中，本发明提供制备能产生针对M-CSF的人类单克隆抗体或其片段的细胞系的方法，其包括(a)以M-CSF、M-CSF部分或可表达M-CSF的细胞或组织对在此所述的非-人类转基因动物进行免疫；(b)使转基因动物产生对M-CSF的免疫应答；(c)由转基因动物分离B淋巴细胞；(d)永生化B淋巴细胞；(e)产生永生化B淋巴细胞的单独单克隆细胞群；及(f)筛选永生化的B淋巴细胞以确认针对M-CSF的抗体。
另一方面，本发明提供可产生人类抗M-CSF抗体的杂交瘤。于一优选具体实施方案中，该杂交瘤为如上述的鼠杂交瘤。于其它具体实施方案中，该杂交瘤可于非-人类，非-小鼠物种中制备，如大鼠、绵羊、猪、山羊、牛或马。于另一具体实施方案中，该杂交瘤为人类杂交瘤。
于另一优选具体实施方案中，转基因动物以M-CSF进行免疫，初级细胞(如脾脏或外周血细胞)由免疫转基因动物分离出并确认能产生特异于目的抗原的单独细胞。将源自各独立细胞的聚腺苷酸化mRNA分离并进行反转录聚合酶链反应(RT-PCR)，使用有义引物，其与可变区序列退火，如可识别大部分或全部人类重链与轻链可变区基因的FR1区的简并引物，及反义引物，其可与恒定区或接合区序列退火。随后将重链与轻链可变区的cDNA克隆并表达于任何适当宿主细胞中(如骨髓瘤细胞)，所表达的嵌合抗体拥有分别的免疫球蛋白恒定区，如重链及κ或λ恒定区。请见Babcook，J.S.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA937843-48，1996，其以引用的方式并入本文中。然后以在此所述方法确任并分离抗M-CSF抗体。
于另一具体实施方案中，噬菌体展示技术可用于提供包含具有对M-CSF不同亲和力的抗体的所有组成成分的文库。为制备该所有组成成分，不需将源自免疫动物的B细胞永生化。反之，初级B细胞可直接做为DNA来源。得自B细胞(如源自脾脏)的cDNA混合物可用于制备表达文库，如转染至大肠杆菌(E.coli)的噬菌体展示文库。测试所产生细胞对M-CSF的免疫活性。可自该文库鉴别出高亲和力人类抗体的技术描述于Griffiths等人，EMBO J.，133245-3260(1994)；Nissim等人，出处同上，692-698页及Griffiths等人，出处同上，12725-734。最后，自该文库中确认出可产生对抗原产生所需的结合亲和力的克隆，并将可编码负责该结合的产物的DNA回收及用于标准重组表达操作。噬菌体展示文库亦可使用先前操作的核苷酸序列来构建并以类似方式进行筛选。可编码重链及轻链的cDNA通常是独立提供或连接形成Fv类似物以产生噬菌体文库。
随后于噬菌体文库中筛选对M-CSF具有最高亲和力的抗体并由适当克隆收集遗传物质。更多轮的筛选可增加所分离原始抗体的亲和力。
另一方面，本发明提供可产生人类抗M-CSF抗体的杂交瘤。于一优选具体实施方案中，该杂交瘤为如上所述的小鼠杂交瘤。于其它具体实施方案中，该杂交瘤可于非-人类、非-小鼠物种(如大鼠、绵羊、猪、山羊、牛或马)中产生。于另一具体实施方案中，该杂交瘤为人类杂交瘤。
制作抗体的核酸、载体、宿主细胞及重组方法核酸本发明亦包含编码抗M-CSF抗体的核酸分子。于某些具体实施方案中，由不同核酸分子编码抗M-CSF免疫球蛋白的重链及轻链。于其它具体实施方案中，同一核酸分子编码抗M-CSF免疫球蛋白的重链及轻链。于一具体实施方案中，核酸编码本发明的M-CSF抗体。
于某些具体实施方案中，编码轻链的可变区的核酸分子包括人类VKL5、O12、L2、B3、A27基因及JK1、JK2、JK3或JK4基因。
于某些具体实施方案中，编码轻链的核酸分子编码在种系氨基酸序列包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个突变的氨基酸序列。于某些具体实施方案中，核酸分子所包括的核苷酸序列编码与种系序列相比包括1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个非-保守性氨基酸替换及/或1、2或3非一保守性替换的VL氨基酸序列。替换可位于CDR区、构架区，或于恒定区中。
于某些具体实施方案中，核酸分子编码与种系序列相比包括一个或多个变异的VL氨基酸序列，其与见于抗体252、88、100、3.8.3、2.7.3、1.120.1、9.14.4I、8.10.3F、9.7.2I F、9.14.4、8.10.3、9.7.2、9.7.2C-Ser、9.14.4C-Ser、8.10.3C-Ser、8.10.3-CG2、9.7.2-CG2、9.7.2-CG4、9.14.4-CG2、9.14.4-CG4、9.14.4-Ser、9.7.2-Ser、8.10.3-Ser、8.10.3-CG4、8.10.3FG1或9.14.4G1之一的VL中的变异相同。
于某些具体实施方案中，与种系序列相比，核酸分子编码至少三种见于抗体252、88、100、3.8.3、2.7.3、1.120.1、9.14.4、8.10.3或9.7.2之一的VL中的氨基酸突变。
于某些具体实施方案中，该核酸分子包括一种核苷酸序列，其可编码单克隆抗体252(SEQ ID NO4)、88(SEQ ID NO8)、100(SEQ IDNO12)、3.8.3(SEQ ID NO16)、2.7.3(SEQ ID NO20)、1.120.1(SEQID NO24)、9.14.4I(SEQ ID NO28)、8.10.3F(SEQ ID NO32)、9.7.2IF(SEQ ID NO36)、9.14.4(SEQ ID NO28)、8.10.3(SEQ IDNO44)、9.7.2(SEQ ID NO48)、9.7.2C-Ser(SEQ ID NO52)、9.14.4C-Ser(SEQ ID NO56)、8.10.3C-Ser(SEQ ID NO60)、8.10.3-CG2(SEQ ID NO60)、9.7.2-CG2(SEQ ID NO52)、9.7.2-CG4(SEQ ID NO52)、9.14.4-CG2(SEQ ID NO56)、9.14.4-CG4(SEQ ID NO56)、9.14.4-Ser(SEQ ID NO28)、9.7.2-Ser(SEQ ID NO48)、8.10.3-Ser(SEQ ID NO44)、8.10.3-CG4(SEQ ID NO60)、8.10.3FG1(SEQ ID NO32)或9.14.4G1(SEQ ID NO28)的VL氨基酸序列或其部分。于某些具体实施方案中，该部分至少包括CDR2区。于某些具体实施方案中，核酸可编码该抗体的轻链CDR的氨基酸序列。于某些具体实施方案中，该部分为包括CDR1-CDR3的连续部分。
于某些具体实施方案中的核酸分子包括一种核苷酸序列，其可编码SEQ ID NOS4、8、12、16、20、24、28、32、36、44、48、52、56或60之一的轻链氨基酸序列。于某些优选具体实施方案中，核酸分子包括SEQ ID NOS3、7、11、27、31、35、43或47的轻链核苷酸序列或其部分。
某些具体实施方案中，核酸分子所编码的VL氨基酸序列与下列序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％相同显示于图1的VL氨基酸序列或抗体252、88、100、3.8.3、2.7.3、1.120.1、9.14.4I、8.10.3F、9.7.2IF、9.14.4、8.10.3、9.7.2、9.7.2C-Ser、9.14.4C-Ser、8.10.3C-Ser、8.10.3-CG2、9.7.2-CG2、9.7.2-CG4、9.14.4-CG2、9.14.4-CG4、9.14.4-Ser、9.7.2-Ser、8.10.3-Ser、8.10.3-CG4、8.10.3FG1或9.14.4G1中任一种抗体的VL氨基酸序列，或任一SEQ ID NOS4、8、12、16、20、24、28、32、36、44、48、52、56或60的氨基酸序列。本发明核酸分子包含核酸，其可于高度严格条件(如上所述)与下列核酸序列杂交编码SEQ ID NOS4、8、12、16、20、24、28、32、36、44、48、52、56或60的轻链氨基酸序列的核酸序列或具有SEQ ID NOS3、7、11、27、31、35、43或47的轻链核酸序列的核酸序列。
于另一具体实施方案中，该核酸编码选自下列抗体的全长轻链252、88、100、3.8.3、2.7.3、1.120.1、9.14.4I、8.10.3F、9.7.2IF、9.14.4、8.10.3、9.7.2、9.7.2C-Ser、9.14.4C-Ser、8.10.3C-Ser、8.10.3-CG2、9.7.2-CG2、9.7.2-CG4、9.14.4-CG2、9.14.4-CG4、9.14.4-Ser、9.7.2-Ser、8.10.3-Ser、8.10.3-CG4、8.10.3FG1或9.14.4G1或编码包括SEQ ID NOS4、8、12、16、20、24、28、32、36、44、48、52、56或60的氨基酸序列的轻链及轻链恒定区，或者包括突变的轻链。此外，该核酸可包括SEQ ID NOS3、7、11、27、31、35、43或47的轻链核苷酸序列及编码轻链恒定区的核苷酸序列，或编码包括突变的轻链的核酸分子。
于另一优选具体实施方案中，该核酸分子编码重链的可变区(VH)，其包括人类VH1-18、3-33、3-11、3-23、3-48或3-7基因序列或由其所衍生的序列。于不同具体实施方案中，核酸分子包括人类VH1-18基因、DH4-23基因及人类JH4基因；人类VH3-33基因、人类DH1-26基因及人类JH4基因；人类VH3-11基因、人类DH7-27基因及人类JH4基因；人类VH3-11基因、人类DH7-27基因及人类JH6基因；人类VH3-23基因、人类DH1-26基因及人类JH4基因；人类VH3-7基因、人类DH6-13基因及人类JH4基因；人类VH3-11基因、人类DH7-27基因及人类JH4b基因；人类VH3-48基因、人类DH1-26基因5及人类JH4b基因；人类VH3-11基因、人类DH6-13基因及人类JH6b基因或源自该人类基因的序列。
于某些具体实施方案中，与人类V、D或J基因的种系氨基酸序列比较，该核酸分子所编码的氨基酸序列包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个突变。于某些具体实施方案中，该突变位于VH区。于某些具体实施方案中，该突变位于CDR区。
于某些具体实施方案中，相较于种系序列，该核酸分子编码一个或多个氨基酸突变，其与见于单克隆抗体252、88、100、3.8.3、2.7.3、1.120.1、9.14.4I、8.10.3F、9.7.2IF、9.14.4、8.10.3、9.7.2、9.7.2C-Ser、9.14.4C-Ser、8.10.3C-Ser、8.10.3-CG2、9.7.2-CG2、9.7.2-CG4、9.14.4-CG 2、9.14.4-CG4、9.14.4-Ser、9.7.2-Ser、8.10.3-Ser、8.10.3-CG4、8.10.3FG1或9.14.4G 1的VH的氨基酸突变相同。于某些具体实施方案中，相较于种系序列，该核酸编码至少三个氨基酸突变，其与见于上列单克隆抗体中的至少三个氨基酸突变相同。
于某些具体实施方案中，核酸分子包括核苷酸序列，其可编码下列抗体中至少部分的VH氨基酸序列252(SEQ ID NO4)、88(SEQ ID NO8)、100(SEQ ID NO12)、3.8.3(SEQ ID NO16)、2.7.3(SEQ ID NO20)、1.120.1(SEQ ID NO24)、9.14.4I(SEQ ID NO28)、8.10.3F(SEQID NO32)、9.7.2IF(SEQ ID NO36)、9.14.4(SEQ ID NO28)、8.10.3(SEQ ID NO44)、9.7.2(SEQ ID NO48)、9.7.2C-Ser(SEQ IDNO52)、9.14.4C-Ser(SEQ ID NO56)、8.10.3C-Ser(SEQ ID NO60)、8.10.3-CG2(SEQ ID NO60)、9.7.2-CG2(SEQ ID NO52)、9.7.2-CG4(SEQ ID NO52)、9.14.4-CG2(SEQ ID NO56)、9.14.4-CG4(SEQ ID NO56)、9.14.4-Ser(SEQ ID NO28)、9.7.2-Ser(SEQ ID NO48)、8.10.3-Ser(SEQ ID NO44)、8.10.3-CG4(SEQ ID NO60)8.10.3FG1(SEQ ID NO32)或9.14.4G1(SEQ ID NO28)，或者该序列具有保守性氨基酸突变及/或总计3个或更少的非保守性氨基酸替换。于不同具体实施方案中，该序列编码一个或多个CDR区，优选为CDR3区、全部3个CDR区、包含CDR1-CDR3的连续部分或整个VH区。
于某些具体实施方案中，核酸分子包括重链核苷酸序列，其编码SEQ ID NOS2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、46、50、54、58、62、66、70、74、78、82、86、90、94、98或102之一的氨基酸序列。于某些优选具体实施方案中，核酸分子至少包括SEQ ID NO1、5、9、25、29、33、37、45、97或101的重链核苷酸序列的一部分。于某些具体实施方案中，该部分编码VH区、CDR3区、全部3个CDR区或包含CDR1-CDR3的连续区。
于某些具体实施方案中，核酸分子编码VH氨基酸序列，其与显示于图4中的VH氨基酸序列或与SEQ ID NOS2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、46、50、54、58、62、66、70、74、78、82、86、90、94、98或102中任何一种VH氨基酸序列至少有70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％相同。本发明核酸分子包含在高度严格条件下(如前所述)可与下列核苷酸序列进行杂交的核酸编码SEQ ID NOS2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、46、50、54、58、62、66、70、74、78、82、86、90、94、98或102的重链氨基酸序列的核苷酸序列，或为具有SEQ ID NOS1、5、9、25、29、33、37、45、97或101的核苷酸序列。
于另一具体实施方案中，该核酸编码选自252、88、100、3.8.3、2.7.3、1.120.1、9.14.4I、8.10.3F、9.7.2I F、9.14.4、8.10.3、9.7.2、9.7.2C-Ser、9.14.4C-Ser、8.10.3C-Ser、8.10.3-CG2、9.7.2-CG2、9.7.2-CG4、9.14.4-CG2、9.14.4-CG4、9.14.4-Ser、9.7.2-Ser、8.10.3-Ser、8.10.3-CG4、8.10.3FG1或9.14.4G1的抗体的完整重链，或具有SEQ ID NOS2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、46、50、54、58、62、66、70、74、78、82、86、90、94、98或102的氨基酸序列的重链及重链的恒定区，或包括突变的重链。此外，该核酸可包括SEQ ID NOS1、5、9、25、29、33、37、45、97或101的重链核苷酸序列及编码轻链恒定区的核苷酸序列或编码包括突变的重链的核酸分子。
编码抗M-CSF抗体的重链或完整轻链的核酸分子或其部分可由任何能产生此种抗体的来源分离。于各种具体实施方案中，核酸分子是由以M-CSF免疫的动物所分离的B细胞分离或由源自此种表达抗M-CSF抗体的B细胞的无限增殖化细胞所分离。分离编码抗体的mRNA的方法于本领域中所熟知。请见如Sambrook等人。mRNA可用于产生cDNA以用于聚合酶链反应(PCR)或抗体基因的cDNA克隆。于一优选具体实施方案中，该核酸分子分离自杂交瘤，该杂交瘤具有来自非-人类转基因动物的产生人类免疫球蛋白的细胞作为其融合配偶体之一。于一优选具体实施方案中，可产生人类免疫球蛋白的细胞由XENOMOUSETM动物分离。于另一具体实施方案中，可产生人类免疫球蛋白的细胞是源自如上述的非-人类、非-小鼠转基因动物。于另一具体实施方案中，核酸是分离自非-人类、非-转基因动物。也可采用分离自非-人类、非-转基因动物的核酸分子，用于例如人源化抗体。
于某些具体实施方案中，编码本发明抗M-CSF抗体重链的核酸可以包括编码本发明VH区的核苷酸序列，其符合读框的与得自任何来源的编码重链恒定区的核苷酸序列相连接。同样地，编码本发明抗M-CSF抗体轻链的核酸分子可以包括编码本发明VL区的核苷酸序列，其符合读框的与得自任何来源的编码轻链恒定区的核苷酸序列连接。
于本发明更进一步的方面，编码重链(VH)及轻链(VL)可变区的核酸分子转化为全长的抗体基因。于一具体实施方案中，编码VH或VL区的核酸分子通过插入表达载体转化为全长抗体基因，其中该表达载体已可分别编码重链(CH)或轻链(CL)的恒定区，以便VH部分可操作连接至载体中的CH部分，而VL部分可操作连接至载体中的CL部分。于另一具体实施方案中，可编码VH及/或VL区的核酸分子能通过连接转化为全长抗体基因，如使用标准分子生物技术连接编码VH及/或VL区的核酸分子及编码CH及/或CL区的核酸分子。人类重链及轻链免疫球蛋白恒定区基因的核酸序列已为本领域中所知。请见如Kabat等人，Sequences of Proteinsof Immunological Interest，第5版，NIH Publ.No.91-3242，1991。编码全长重链及/或轻链的核酸分子接着可导入细胞中进行表达并分离抗M-CSF抗体。
该核酸分子可用于重组表达大量的抗M-CSF抗体。该核酸分子亦可用于制备嵌合抗体、双特异性抗体、单链抗体、免疫粘附素、二体、突变的抗体及抗体衍生物，请见以下进一步叙述。若核酸分子是源自非人类、非转基因动物，该核酸分子可用于进行抗体人源化，其亦如下所述。
于另一具体实施方案中，本发明核酸分子可做为特异抗体序列的探针或PCR引物。例如，该核酸可于诊断方法中做为探针或做为PCR引物以扩增可使用的DNA区，特别是，用以分离编码抗M-CSF抗体的可变区的另外核酸分子。于某些具体实施方案中，该核酸分子为寡核苷酸。于某些具体实施方案中，寡核苷酸来自目的抗体的重链与轻链的高度可变区。于某些具体实施方案中，寡核苷酸编码下列抗体的一个或多个CDR的全部或部分抗体252、88、100、3.8.3、2.7.3或1.120.1或其在此所述的变体。
载体本发明提供包括核酸分子的载体，该核酸分子可编码本发明的抗M-CSF抗体的重链或其抗原结合部分。本发明亦提供包括核酸分子的载体，该核酸分子可编码该抗体的轻链或其抗原结合部分。本发明还提供包括核酸分子的载体，该核酸分子可编码融合蛋白、经修饰抗体、抗体片段及其探针。
于某些具体实施方案中，本发明抗M-CSF抗体或其抗原结合部分通过将编码部分或全长轻链及重链的DNA(如前述方法取得)插入至表达载体中以便该基因可操作地连接至必需的表达控制序列(如转录及翻译控制序列)而表达。表达载体包含质体、反转录病毒、腺病毒、腺相关病毒(AAV)、植物病毒如花椰菜花叶病毒、烟草花叶病毒、粘粒、YACs、EBV衍生的游离基因等。该抗体基因可连接至载体以便载体内的转录及翻译控制序列提供其所需的调节抗体基因转录及翻译的功能。所选择的表达载体及表达控制序列应能与所采用的表达宿主细胞相容。该抗体轻链基因及抗体重链基因可插入不同的载体中。于一优选具体实施方案中，两种基因可以插入同一表达载体中。该抗体基因可通过标准方法(如连接抗体基因片段及载体上的互补限制性部位，或者若无限制性部位则采平端连接反应)插入表达载体中。
一种便利的载体为编码功能性的完整人类CH或CL免疫球蛋白序列的载体，并具有适当改造的限制位点以便任何VH或VL序列可容易地插入及表达，如前所述。于此种载体中，剪接通常发生于插入的J区中剪接供体部位以及为于人类C区前的剪接受体部位之间，且亦发生在人类CH外显子中所产生的剪接区。聚腺苷酸化作用及转录终止发生于编码区下游的天然染色体部位。重组表达载体亦可编码一种信号肽，其可促进抗体链由宿主细胞分泌。该抗体链基因可克隆入载体中以便信号肽可符合读框地连接至该免疫球蛋白链的氨基端。信号肽可为免疫球蛋白信号肽或异源的信号肽(即源自非-免疫球蛋白蛋白质的信号肽)。
除抗体链基因外，本发明的重组表达载体携带可控制宿主细胞中抗体链基因表达的调节序列。本领域普通技术人员应了解表达载体的设计(包含选择调节序列)应依据如下因素选择用以转化的宿主细胞、所需的蛋白质表达水平等。对哺乳动物宿主细胞表达而言，优选的调节序列包含可指挥哺乳动物细胞中高水平蛋白质表达的病毒性元件，如来自反转录病毒LTRs、巨细胞病毒(CMV)(如CMV启动子/增强子)、猿病毒40(SV40)(如SV40启动子/增强子)、腺病毒(如腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))、多形瘤及强哺乳动物启动子(如天然免疫球蛋白及肌动蛋白启动子)的启动子及/或增强子。有关病毒调节元件及其序列的进一步描述，请见如美国专利号5,168,062、美国专利号4,510,245及美国专利号4,968,615。可于植物中表达抗体的方法，包含启动子及载体的描述，以及植物的转化已为本领域所知。请见如美国专利第6,517,529号，其以引用的方式并入本文中。可于细菌细胞或真菌细胞(如酵母细胞)中表达多肽的方法亦于本领域中所熟知。
除抗体链基因及调节序列外，本发明的重组表达载体可带有另外的序列，如能调节宿主细胞中载体复制的序列(如复制起点)及可选择的标记基因。可选择的标记基因可帮助选择已导入载体的宿主细胞(请见如美国专利号4,399,216、4,634,665及5,179,017)。如典型的选择性标记基因会对导入载体的宿主细胞赋予对药物(如G418、潮霉素或氨甲蝶呤)的抗性。优选的选择性标记基因包含二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于具有氨甲蝶呤选择性/放大作用的dhfr-宿主细胞)、新霉素抗性基因(用于G418选择)及谷氨酸合成酶基因。
重组生产蛋白质的非-杂交瘤宿主细胞及方法编码抗M-CSF抗体的核酸分子及包括这些核酸分子的载体可用来转移感染适当的哺乳动物、植物、细菌或酵母宿主细胞。转化可藉任何已知方法将多核苷酸导入至宿主细胞中。将异源多核苷酸导入哺乳动物细胞中的方法于本领域中所熟知，且其包含葡聚醣-介导的转染、磷酸钙沉淀、polybrene-介导的转染、原生质体融合、电穿孔法、将多核苷酸封装于脂质体中及直接显微注射DNA至核中。此外，核酸分子可通过病毒载体导入至哺乳动物细胞种。转化细胞的方法于本领域中所熟知。请见如美国专利号4,399,216、4,912,040、4,740,461及4,959,455(这些专利是以引用的方式并入本文中)。转化植物细胞的方法于本领域中所熟知，包含如土壤杆菌属(Agrobacterium)-介导的转化、biolistic转化、直接注射、电穿孔法及病毒转化。转化细菌及酵母细胞的方法也是本领域中所熟知。
可用于表达宿主的哺乳动物细胞系于本领域中所熟知，且包含许多来自美国典型培养物保藏中心((American Type CultureCollection)ATCC)的无限增殖细胞系。这些包含，特别是，中国仓鼠卵巢细胞(CHO)细胞、NSO、SP2细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人类肝细胞癌细胞(如Hep G2)、A549细胞及许多其它的细胞系。特别优选细胞系的选择是根据测定那一种细胞系具有高表达水平。其它可使用的细胞系为昆虫细胞系，如Sf9细胞。如下产生抗体，将编码抗体基因的重组表达载体导入哺乳动物宿主细胞后，培养宿主细胞一段时间使其足以在宿主细胞中表达抗体，或者优选地，抗体可分泌至宿主细胞所生长的培养基中。抗体可使用标准蛋白质纯化方法由培养基中回收。植物宿主细胞包含如烟草属(Nicotiana)、鼠耳芥属(Arabidopsis)、浮萍、玉米、小麦、马铃薯等。细菌性宿主细胞包含大肠杆菌(E.coli)及链霉菌属种(streptomyces species)。酵母宿主细胞包含粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)及巴斯德毕赤氏酵母(Pichiapastoris)。
此外，源自制备细胞系的本发明抗体(或其它所属部分)的表达可使用许多已知技术来提高。如谷氨酰胺合成酶基因表达系统(GS系统)为一种于某些条件下常见的加强表达的方法。有关GS系统全部或部分讨论于欧洲专利号0 216 846、0 256 055及0 323 997与欧洲专利申请89303964.4。
由不同细胞系或转基因动物表达的抗体可能会具有彼此不同的糖基化。然而，所有由在此所提供的核酸分子所编码的抗体或包括在此所提供的氨基酸序列皆为本发明的部分，无论抗体的糖基化状态或模式或修饰。
转基因动物及植物本发明的抗M-CSF抗体也可以通过如下方式转基因产生产生目的免疫球蛋白重链及轻链序列的转基因哺乳动物或植物并由此制备可恢复的抗体。涉及哺乳动物的转基因产生，抗M-CSF抗体可在山羊奶、牛奶或其它哺乳动物的乳汁中产生及回收。请见如美国专利号5,827,690、5,756,687、5,750,172及5,741,957。于某些具体实施方案中，如上所述，用M-CSF或其免疫原性部分对包括人类免疫球蛋白基因座的非人类转基因动物进行免疫。于植物、酵母或真菌/藻类中制备抗体的方法描述于如美国专利号6,046,037及5,959,177中。
于某些具体实施方案中，非-人类转基因动物或植物的制备是通过标准转基因技术导入一种或多种编码本发明抗M-CSF抗体的核酸分子至动物或植物中。请见Hogan及美国专利号6,417,429，如前所述。用于制造转基因动物的转基因细胞可为胚胎干细胞或体细胞细胞。转基因的非-人类生物可为嵌合、非嵌合杂合子及非嵌合型纯合子。请见如Hogan等人，Manipulating the Mouse EmbryoA Laboratory Manual2ed.，Cold Spring Harbor Press(1999)；Jackson等人，MouseGenetics and TransgenicsA Practical Approach，OxfordUniversity Press(2000)；及Pinkert，Transgenic AnimalTechnologyA Laboratory Handbook，Academic Press(1999)。于某些具体实施方案中，转基因的非-人类动物含有被靶向的分裂处(targeted disruption)并由编码目的重链及/或轻链的靶向构建体来置换。于一优选具体实施方案中，转基因动物包括并表达编码可与M-CSF优选为人类M-CSF特异性结合的重链及轻链的核酸分子。于某些具体实施方案中，转基因动物包括编码经修饰的抗体(如单链抗体、嵌合抗体或人源化抗体)的核酸分子。抗M-CSF抗体可于任何转基因动物中制造。于一优选具体实施方案中，非-人类动物为小鼠、大鼠、绵羊、猪、山羊、牛或马。非-人类转基因动物于血液、乳汁、尿液、唾液、泪液、粘液及其它体液中表达该编码的多肽。
噬菌体展示文库本发明提供一种制备抗M-CSF抗体或其抗原结合部分的方法，其包括如下步骤在噬菌体上合成人类抗体文库，筛选含有M-CSF或其部分的文库，分离可与M-CSF结合的噬菌体，并由该噬菌体取得抗体。例如，一种制备抗体文库用于噬菌体展示技术的方法包括如下步骤以M-CSF或其抗原部分免疫包括人类免疫球蛋白基因座的非-人类动物以便引起免疫应答，由经免疫的动物提取可产生抗体的细胞；由该提取的细胞分离RNA，将RNA反转录以产生cDNA，使用引物扩增cDNA，并将cDNA插入噬菌体展示载体以便抗体可于噬菌体上表达。本发明的重组抗M-CSF抗体可以此方式获得。
本发明的重组抗M-CSF人类抗体可通过筛选重组的组合抗体文库来分离。该抗体文库优选为scFv噬菌体展示文库，其是使用由B细胞所分离的mRNA所制备的人类VL及VHcDNA所产生。可制备及筛选此种文库的方法为本领域中已知。已有可供产生噬菌体展示文库的商品化试剂盒(如Pharmacia Recombinant Phage Antibody System，目录号27-9400-01；及Stratagene SurfZAPTM噬菌体展示试剂盒，目录号240612)。亦有其它可用于产生及筛选抗体展示文库的方法及试剂(请见于如美国专利号5,223,409、PCT
发明者瓦埃·拜帝恩, 梅德亥·那拉辛亥·黛维拉雷杰, 约瑟·艾德文·罗, 詹姆斯·雷司里·摩伯雷, 西瑞德-艾咪·凯勒曼, 岸恩·福尔茨, 玛丽·哈克-福伦德丘 申请人:沃尼尔·朗伯有限责任公司, 安进弗里蒙特公司