专利名称：：生产脱胶的脂肪酸烷基酯的制作方法
技术领域：
：本发明涉及生产脱胶的(degummed)脂肪酸烷基酯，即其中杂质(如磷月旨)含量降低的脂肪酸烷基酯的筒化方法。该方法包括通过在一溶液中使用一种或多种脂解酶和一种或多种磷脂酶将脂肪和油转变成脂肪酸烷基酯。
背景技术：
：生物柴油，其通常被分类为源自植物或动物脂肪和油的脂肪羧酸的烷基酯，近来由于其环境裨益而变得越来越具有吸引力。虽然生物柴油目前用化学方法通过酯基转移作用成功生产(例如使用NaOH和/或曱醇钠(sodiummethoxide)作为催化剂)，有若干相关问题限制了其发展，例如由于高含量的游离脂肪酸而需对油进行预加工、从酯和甘油相中除去化学催化剂、在甘油回收过程中除去无机盐、和在酯基转移步骤之前降低磷脂含量。通过使用脂解酶作为催化剂很大程度上防止了化学催化剂带来的缺点，近年来人们已经对使用脂肪酶、并在酯基转移作用中进行或不进行固定化来生产生物柴油发生兴趣。真菌酯酶可以用于酯的酶促生产，在此方法中其可代替催化剂，如无机酸(例如硫酸、氯化氢和氯磺酸)，I、II、III和IV族金属的两性氢氧化物，和其它。现有技术已描述了酶在酯合成中的用途，特别是根据酶命名法(国际生物化学与分子生物学联盟命名委员会的建议，1992或更迟)归类于EC3.1.1羧酸酯水解酶的酶。WO88/02775公开了来自CawWda的脂肪酶A和B。其说明Caw&daa"torc"ca脂肪酶B(CALB)对酯合成更有效。角质酶是能够水解底物角质的脂解酶。角质酶已知来自各种真菌(P.E.Kolattukudyin"Lipases",Ed.B.Borgstr6mandH.L.Brockman,Elsevier1984，471-504)。来自特异腐质霉(/fw附/co/fl/rao/em)的角质酶的氨基酸序列已公布(US5,827,719)。许多研究者报道说，在有机溶剂存在下可达到烷基酯的高产量，但是由于有机溶剂的毒性和可燃性，更希望在无溶剂的介质中进行脂肪酶催化的醇解(alcoholysis)。已显示由脂肪酶催化的甲醇分解在不含有机溶剂的含水系统中发生。在这样的系统中，对曱醇较不敏感的脂肪酶是有利的(Kaiedaetal.J.Biosci.Bioeng.2001，91:12-15)。众所周知，过量短链醇例如曱醇可4吏脂肪酶严重失活。然而，为了将油完全转变成其相应的曱基酯，至少需要三摩尔当量的曱醇。Du等(Biotechnol.Appl.Biochem.2003，38:103-106)比较地研究了油/曱醇摩尔比在不连续分批和连续分批操作过程中的效应。为了防止脂肪酶失活，通过在整个反应过程中逐步添加曱醇来保持曱醇低浓度(Shimadaetal.JMol.CatalysisEnzymatic,2002，17:133-142;Xuetal.2004,Biocat.Biotransform.22:45-48)。在EC3丄1.3中定义的真菌脂肪酶可被用于甘油三酯的醇解，并代替碱性化学催化剂，例如曱醇钠或氢氧化钾。Bouturetal.(J.Biotechnol.1995，42:23-33)报道了来自Cam^^de/wmara的脂肪酶，其能催化甘油三酯(TG)的醇解和游离脂肪酸(FFA)的酯化，但二者不是在相同的反应条件下。在Bouturetal.描述的条件下，仅酯化得到催化。为了能够更经济地生产脂肪酸烷基酯用于生物柴油，需要更简单和集成的过程，使脂肪和油更快地转变成其相应的曱基或乙基酯，在所述转变过程中有更高产率，并将工艺设备所需的投资减到最少。此外，通过对含程中得到的脂肪和油含有杂质，例如主要由磷脂、以及脂肪酸、色素(pigment)、气味成分等组成的极性脂质。需要通过精炼过程除去这些杂质，所述精炼过程可能需要脱胶步骤。使用各种物理和化学方法来使油脱胶(如Bochisch,M.在FatsandOilsHandbook,AOCSPress,1998，p.428-433所描述的)。本领域已知使用磷脂酶用于食用油的酶促脱胶(US5,264,367;JP-A-2153997;和EP622446)，以降低所述水脱胶的油中的磷含量。酶促脱胶条件在Clausen,KinEur.J.LipidSci.Technol.103(2001)，333-340中描述。关键步骤是柠檬酸处理、将pH调节至大约5.0、添加酶和使用高剪切混合器进行混合。发明概述本发明涉及生产具有低杂质水平的脂肪酸烷基酯的方法，所述脂肪酸烷基酯例如脂肪酸曱基酯(FAME)和脂肪酸乙基酯，所述杂质例如磷脂。本发明的方法通过将两个加工步骤组合成一个单一加工步骤而得以简化，因此在经济上更便宜。所述方法包括混合水、醇、甘油三酯和/或游离脂肪酸，以及一种或多种脂解酶和选自A,、A2、B型和溶血磷脂酶的一种或多种磷脂酶。随后将含有甘油、残余的酶和大多数被水解的磷脂的水相与非水相分离，由此降低非水相中的磷脂含量。脂解酶和磷脂酶在同一混合物中的组合允许从甘油三酯和/或游离脂肪酸中快速、简便和高产率地生产磷降低的脂肪酸烷基酯。本发明的方法的混合物在水相中具有相对高的醇浓度。如上所述，这对于由脂肪酶进行的酯基转移作用(transesterification)而言是有利的。在现有技术中，已报道了微生物裤脂酶在高浓度有机溶剂中相对不稳定(参见Songetal,BiochemicaetBiophysicaActa,1547(2001)370-378)。因此，令人惊讶的是，在本发明方法中的酶促脱胶步骤(通过磷脂酶进行的磷脂酶促水解)与通过脂肪酶所进行的酯基转移作用在相同条件下发生。此外，本发明涉及如上所述使用脂解酶和磷脂酶生产磷降低的脂肪酸烷基酯的分批方法或连续、分阶段的方法，其中连续或逐步加入醇，并且其中酶被回收或仅使用一次。此外，酶可被固定在二氧化硅;朱上，或游离在溶液中。应该强调的是，本发明的方法所生产的脂肪酸烷基酯不单单用于生物柴油，也可用作石油化学工业更下游过程中的基本石油化学产品。磷降低的短语"磷降低的"指含磷成分(如磷月旨)的含量被降低。非水相中的不能水合的磷脂被磷脂酶水解，并转变成能水合的磷脂，其随后被从油相提取入水相。脂肪相中的磷含量通过Clausen,KinEur.J,LipidSci.Technol.103(2001)，333-340中描述的方法测量。根据本文的实施例，其为24小时反应时间后的P值。因此，本发明的磷降低的脂肪酸烷基酯含有不超过500ppm的磷，优选不超过200ppm的磷，更优选不超过100ppm的磷，更优选不超过75ppm的磷，更优选不超过50ppm的磷，更优选不超过^ppm的磷，更优选不超过30ppm的磷，更优选不超过25ppm的磷，更优选不超过20ppm的磷，更优选不超过15ppm的磷，更优选不超过10ppm的磷，甚至更优选不超过5ppm的石岸，最Y尤选不超过lppm的石寿。发明详述本发明涉及生产具有低杂质水平的脂肪酸烷基酯的方法，所述脂肪酸烷基酯例如脂肪酸曱基酯(FAME)和脂肪酸乙基酯，所述杂质例如磷脂。本发明的方法通过将两个加工步骤组合成一个单一加工步骤而得以简化，因此在经济上更便宜。所述方法包括混合水、醇、甘油三酯和/或游离脂肪酸，以及一种或多种脂解酶和选自A,、A2、B型和溶血磷脂酶的一种或多种磷脂酶。随后将含有甘油、残余的酶和大多数被水解的磷脂的水相通过静置、过滤或离心与非水相分离，由此降低非水相中的磷脂含量。底物根据本发明用来生产脂肪酸烷基酯的合适底物为多种多样的植物油和脂肪；油菜籽油和大豆油是最常用的，虽然其它农作物例如芥菜(mustard)、向日葵、芸苔(canola)、椰子、大麻(hemp)、棕榈的油和甚至藻类也显示出应用前景。底物可以是粗制的、或水脱胶品质的、或进一步加工的(精炼的、漂白的和除臭的)。也可使用动物脂肪，包括牛脂(tallow)、猪油(lard)、家禽、海产油(marineoil)以及废弃的植物和动物脂肪和油，通常称为黄色和棕色油脂。合适的脂肪和油可以是纯甘油三酯，或在废弃的植物油和动物脂肪中常见的甘油三酯和游离脂肪酸的混合物。底物也可获自植物油除臭剂蒸馏物。底物中的脂肪酸类型包括那些在植物和动物脂肪和油中作为甘油酯天然存在的那些。仅举几例，这些包括油酸(oleicacid)、亚油酉吏(linoleicacid)、亚麻酉交(linolenicacid)、才宗才阁&复(palmeticacid)牙口月才圭酉臾(lauricacid)。粗制植物油中的次要成分典型地是磷脂、游离脂肪酸和偏甘油酯(partialglyceride)，即单酸甘油酯和甘油二酯。在本文中使用时，短语"脂肪酸残基，，指脂肪酸，其或者是游离的，或者如在甘油三酯、甘油二酯、单酸甘油酯或脂肪酸烷基酯中是酯化的。原油中的磷脂含量可为0.5-3%w/w不等，相应于磷含量在200-10,000ppm的范围，更优选在250-1200ppm的范围。除磷脂外，原油还含有低浓度的碳水化合物、糖化合物和Ca、Mg和Fe的金属/磷脂酸复合物(metal/phosphatideacidcomplexes)。生物柴油脂肪酸烷基酯，例如脂肪酸曱基酯(FAME)和脂肪酸乙基酯也被称为生物柴油，因为它们被用作化石柴油(fossildiesel)的添加物。因为生物柴油生产自可更新的资源，其构成基于石油(fossiloil)的柴油燃料的曰益重要的添加物或代替物。藍用于本发明方法的醇优选为具有1-5个碳原子(d-C5)的低级醇。优选的醇是曱醇和乙醇。脂解酶本发明方法的脂解酶可以是选自来自下组的脂解酶和脂解酶变体的一种月旨角罕酶C朋d/(iaflwtorc"ca、//j^/202ywas;.、近平滑念J朱菌(C""d/(ia/^ra/z577os7'力、铍落念王朱菌(Ca"(i/(iflrwgcwa)、洋葱j叚单月包菌(i^ew/omowcwcepac/a)、白i也霉(Geo^'cwmcawd/t/wm)、曼赫才艮毛霉(W/z/zcw7wcorw/e/e/)、隐J求菌属菌种(CV7toc0ccMspp.)S陽2、近平滑念3朱菌、特异腐质霉(7/謂/co/az>wo/e—和纟田毛嗜热霉(77ze渭麵^yc&y/a"wg7.wos^)(以前称为疏棉状腐质霉(//"照'0^/0"^/"0^))。所述脂解酶包括脂肪酶、角质酶和酰基转移酶，并可与选自由上述菌种组成的组的脂解酶具有60%同一性。优选地，本发明的方法的脂解酶与选自由上述菌种组成的组的脂解酶具有70%同一性，更优选75%同一性，更优选80%同一性，更优选85%同一性，更优选90%同一性，更优选95%同一性，甚至更优选97或98%同一性，或最优选99%同一性。优选的脂解酶是根据WO00/60063的细毛嗜热霉(以前称为疏棉状腐质霉))脂肪酶变体、亲本细毛嗜热霉脂肪酶和C""&Wa朋torc/7,ca月旨肪酶B。另一方面，本发明包括两种不同的脂解酶，其中第一种脂解酶的特征在于与游离脂肪酸相比其对甘油三酯显示出更高活性，而第二种脂解酶与甘油三酯相比对游离脂肪酸显示出更高活性。因此，将第一种脂解酶定义为对甘油三酯的活性(测量为甘油三酯变为脂肪酸烷基酯的转化率)与对游离脂肪酸(FFA)的活性(测量为FFA变为脂肪酸烷基酯的转化率)的比率在0.2以下的脂解酶。将第二种脂解酶定义为对甘油三酯的活性(测量为甘油三酯变为脂肪酸烷基酯的转化率)与对FFA的活性(测量为FFA变为脂肪酸烷基酯的转化率)的比率在0.5以上的脂解酶。磷脂酶优选地，用于本发明的方法的磷脂酶(PL)为荻自微生物的磷脂酶，所述微生物优选丝状真菌、酵母、或细菌，并选自A!、A2、B型磷脂酶和溶血石舞月旨酶(lyso-phospholipases)。就本发明而言，如本文中所使用的，术语"获自"连同具体的微生物来源是指酶和由此编码所述酶的DNA序列是由该具体来源产生的。酶因而通过标准的已知方法从所述具体来源获得，以使本领域技术人员能获得包含酶的样品，并能用于本发明的方法。所述标准方法可以是从所述具体来源直接纯化，或克隆编码所述酶的DNA序列，然后在相同来源(同源重组表达)或在不同来源(异源重组表达)中重组表达。更优选地，用于本发明方法的磷脂酶获自镰孢属(i^san'Mm)内的丝状真菌菌种,例长口大刀镰孑包cw/worwm)、异孑包镰孑包(FwsaWww/zeferas^oram)、腐皮镰孑包(Fi^ar/wmso/"m-)的菌才朱,或尤其是尖镰孑包(Fwsan'wmra:，/www)的菌牙朱；或曲霉属(Aperg/〃w)内的丝状真菌菌种，例如泡盛曲霉C^/wg/〃wawamo",)、臭曲霉(J^sperg〃/ws^e/7'(iM力、日本曲霉(^5perg7'〃Ms乂apom'CM力、黑曲霉(y^pwgi〃z""扭r)或尤其是米曲霉(/^/ew7/w^w少z"e)的菌抹。合适的镰孢属磷脂酶的实例公开于1)Tsung-Cheetal.(Phytopathologicalnotes58:1437-38(1968))(来自腐皮镰孑包CF^ar/wmso/am')的石舞月旨酶)；和2)欧洲专利申请No.97610056.0,其披露了合适的大刀镰孢磷脂酶(参见该文件的实施例18)和合适的尖镰孢磷脂酶(参见实施例1-17)。合适的曲霉属磷脂酶公开于3)EP575133,其披露了多种不同的曲霉属磷脂酶(参见权利要求14),并特别是来自米曲霉(Awyzae)的磷脂酶(权利要求17或18)和来自黑曲霉(Am'ge。的磷脂酶(权利要求19);和4)DE19527274A1，其披露了合适的曲霉属制备物(参见实施例)。此外，被认为包含曲霉属磷脂酶的商业上可得到的磷脂酶制备物DegommaVOD(Roehm,Germany)适合被用于本发明的方法。优选的磷脂酶是公开于WO00/32758实施例5中的细毛嗜热霉磷脂酶变体，和商业产品免Lecitase^Ultra(NovozymesA/S，Denmark)。酶可作为冻干粉、固定化的或在水溶液中施用。就本发明而言，可根据Needleman,S.B.andWunsch,C.D.，(1970),JournalofMolecularBiology,48,443-45中描述的方法，利用多肽序列比较的如下设定来合适地确定同一性程度GAP生成罚分3.0，GAP延伸罚分O.l。可以借助GCG程序包中提供的例如称为GAP的计算机程序进行确定(ProgramManualfortheWisconsinPackage,Version8,August1994,GeneticsComputerGroup,575ScienceDrive,Madison,Wisconsin,USA53711》两个给定序列可以根据Needleman(见上)描述的方法使用相同参数加以比对。这可借助GAP程序(见上)进行。此外，本发明涉及使用如上所述的第一种和第二种脂解酶生产脂肪酸烷基酯的分批方法和/或连续、分阶段的方法，其中连续或逐步加入醇，并且其中酶被回收或仅使用一次。如果酶在水相中，则此相可通过倾析器(decanter)、沉降器或通过离心与脂肪相分离。在连续过程中，可以对两相(分别是油相和水相)逆流进4亍加工。Kosugi,Y;Tanaka,H.andTomizuka,(1990),BiotechnologyandBioengineering,vol.36，617-622描述了通过固定化的脂肪酶水解一直物油的连续、逆流过程。对制备磷降低的脂肪酸烷基酯的一般性描述将包含甘油三酯和/或脂肪酸的底物与醇，优选曱醇或乙醇混合，并在往复振荡水浴(200rpm)上加热至30-70°C,优选大约50°C。优选加入水，将溶液混合，并进一步加热至所需温度。加入酶，将溶液剧烈混合，于所需温度(优选50。C)和200rpm置于往复振荡水浴中反应。反应混合物中的各相可通过使用高剪切混合器，例如来自Silverson或IKALabortechnik类型的高剪切混合器进行混合，如在植物油的酶促脱胶中所使用的(Clausen,K.(2001),EuropeanJournalofLipidScienceandTechnology,vol.103,333-340)。通常，酶促脱胶于pH3-7时发生。为了对过程进行优化，通常需要调节pH以适合该过程的其它条件，包括底物类型和螯合剂浓度。优选pH4-5。/[脂肪酸残基]摩尔比应为至少0.1和最大10,优选在0.3-5的范围，更优选0.4-2。可随时间逐步向反应中加入醇。水可分开加入，或在水性酶溶液中加入。反应混合物中水的终浓度可为0-50%(w/w)、优选5-40%、更优选5-30%。底物包含l-99。/。(w/w)甘油三酯，优选在75-90%范围。此外，底物可包含总计0.01-95%(w/w)的游离脂肪酸，优选在0.01-30%的范围。此外，也可存在单酸甘油酯、甘油二酯和磷脂。可通过在一定反应时间后从反应混合物中取出样品来跟踪反应进程。样品于14000rpm离心14分钟。上层由不溶于水相的脂肪物质组成，通过'HNMR(用CDCl3作为溶剂)对其进行分析。酶促处理后分离水相和油相。可通过传统手段，例如离心、倾析或沉降器进行此分离。所加入的脂解酶的量可以根据对三丁酸甘油酯(tributyrin)的脂解活性(LU)来确定。可使用阿拉伯树胶(gumAbrabic)作乳化剂通过乳化三丁酸甘油酉旨(甘油三丁酸酯(glycerintributyrate))来制备脂解酶底物。在30。C、pH7水解三丁酸甘油酯，随后进行pH恒稳的(pH-stat)滴定实验。一脂肪酶活性单位(lLU)等于每分钟能够在标准条件下释放1iamol丁酸的酶量。如Clausen,K.Eur.J.LipidSci.Technol.103(2001),333-340所述测定24小时反应时间后脂肪相中的磷含量。通过添加螯合剂可进一步优化本发明的方法，所述螯合剂螯合反应混合物中的金属成分，因而增加水相中可水合磷脂的量。螯合剂例如柠檬酸或乙二胺四乙酸(EDTA)可以基于油含量以0.01-1%w/w的范围加入。优选的量是0.04-0.1%。在从排出的水相中除去含磷化合物后，通过将水相回混入包括新底物的反应混合物，可完全或部分回收存在于水相中的酶。通过用吸收磷脂及其它物质的二氧化硅进行处理，可进一步降低反应混合物脂肪相中含磷成分的含量。克隆编码脂解酶或磷脂酶的DNA序列使用本领域已熟知的各种方法，可从生产所述酶的任何细胞或微生物中分离编码亲本脂解酶或磷脂酶的DNA序列。首先，可以使用来自产生待研究的酶的生物体的染色体DNA或信使RNA,构建基因组DNA和/或cDNA文库。然后，如果已知脂解酶或磷脂酶的氨基酸序列，可以合成标记编码脂解酶或磷脂酶的克隆。可替换地，使用杂交和较低严紧度的洗涤条件，可将含有与另一已知脂解酶或磷脂酶基因同源的序列的标记寡核苷酸探针用作探针以鉴定相关的编码酶的克隆。鉴定编码脂解酶或磷脂酶的克隆的另一方法涉及将基因组DNA片段插入表达载体，例如质粒中，用所得到的基因组DNA文库转化角质酶阴性细菌，然后将转化的细菌涂布在含有脂解酶或磷脂酶底物(即甘油三S旨)的琼脂上，从而允许鉴定出表达脂解酶的克隆。可替换地，可通过已建立的标准方法，例如S丄.BeaucageandM.H.Caruthers,(1981),TetrahedronLetters22,p.1859-1869描述的亚磷酰胺(phosphoroamidite)方法，或Matthesetal.,(1984),EMBOJ.3,p.801-805描述的方法，合成地制备编码酶的DNA序列。在亚磷酰胺方法中，合成寡核芬酸(例如在自动DNA合成仪中)，纯化，退火，连接，并克隆至适当载体中。最后，DNA序列可以是混合的基因组和合成来源的、混合的合成和cDNA来源的、或混合的基因组和cDNA来源的，其根据标准技术通过连接合成的、基因组的或cDNA来源的片段(适当时，片段对应于整个DNA序列的各个部分)来制备。也可使用特定引物通过聚合酶链式反应(PCR)制备DNA序列，例如在US4,683,202或R.K.Saikietal.，(1988),Science239,1988，pp.487-491中所描述的。表达载体携带编码本发明方法的脂解酶或磷脂酶的DNA序列的重组表达载体可以是可方便地进行重组DNA步骤的任何载体，并且载体的选择通常取决于待引入载体的宿主细胞。载体可以是当引入宿主细胞时被整合入宿主细胞基因组、并与已整合入载体的染色体一起复制的载体。合适的表达载体的实例包括pMT838。本发明的表达载体也可包含合适的转录终止子，并且在真核细胞中包含聚腺苷化序列，其与编码本发明方法的脂解酶或磷脂酶的DNA序列可操作连接。终止和聚腺苷化序列可合适地与启动子源自同一来源。载体可进一步包含使得载体在所述宿主细胞中复制的DNA序列。这些序列的例子是质粒pUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMBl和pIJ702的复制起点。质粒也可包含选择标记，例如，其产物对宿主细胞中的缺陷进行补偿的基因，例如来自枯草芽孢杆菌(B.^to7/力或地衣芽孢杆菌(及//c/zemy^m/力的dal基因，或赋予抗生素抗性如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性的基因。此外，载体可包含曲霉属选择标记，如amdS、argB、niaD和sC,产生潮霉素抗性的标记，或者所述选择可通过共转化完成，例如WO91/17243中所描述的。用来连接分别编码角质酶变体、启动子、终止子和其它元件的本发明DNA构建体，并将它们插入含有复制所需信息的合适载体的方法对于本领i或4支术人员而言是熟知的(参见，例如Sambrooketal.，MolecularCloning:ALaboratoryManual,2ndEd.，ColdSpringHarbor,1989)。启动子在载体中，DNA序列应该与合适的启动子序列可操作地连接。启动子可以是在所选择的宿主细胞中显示转录活性的任何DNA序列，并可源自编码与宿主细胞同源或异源的蛋白质的基因。用于指导编码脂解酶或磷脂酶的DNA序列的转录，尤其是在细菌宿主中的转录的合适启动子的例子是大肠杆菌/ac操纵子的启动子、天蓝色链霉菌0S^e/3tow少c^￡/^0/0。琼脂糖酶基因dagA启动子、地衣芽孢杆菌a-淀粉酶基因(amyL)的启动子、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽糖淀粉酶基因(amyM)的启动子、解淀粉芽孢杆菌(x-淀粉酶基因(amyQ)的启动子、枯草芽孢杆菌xylA和xy旧基因的启动子等。对于在真菌宿主中的转录，有用的启动子的例子是那些源自编码米曲霉TAKA淀粉酶的基因的启动子，酿酒酵母(Sacc/zaramyceycerevWae)的TPI(磷酸丙糖异构酶)启动子(Alberetal.(1982),J.Mol.Appl.Genet1,p.419-434)，曼赫根毛霉(i/z/zcwwcwm/e/ze/)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性a-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性a-淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、曼赫根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶、或构巢曲霉乙酰胺酶启动子。宿主细胞将包含如上所定义的本发明的DNA构建体或表达载体的、产生用于本发明方法的酶的宿主细胞，有利地用作重组生产脂解酶或磷脂酶的宿主细胞。可以方便地通过将DNA构建体(以一个或多个拷贝)整合入宿主染色体来用编码脂解酶或磷脂酶的DNA构建体转化所述细胞。这种整合通常被认为是优点，因为DNA序列更有可能在细胞中稳定地保持。可以根据传统方法，例如通过同源或异源重组，将DNA构建体整合入宿主染色体。可替换地，可如上所述结合不同的宿主细胞类型用表达载体转化细胞。宿主细胞可以是较高等生物体，例如哺乳动物或昆虫的细胞，特别是微生物细胞，例如细菌或真菌(包括酵母)细胞。合适的细菌的例子为革兰氏阳性细菌，例如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟緩芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、杣烂芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌，或浅青紫链霉菌或鼠灰链霉菌，或革兰氏阴性细菌例如大肠杆菌。可例如通过原生质体转化或通过使用感受态细胞以本身(perse)已知的方式实现细菌的转化。酵母生物体可有利地选自酵母属或裂殖酵母属的菌种，例如酿酒酵母。宿主细胞也可以是丝状真菌，例如属于曲霉属的菌种，特别是米曲霉或黑曲霉的菌抹，或镰孢属的菌抹，例如尖镰孢、禾本科镰孢(F^an'Mmgram/"eflrwm)(在完全阶段称为玉蜀黍赤霉(GA6ew〃azeae)，先前称为iS^/agn'a与GV66g/-e〃flra化wm和GV66e"〃"f.sp.Cerea/Zs同义)或石克色嫌孑包(Fwsan'wmsw/p/zweMm)(在咒全卩介,爻一尔为GV&6gre〃a/wr/can5,与Fwsan'w附fn'c/zof/zec/o/cies"、^干孑包^犬镰孑包(FwsaWMm6ac^7Wo/cfey)、冲妾骨木镰孑包(Fws(3n'M附5fifw6wc/"w附)、净分纟工镰孑包(Fw"〃'w附royeww)牙口4分纟工镰孑包禾本牙牛哭体(Fwsan'Mmroei/mvar.GVam/"earww)同义)、禾谷嫌孑包(尸i^an'wmcerea/zi)(与Fwsan'wwcraMwe〃e"se同义)或银片嫌孑包(Fwsan'Mmve"ewa/ww7)的菌才朱。在具体的实施方式中，宿主细胞是蛋白酶缺陷或蛋白酶阴性(minus)菌抹。这可例如是称为"alp"的碱性蛋白酶基因缺失的蛋白酶缺陷菌株米曲酶JaL125。该菌抹描述于WO97/35956(NovoNordisk)。已知的方式再生细胞壁的方法来进行转化。曲霉属作为宿主微生物的用途在EP238023(NovoNordiskA/S)中描述，其内容在此？I入作为参考。通过培养转化体生产脂解酶或磷脂酶可通过包括在有益于生产所述酶的条件下培养宿主细胞和从细胞和/或培养基中回收酶的方法产生用于本发明方法的酶。用于培养细胞的培养基可以是任何适于培养所述宿主细胞、并获得本发明的脂解酶表达的常规培养基。合适的培养基可获自供应商，或可根据公开的配方来制备(例如在美国典型培养物保藏中心的目录中所描述的)。由宿主细胞分泌的脂解酶或磷脂酶可以方便地通过已知方法从培养基中回收，包括通过离心或过滤从培养基中分离细胞，并借助盐如硫酸铵沉淀培养基的蛋白质成分，然后使用层析方法如离子交换层析、亲和层析等。实施例粗制油菜籽油的酯基转移作用和脱胶使用脂解酶和磷脂酶从粗制油菜籽油中形成磷降低的脂肪酸曱基酯脂解酶根据WO00/60063的细毛嗜热霉脂肪酶变体，剂量4000LU/8克油磷脂酶根据WO00/32758实施例5的细毛嗜热霉磷脂酶变体(活性10,000LU/g)，剂量30ppm或100ppm(分别对应于300和1000LU/kg油)。底物100%粗制油菜籽油，8克。曱醇含量基于油1.5摩尔当量，1.72ml。基于油重量30%&0。取样时间3小时和24小时。反应温度50。C。在往复振荡水浴(200rpm)上将底物-曱醇混合物加热至50。C。加入去离子水(体积取决于所加的酶体积；水总量2.40ml其包括来自酶添加的水)，对应于油的30w/w%。将混合物加热至50°C。然后将酶(脂肪酶和磷脂酶)加入混合物，在高剪切混合器(UltraTurraxT25,IKAJankeandKunkel，Germany)上混合30秒，然后在振荡水浴中放置24小时(往复振荡，50。C、200rpm)。分别在3和24小时反应时间后从反应混合物取出样品，在14000rpm离心14分钟。上层由不溶于水相的脂肪物质组成，通过iHNMR(使用CDC13作为溶剂)Varian400MHz光谱仪(VarianInc.CA,USA)对其进行分析。脂肪酸残基变为脂肪酸曱基酯的转化率通过来自脂肪酸甲基酯-COOC^3的曱基信号(3.70ppm)与来自脂肪酸残基C压CH2-的曱基信号(1.0-0.9ppm)的比率来确定。在无脂肪酶和磷脂酶的实验中没有发现曱基酯形成，在仅有磷脂酶的实验中也没有发现曱基酯形成。24小时反应时间后，脂肪相中的磷含量如Clausen,K.Eur.J.LipidSci.Technol.103(2001)，333-340所述确定。表1酶处理后的磷含量和曱基酯形成<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>很显然，在一步法中组合脂解酶与磷脂酶导致甘油三酯高度地转变为曱基酯，并导致含磷成分的低含量。权利要求1.生产磷降低的脂肪酸烷基酯的方法，其包括将醇、包含甘油三酯和/或脂肪酸的底物与一种或多种脂解酶和一种或多种磷脂酶和水混合。2.权利要求1的方法，其中脂肪酸烷基酯的磷含量降低至不超过50ppm，优选不超过40ppm，优选不超过30ppm,优选不超过25ppm,优选不超过20ppm，更优选不超过15ppm,更优选不超过10ppm，甚至更优选不超过5ppm，最^f尤选不超过lppm。3.根据权利要求1或2的方法，其中所述底物进一步包含游离脂肪酸，优选按重量计0.01-95%范围的游离脂肪酸。4.根据权利要求1-3的方法，其中所述甘油三酯源自一种或多种植物油原料、油菜籽油、大豆油、芥子油、葵花籽油、菜籽油、椰子油、大麻油、棕榈油、妥尔油、动物脂肪包括牛脂、猪油、家禽和鱼油，所述油和脂肪可以是粗制的、水脱胶的、废弃的或精炼品质的。5.根据权利要求l-4的方法，其中醇和脂肪酸残基的摩尔比最小为0.1、最大为10，优选在0.3-5的范围，更优选0.4-2。6.根据权利要求1-5的方法，其中所述醇是曱醇或乙醇。7.前述权利要求中任一项的方法，其中所述反应混合物包含多至50%(w/w)的水。8.前述权利要求中任一项的方法，其中所述温度是30-70。C,优选大约50。C。9.前述权利要求中任一项的方法，其中所述脂解酶与选自来自下组的月旨角罕酶具有60%同一'1~生CawAWaJwtorc"ca、i7>p/w2yma、近平滑念J朱菌、皱落念珠菌、洋葱假单胞菌、白地霉、曼赫根毛霉、隐球菌属菌种S-2、近平滑念珠菌和细毛嗜热霉。10.前述权利要求中任一项的方法，其中所述磷脂酶与选自下组的磷脂酶具有60%同一性来自镰孢属、曲霉属和嗜热霉属的磷脂酶。11.权利要求10的方法，其中所述磷脂酶选自下组来自如下菌抹的磷脂酶大刀镰孢、异孢镰孢、腐皮镰孢、尖镰孢、泡盛曲霉、臭曲霉、曰本曲霉、黑曲霉、米曲霉和细毛嗜热霉。12.前述权利要求中任一项的方法，其中基于油含量在0.01-1%w/w，优选0.04-0.1%w/w的范围加入螯合剂。13.前述权利要求中任一项的方法，其中所述过程以分批模式进行。14.前述权利要求中任一项的方法，其中所述过程以连续模式进行。15.前述权利要求中任一项的方法，其中用高剪切混合器将反应混合物中的溶液相混合。16.前述权利要求中任一项的方法，其中所述过程以逆流模式进行。17.前述权利要求中任一项的方法，其中所述包括酶的水相被全部或部分再循环入反应混合物，所述混合物还包含新底物。全文摘要本发明涉及生产具有低杂质水平的脂肪酸烷基酯的方法，所述脂肪酸烷基酯例如脂肪酸甲基酯(FAME)和脂肪酸乙基酯，所述杂质例如磷脂。本发明的方法通过将两个加工步骤组合成一个单一加工步骤而得以简化，因此在经济上更便宜。所述方法包括将水、醇、甘油三酯和/或游离脂肪酸与脂解酶和磷脂酶混合。随后将含有甘油、残余的酶和大多数被水解的磷脂的水相与非水相分离，由此降低非水相中的磷脂含量。文档编号C12P7/62GK101194019SQ200680020644公开日2008年6月4日申请日期2006年6月13日优先权日2005年6月13日发明者汉斯·C·霍尔姆,珀·M·尼尔森,莫滕·W·克里斯坦森申请人:诺维信公司