利用基因工程微生物生产的细胞外的多羟基链烷酸酯的制作方法

专利名称：利用基因工程微生物生产的细胞外的多羟基链烷酸酯的制作方法
技术领域：
本发明涉及多羟基链烷酸酯(polyhydroxyalkanoates， PHA)的生物合成 领域，更具体地说，本发明涉及一种基因工程微生物，其具有与PHA的代谢 特别是与其生成有关的至少一个基因。该微生物适用于PHA的工业生产。进 一步地，本发明还涉及一种生产PHA的方法。
背景技术：
多羟基链烷酸酯(PHA)是一种聚合体，该聚合体是可生物降解和生物 相容的热塑性材料(3-羟酰基脂肪酸的聚酯)，从可再生资源中获得，在工业 和生物医学中有广泛的应用(Williams and Peoples, 1996年)。PHA通过许多 细菌合成，并且由于其可能应用于替代传统的石化制作塑料从而保护环境不 被塑料废物危害而得到了广泛的研究。PHA根据其侧链长度和其生物合成方法，可分成两类。那些具有短的侧 链的，例如，(R) -3-羟酰基丁酸单元((R)-3-hydroxybutyric acid units)的同 聚物PHB，是晶体热塑性塑料，而具有长链的PHA更具有弹性。前者在大 约70年前被发现(Lemoigne and Roukhelman, 1925年)，而相对来说后者的材 料是近来才被发现的(deSmet et al., 1983， J. Bacteriol. 154: 870-78)。然而，在 这之前，同时包含(R) -3-羟酰基丁酸单元和更长的包含5到16个碳原子的 侧链(R) -3-羟酸单元的源自微生物的PHA已经被识别出来(Wallen, Rohweder， 1974, Environ. Sci. Technol. 8: 576-79)。许多生产(R) -3-羟酰基丁 酸单元和更长的包含5到16个碳原子的侧链(R) -3-羟酸单元同聚物的细菌 被发现(Steinbuchel, Wiese, 1992， Appl. Microbiol. Biotechnol. 37: 691 97; Valentin et al" 1992, Appl. Microbiol. Biotechnol. 36: 507-14; Valentin et al" Appl. Microbiol. Biotechnol. 1994, 40: 710-16; Abe et al., 1994, Int. J. Biol.Macromol. 16: 115-19; Lee & a/., 1995， Appl. Microbiol. Biotechnol. 42: 901-09; Kato & a/" 1996， Appl. Microbiol. Biotechnol. 45: 363-70; Valentin & a/.，1996， Appl. Microbiol. Biotechnol. 46: 261-67; US Patent No. 4,876,331)。这些同聚物 可被称为PHB-co-HX(此处的X是3-羟酰基链烷酸酯或链垸酸酯或具有6个 或更多碳原子的丁烯酸乙酯(alkenoate)。一个含有两种成分的同聚物的有用例 子是PHB-co-3羟基己酸酯(PHB-co隱3HH) (Brandl " a/.，1989， Int. J. Biol. Macromol. 11: 49-55; Amos & Mclnerey, 1991， Arch. Microbiol. 155: 103-06; US Patent No. 5,292,860)。
然而，尽管PHA由于它们具有作为可再生资源的生物可降解热塑性和 生物聚合物的潜在可能而得到了广泛的研究(如上所述)并且已经进行商业 生产和销售(Hmbak, O. 1992)，它们的生产成本比传统的石化塑料的成本高很 多，因此造成了广泛使用的主要障碍(Choi and Lee 1997)。如上所述，许多细 菌都生产PHA，例如，产碱杆菌属细菌(Alcaligenes eutrophus)、产碱杆菌
(Alcaligenes latus)、固氮菌(Azotobacter vinlandii)、 假单胞菌(Pseudomonas acitophila)、假单胞菌(Pseudomonas oleovarans)、大肠杆菌(Eschericha coli)、 红球菌属真养菌(Rhodococcus eutropha)、紫色色杆菌(Chromobacterium violaceum )、 光合细菌(Chromatium vinosum )、 食烷菌属石油去污菌
(Alcanivorax borkumensis)等。现有技术中已知的所有生产PHA的细菌均 在细胞内产生PHA，并将其积累在PHA颗粒中(Steinbtichel, 1991)。导致PHA 生产成本高，并因此与石化制作的塑料相比没有优势的一个主要方面是，将 PHA从细菌细胞中分离回收比较困难。为了降低PHA的总生产成本， 一个 有效的分离过程一般被认为是用下列方法对细胞进行分裂
(1) 合适的溶液，
(2) 次氯酸盐提取PHA和/或
(3) 非PHA细胞材料的消化。
但是，进行工业化生产时，现有技术中的所有已知方法需要大量的化学 试剂和/或酶，这对减少分离回收的成本来说是一个困难。因此，需要有新的 进行PHA分离回收的方法。发明内容本发明的目的是提供一个系统，可进行商业化水平的PHA生产，同时 降低生产出的PHA的分离回收成本。本发明要解决前述的技术问题，是通过提供一种满足上述需求并且可应 用在前述系统中的微生物。本发明的第一实施例涉及基因工程微生物，其在至少一个基因中具有至 少一个修饰因子，所述至少一个基因对PHA的代谢相关蛋白质进行编码，或 者，优选地，所述至少一个基因对在PHA的产生过程中干预微生物代谢的蛋 白质进行编码，其中的至少一个修饰因子引起细胞外沉积，例如，分泌PHA， 优选地，在/到培养基中通过微生物生产的中链或长链PHA。优选地，所述 微生物包括如图11、 12、 14、 16和18到25或功能片段或其不同的核苷酸片 段。更优地，所述微生物可包括如图11、 12、 14、 16和18到25的所示的功 能片段或其修饰因子的一个核苷酸序列的第180号到第680号核苷酸，优选 地包括第230号到第640号，更优地包括第310号到第550号，最优地包括 第350号到第510号核苷酸。发明者已经发现，本发明的基因工程微生物通过细胞外沉积，例如分泌 PHA (细胞内生产)在/到培养基中来生产细胞外PHA。所述沉积，例如， 微生物分泌PHA还没有在现有技术中描述过。优选地，本发明所述微生物生 产大量的PHA，优选地，过度生产PHA，并将大部分PHA产品沉积在细胞 外，而不是像现有技术中的微生物那样。细胞外沉积，例如，分泌和过量生 成PHA到培养基中，是通过改变至少一个与PHA代谢有关的多肽的基因编 码来达到的，优选地是通过在编码干扰PHA的生产的多肽(酶)的基因中的 至少一个修饰因子来得到的。本发明中的术语"多肽"也包括"肽"、"蛋白质" 或"酶"。各种编码多肽的基因与PHA的代谢有关。几个这样的基因在如图5所 示的表1中列出。因此，本发明中的基因包括任何编码与PHA代谢有关的多 肽的基因，优选地，包括任何编码与PHA的生产有关的基因。优选地，这些基因编码(不限于)PHA合酶、多(3-羟酰基链垸酸酯)合成酶、enyol-辅 酶A羟化酶和PHB合酶。另外的也与脂肪酸代谢有关酶，例如，脂肪酸合成或P氧化(多(3-羟 酰基丁酸酯)解聚酶、还原酶，或硫解酶)，也可被改变。然而，这些酶并不 特别地影响PHA合成，因此，较不希望对其修改来增加PHA的合成。优选地，需要用来生产PHA的基因并不包括在本发明的微生物中。优 选地，任何引入的PHA生产基因的修改(见上述)目的不是减少而是增加它 们的酶的活性。因此，本发明的微生物可以提供比现有技术中的微生物更高 的PHA产量。相反的是，本发明的微生物包含任何对PHA的生产有利的编码多肽的 基因。尤其是，本发明的微生物在基因编码的用例如乙酰辅酶A硫酯酶的硫 酯酶功能去除了酰基辅酶A分子的酶。根据不同的特定微生物， 一个或多个 酰基辅酶A硫酯酶作用于脂肪酸代谢。酰基辅酶A硫酯酶作用于脂肪酸代谢。 酰基辅酶A硫酯酶在具有两个这样的酶，即酰基辅酶A硫酯酶I (&"基因 编码的)和酰基辅酶A硫酯酶II， (tes^基因编码的)。硫酯酶I对C12到 C18酰基辅酶酯显示出特异性，而硫酯酶II断开C6到C18酰基辅酶酯，和 链长为C12到C18的P-羟基酰基辅酶A酯(Barnes " a/.,1970, The Journal of Biological Chemistry, vol. 245, No. 12， issue of June 25, 3122-3128)。 7fe"基因 在脂肪酸的重新开始(&"ow)生物合成的主链终止中涉及，并且调节大肠 杆菌中的从脂肪酸重新开始(&"OW)生物合成路径到脂肪酸的p-氧化的酰 基-酰基载体蛋白(acyl-ACP)媒介(Klinke, SQ " a/.，1999, Appl. Environ. Microbiol. 65: 540-548)。迄今为止，对teW基因在细菌的代谢中的生理作用 知之甚少。最近的一篇报道描述了硫酯酶II中通过断开3-羟酰基-辅酶A硫酯键， 从而将它们转化成自由的3-HAA，因此在3-羟酰基烃酸的(3-HAA)的产生 起到了重要的作用(Zweng, Z a a/.，2004, Appl. Environ. Microbiol. 70(7): 3807-3813)。本发明中，发现各种微生物表达硫酯酶，对3-羟酰基-辅酶A硫 酯这种PHA合成的原料的断开具有特别的活性。这些硫酯酶使得可以释放自由的3-HAA。然而，转化到3-HAA的反应是与PHA的合成的PHA-合成酶 竞争的，PHA-合成酶作用于同样的细胞媒介(即3-羟酰基-辅酶A)。本发明 发现，(i)释放自由的3-HAA和PHA的合成是相互干扰的的代谢途径，并且 (ii)功能敲除的特异性的硫酯酶，称为类^s5基因的硫酯酶(toB-Z汰e thioesterase)，提供了 PHA在细胞外基质中的沉积。类te^基因的功能敲除 修饰因子(下面有详述)被识别出来增加在一定个数的微生物中细胞间的3-羟酰基-辅酶A的数量，因此使得3-羟酰基-辅酶A引导代谢(作为PHA的 前体)向PHA合成进行(参考图8)。如上解释的，本发明是基于一般性发现用(R)-3-羟酰基辅酶A (敲除) 的修饰硫酯酶作为替代，使生产PHA的微生物在细胞外基质中沉积PHA。 在食垸菌(J汰fl"/vomx)、恶臭假单胞菌(/^^^/owowos;n^Wa)、铜绿假单胞 菌(尸sewdomowaw )、 丁香假单胞菌(i^ei/^/omowos 5yn.wgae)、荣光假单胞菌(尸sewdo歸"iZsy7womscms)、不动杆菌"cZ"柳6acters/ .)、新月 柄杆菌(a //o^c^a^ce"^)中，对(R)-3-羟酰基辅酶A有特异性的硫酯 酶，是类^8基因的酰基辅酶A硫酯酶，另外的生产PHA的微生物的PHA 是基于稍微不同的代谢，使用另外的酰基辅酶A硫酯酶的代谢，例如，酰基 辅酶A硫酯酶或来生产3-HAA。在任何情况下，特别用(R)-3-羟酰基辅酶A来修饰的硫酯酶来生产 3-HAA，减小硫酯酶例如类酰基辅酶A硫酯酶的活性达50%，较优达 60%，更优达至少80%，更优达90%。在特别的优选实施例中，此硫酯酶例 如类酰基辅酶A硫酯酶的活性完全被抑制。本发明也包括此处所揭示的类te^S蛋白同源族(也包括它们的编码的核 苷酸)，尤其是硫酯酶。在本发明中所指的类蛋白同源族是指在不同的 微生物中包括的不同于此处类tes5蛋白同源族的任何蛋白或肽序列，优选地 展示出与此类to5蛋白族同源族，并且展示出相似的甚至是相同的生物功會^ 本领域技术人员用本领域的方法很容易得到此处的类/e^蛋白同源族的一个 (重要)同源族，比如，采用本发明所揭示的确定序列标识或采用活性分析 来得到。根据本发明，食垸菌用两个硫酯酶来表征，即对(R)-3-羟酰基辅酶 A有特异性的酰基辅酶A类基因和脂肪酸的生产有关的酰基辅酶A硫 酯酶Z"5基因。通过进行同源族搜索(BLAST搜索)在几个生产PHA的细 菌中，发明者筛选另外的显示出与食垸菌相同的或类似的代谢结构的微生物 (具有高特异性的酰基辅酶A硫酯酶类/^5基因和另外的硫酯酶(&^5))。在食烷菌属石油去污菌(」/ca"z'wrax 6oAwme"^:s ) SK2也表达许多相 关的生产PHA的Y-蛋白细菌(例如，恶臭假单胞菌(尸"M^W20"os; ^V/a)、 铜绿假单胞菌(jPsew^fo附o"(2s flm/gi"osa)、 丁香假单胞菌(尸sew^/omo"(XS ,/"gae)、 荧光假单胞菌(尸sewcfo附o"fl51 y/womscera)、变形菌(诚oman'"flZo/A/e"57'51 )、 不动杆菌(」C/"咖6flCter S/7.)、 新月柄杆菌 (CWo6flC/W^^cewfM)。食烷菌类tes5基因蛋白在另外的微生物中命名不同，例如，命 名为类^^硫酯酶、假定的酰基辅酶A硫酯酶II或假设蛋白(hypothetical protein)。然而，应当理解，术语"类^5"目的在于包括上述各种名称的微生 物的所有的硫酯酶在内。这些食垸菌类^^基因蛋白的同源族在表4中列出 (见图10的表4)。本发明者通过用^^和类&s5蛋白的不同功能解释了在 食垸菌类的两种硫酯酶和上述的另外的微生物中，也就是和类te^B蛋白 的存在。很相似的是，类tes5蛋白不对酰基辅酶A衍生物的C6到C18起作 用，同时，类^^蛋白不断开羟酰辅酶A。此结论被早期的对te^5蛋白的研 究支持，研究显示，与大肠杆菌中的类似的硫酯酶II所不同的是(Bames a a/.ji/pra),生产PHA的浑球红假单胞菌(i /zocfoZ)(3"er5p/^eraz'cfe)(Wieczorek, RA " a/.， 1996, FEMS Microbiology Letters 135: 23-30)的硫酯酶II不能对 羟酰基辅酶A底物进行水解(Seay, T " a/.，1982, Biochemistry May 6， 25(9): 2480-2485)。在优选实施例中，本发明的微生物一般包括至少一个上述的修饰了的基 因，此处的修饰因子整合到了它的染色体中。与PHA代谢和优选地(R)-3-羟酰基辅酶A的降解有关的蛋白的至少一个 编码基因的修饰，是通过用基因工程技术在所述核苷酸序列中插入一个修饰 因子来得到的。术语"基因工程化的"("genetically engineered")(或基因修饰的)是指人为地操纵本发明的微生物的基因和/或基因产物(多肽)。接着，修饰(突变)通过序列分析来得以确认(参见作为例子的图11至14和图15 至33的核苷酸序列)。术语"修饰"(modification)包括对本发明的微生物的任何操纵和变更， 尤其是本发明所述微生物的至少一个基因。优选地，所述修饰导致所述核苷 酸序列的至少一个基因的改变， 一般是由于调节区域的修饰，例如基因的启 动子区域表达的氨基酸序列水平的表达出来。优选地，导致所述核苷酸序列 改变的修饰是通过相加、替代、删除或插入一个或多个核苷酸序列的结果。 更进一步地，所述修饰可包括微生物中的一个或多个基因的额外的复制和/ 或基因的(完全)删除。删除也可以是由于通过重组或插入转位子(transposon) 影响基因而引起。在一个优选实施例中，本发明的微生物的修饰引起编码与 生产PHA的代谢干扰有关的蛋白质的基因的完全或部分失活(例如，通过将 PHA合成路径中的中间物进行生化转化)，优选地，此蛋白质是硫酯酶，更 优地,此蛋白质是能将PHA合成路径中的中间物进行降解的硫酯酶，最优地， (特异性地)将(R)-3-羟酰基辅酶A转化成3-HAA。在最优实施例中，本发明 的微生物相对于类硫酯酶(食垸菌)或(在另外的微生物中的)同源族 是有缺陷的。此缺陷特征是由于基因水平的各种的各种修饰或者是由于减少 或破坏了相关的硫酯酶的活性即转录后的修饰减少而导致的。另外，根据本发明，与PHA合成有关的一个或多个基因的修饰可发生。 这些修饰可导致PHA合酶、聚(3-羟基丁酸酯)合成酶、enyol-辅酶A水合 酶和/或PHB合酶和/或另外的与脂肪酸代谢有关的酶。在食烷菌中编码enyol-辅酶A水合酶的基因，例如有ABO 2240、 ABO—0526、ABO—1238、 ABO—0987、 ABO—0148或ABO—1645。 enyol-辅酶A水合酶将PHA的生物合成的P氧化 与催化从卩氧化的中间产物enyol-辅酶A产生-3-羟酰基辅酶A联系起来。食 烷菌中有两种编码PHA合成的基因ABO—2214和ABO—1418。 PHA合酶催 化PHA合成的关键的最后一步。 一般来说，这些酶的酶活性由于引入的修饰 而提高了。根据本发明，基因工程微生物具有至少一个对在PHA的生产中干预代谢的蛋白质进行编码的基因，并且，优选地，具有PHA代谢中的至少一个修 饰因子。因此，所述微生物只有一个在PHA的生产中与代谢干扰有关的蛋白 的编码基因只有一个修饰因子是可能的。然而，所述微生物有在PHA的生产 中与代谢干扰有关的蛋白的同样的编码基因中或在两个(或更多)不同的基 因中有多个修饰因子也是可能的。在此情况下，多于一个的修饰因子引起不 同基因型的结果是可能的。例如，这些修饰因子中的一个可导致PHA的分泌 而另外的修饰因子引起PHA的过量生产(如下所述的)。另外，本发明的微生物也可能在具有不同功能的不同基因中有多个修饰 因子，也就是在(至少) 一个与PHA的生产的代谢干扰有关的蛋白有关的编 码基因中发生(至少) 一个修饰，同时，在(至少) 一个与PHA的生产的代 谢有关的蛋白有关的编码基因中发生(至少) 一个修饰。此外，更多的基因 可被修饰，例如，在分泌机制中的蛋白的编码基因。在这种情况下，在(至 少)一个与PHA的分泌增加有关的蛋白的编码基因中发生(至少)一个修饰， 同时，在(至少) 一个与PHA的过量生成有关的蛋白有关的编码基因中发生 (至少) 一个修饰(如下所述)。现有技术中的几个合适的基因工程技术可用来产生本发明的微生物。一 般地，任何来源的基因都可被断成若干片断并用各种方法进行修饰，包括用 微生物和它们的酶或作为分子工具的可换位的元素的方法。本发明中，甚至 可能用本发明的微生物用基因工程的方法完全构建人工的与PHA的生产的 代谢有关的蛋白有关的和/或抑制3-HAA生产有关的编码基因(例如，增加 生产的PHA的产量)。 一旦想要的基因被选择出或被创造出，它就可以被插 入到本发明的微生物中来在其中表达来产生想要的基因产物。例如，广泛的 基因工程的方法是基于分子克隆。在分子克隆中，来自任何类型的包括双链 的DNA的基因片段与载体重组并被引入到合适的寄主物中。通常所用的克 隆载体包括例如质粒和噬菌体(例如，质粒pBR322、X噬菌体，也如下所述)。 分子克隆可分成下列的步骤1、 离析和分裂源DNA (例如，基因组DNA， cDNA，合成的DNA等)2、 将DNA片段与DNA连接酶连接成克隆载体和3、例如通过转化在寄主生物(微生物)中引入并维持。因此，本发明的微生物可包括例如人工或自然基因(与强的启动子可操 作地连接)，其可过量表达PHA合成路径中的蛋白质，因此增加PHA路径中 的中间物。结果，PHA的生产量比在自然条件下高许多。另外的基因被插入 到细胞中并位于分开的例如载体(例如，质粒)DNA分子中，或者被合并到 细胞的染色体中。改变核苷酸序列的另一个优选的方法涉及基因中的特定碱基对被改成 另外的碱基对的引起的寡核苷酸的定向位点突变(参见，例如，Comack B, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, 8.01-8.5.9, Ausubel F， "fl/.，eds. 1991)。在此方法中，用如上述的方法进行合成包含感兴趣的突变 的寡核苷酸的序列。然后使此寡核苷酸与含有野生型的核苷酸序列的模板杂 交。在此方法的一个优选实施例中，所述模板是单链的模板。特别优选的是 包含如fl基因间区域这样的区域的质粒。当助手噬菌体加到噬粒的培养基中 时，此区域可以产生单链的模板。模板的寡核苷酸退火后，DNA依赖的DNA 聚合酶用来从寡核苷酸中合成与模板DNA互补的第二条链。产物是包含了 由于寡核苷酸的修饰导致的错配的异源双链核酸分子。在寄主物细胞的DNA 复制后，两种类型的质粒均存在，即野生型和新形成的突变型。此方法可使 实施人员引入方便的限制位点，例如，不管所使用的转录或翻译调节的元素 是什么，编码核苷酸序列可被替代。用于大肠杆菌的构建方法可用来构建其 它生物的类似载体，如果需要的话，仅仅用所述领域的技术人员所熟知的合 适的调节元素来替代即可。本发明的一个特别优选方法涉及转位子修饰，即一种随机的重组。此过 程通常包括在嵌入在染色体中的可移动DNA片段的末端的断裂反应，以及 这些末端在多个不同的非同源性目标DNA位点上的附着。它并不涉及异源 双链核酸分子的形成。转位子可用作突变剂而不用化学突变剂或物理突变剂。 转位子(也称为可换位的元素)可整合到染色体(例如，细菌的染色体中) 的各种位置中并引起突变(突变定义为遗传获得或人工改变的在核苷酸碱基对和/或在肽或多肽的氨基酸序列中的基本序列的改变)，其中在基因中的插 入通常导致基因功能的丧失。因此，它们提供了一种容易做到的通过染色体 来产生修饰因子的方法。转位子突变的最方便的元素是含有抗生素抗性基因 的元素。含克隆转位子的克隆可通过抗生素抗性基因菌落分离来选择。两个广泛用来引起突变的转位子是包含抗四环素(tetracycline)的标记的TnlO， 以及对新霉素(neomycin)和卡那霉素(kanamycin)有抗性的Tn5。相应地， 本发明的一个优选实施例涉及微生物，其中的至少一个修饰因子是通过转位 子突变来进行的，优选地是基于小Tn5卡那霉素元素(miniTn5 Km element) (其序列见图14和图15)转位子突变，更优地，是基于小Tn5链霉素 (streptomycin)转位子突变(见实施例1)。在本发明的优选实施例中，所述微生物包含修饰因子，其引起在如下所 述的基因下游到修饰了的基因上转位子插入后的极化效应，优选地其引起 Tn5插入后的极化效应。另一个涉及保守性的位点特异性重组包括产生很短的异源双链核酸分 子并且因此需要短的与供体和受体DNA分子相同的DNA序列。在此路径中， 在两个特殊的位点产生断开和结合，在每个参加的DNA分子中各有一个。 得到的双链分子通过转录被插入到克隆寄主物中并且选择出修饰因子。根据 两个组合位点的方向，DNA整合、DNA切除或DNA倒位可发生。通过保守 性的位点特异性重组来开启基因或关闭基因特别有用。如上所述，与PHA的生产的代谢干扰有关的蛋白的编码基因的至少一 个基因的至少一个修饰因子可导致细胞外沉积，例如，分泌微生物生产的 PHA，优选地分泌中链或长链的PHA，优选地将其分泌到周围的媒质中。因 此，本发明的微生物一般沉积，例如，分泌PHA，优选地分泌中链或长链的 PHA，优选地分泌到周围的自然媒质或培养基中。本发明中的术语"沉积"意 思是微生物释放(细胞内)生产的PHA，优选地，释放到周围的媒质中，此 媒质是包含所有需要的组分和合适的条件(营养、缓冲剂、pH、温度)适合 微生物存在和生长的培养基。所述沉积可以是由于活细胞的主动过程所致 ("分泌")和/或由于微生物(过度)生产PHA导致死亡而释放PHA所致。典型的羟基单元聚酯(PHA)包含具有5到16个碳原子的侧链羟基单元[(化)-3-羟基单元]。术语"长链PHA"的目的是为了包括含有12个，优选地包括至少 14个碳原子每个单体(分子)，其中5个到12个碳原子意思是指"中链的 PHA"。根据本发明，展示了用本发明的的微生物来过量生成PHA(见图1、 4、 6和7)。因此，与PHA的生产的代谢干扰有关的蛋白的编码基因的至少一个 基因的至少一个修饰因子可导致细胞外沉积，特别是导致有(部分)缺陷的 硫酯酶，更特别是用3-羟酰基-辅酶A作为具有高特异性的底物导致(部分) 硫酯酶(除了在培养基中沉积PHA之外)过量生成PHA，优选地生产中链 和/或长链的PHA。术语"过量生成"意思是本发明的微生物的PHA生产比野 生型的微生物的PHA生产的至少5倍，优选地为至少10倍，较优地为至少 15倍，较优地为至少25倍，更优地为至少40倍，最优地为至少60倍，最 优地为至少80倍，甚最优为至少100倍。野生型的微生物是指生产PHA的 没有基因工程化的其基因没有经过人工修饰(突变)的微生物。野生型的微 生物生产正常水平的PHA，但并不显示出沉积性质。另外，本发明的微生物 具有与PHA合成有关的蛋白的编码基因的基因的至少一个修饰因子。此修饰 因子可以是由于修饰后的启动子而过量表达此蛋白或另外的PHA合成基因 的修饰了的调节元素或PHA合成基因的另外的拷贝(通过例如微生物的转 录)或通过基因编码区的修饰，其可增加PHA合酶的活性和/或特异性。一 般地，术语"微生物"意指大量的各种原核微生物(例如，细菌、蓝菌 (cyanobacteria))和真核微生物(例如，原生动物、真菌)的单个细胞或细 胞族群。本发明的微生物的优选地包括生产PHA的细菌食烷菌属石油去污 菌(v4/cflw/vonxc 6orA:wmeww》)、恶臭假单胞菌(i^eMfitomowas/ i/aV/a)、铜t录 假单胞菌(尸so^omowos aerMg^iosa)、 丁香f叚单胞菌(PseMctomowas s^n'打gae)、 荧光假单胞菌(/^ewc o附owas^/7womsce"s)、变形菌(诚o應n'wa /oz7n.e肌'51)、 不动杆菌(v4cz力etoZ7ac/er5p.)、新月柄杆菌(Caw/o6a"er cmycew加s)。尽管如 此，任何其他的生产PHA的微生物，例如，真养产碱杆菌"/^/fge"" e旨o/ /m51)、产碱杆菌属细菌"/cfl,/ge"es ew加; Aw51)、产碱杆菌"/cfl/Zge"ey/ato)、固氮菌"zoZo6ac^ V7'w/aw必)、假单胞菌(尸se^omowos acz7o/7h7a)、 假单胞菌(i^ei^/omowos o/eowmms), 大肠杆菌(j&cAm.c^z co//)，红球菌 属真养菌(i Aodococcus ew^o; /ja)、紫色色杆菌(C7^omo6acten'wm vz'o/ace"m)、 光合细菌(aramfl"iW2 v/wosi/m)。另外，任何并不自然生产PHA的微生物 也可用于本发明，如果这样的微生物包括表达载体，此载体包括基因簇或相 应的表达盒(expression cassette),此表达盒可表达PHA生产所需的酶，特 别是PHA合酶、聚(3-羟基丁酸酯)合成酶、enyol-辅酶A羟化酶并包含上 述的至少一个修饰因子。如此的表达载体可被用任何合适的方法，例如，转 染、转导、转录等(见下述)引入到微生物中，尤其可引入到所述微生物的 细胞中，例如大肠杆菌中。本发明的特别优选的微生物是贫营养细菌(oligotrophy bacterium),优 选地是嗜盐(halophilic)贫营养细菌，更优地是海洋石油烃降解菌(marine oil-degrading bacterium),尤其优选地是同族食烷菌，优选地是食烷菌属石油 去污菌，更优选地是食烷菌属石油去污菌(爿/ca"/vora;c Z o^i/附e"w's ) SK2。 食垸菌属石油去污菌是在水环境中广泛存在的海洋石油烃降解菌。它是具有 中等嗜盐性的贫营养细菌，可用石油碳氢化合物来作为碳和能量来源。食烷 菌属石油去污菌是最令人感兴趣的，因为在石油污染了的海水中它是最广泛 存在的物种(Harayama & a/"1999; Kasai " a/"2001; 2002; Syutsubo " a/.，2001)，并且，相应地，在生物治污上具有关键的应用。对于包括食垸菌 在内的贫营养海洋细菌石油污染构成了营养丰富的临时条件，其特征是具有 高的C/N比。在这样的条件下，当缺乏氮不在是一个限制因素时，微生物将 存储过量的碳来作为能量来源。在这种具有高C/N比率的确利于微生物细胞 内的存储内含物。相应地，碳过量使得生产PHA的细菌种类以PHA颗粒的 形式积累(Steinbtichel 1991)。以前，有人记述了食垸菌属石油去污菌不能生 产PHA(Yakimovet all. 1998)。然而，不利于PHA积累的培养条件是由于在 培养基中的高的氮的浓度(5g/1)。食垸菌属石油去污菌的基因组的功能分析 揭示了与生产PHA有关的蛋白的基因编码(如与其他生物进行的同源性研究 所示的一样)。因此，根据本发明，揭示了多羟基链烷酸酯是生产PHA的细菌。对此蛋白的氨基酸序列排列揭示了在PHA合成代谢中的此蛋白与其他细 菌种类中的蛋白具有低的序列同源性(见图5，表l)，揭示了食垸菌属石油 去污菌中的PHA生产的代谢根源。如上所述，本发明的微生物典型地包括至少一个干扰PHA生产有关的 蛋白的编码基因的修饰因子，优选地，所述蛋白是硫酯酶，更优地所述蛋白 是在PHA合成的代谢中的编码蛋白质即合成3-HAA的硫酯酶。然而，本发 明也提供核苷酸序列包括在PHA代谢中有关的蛋白的编码的编码基因，其中 的基因具有至少一个引起本发明的微生物生产的PHA分泌的修饰因子。优选 地，本发明的核苷酸序列的修饰因子是基于从包括PHA合酶、PHB合酶、 酰基辅酶A转化酶、enyol-辅酶A羟化酶、还原酶、硫解酶、酰基辅酶A硫 酯酶。另一方面，本发明提供用至少一个修饰因子的基因，优选地使得编码 的酶的活性有缺陷，此基因编码类fe^酰基辅酶A硫酯酶、优选地此基因编 码食垸菌属石油去污菌的类Z^5酰基辅酶A硫酯酶，更优地，此基因编码食 垸菌属石油去污菌SK2或另外的微生物中的此酶的同族，尤其是如表4所示 的(图10)。本发明的一个优选实施例的微生物已经根据《国际承认用于专利程序的 微生物保藏布达佩斯条约》，被保藏在德国国家菌种保藏中心，标识参考是 SK2 C9, (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen imd Zellkulturen GmbH (DSMZ), Mascheroder Weg lb， 38124 Braunschweig, Germany with the identification reference SK2 C9 mutant and the Accession Number DSM17483)。涉及包括或包含图ll、图12、 18至25或它们的功能片段的一个核苷酸 序列的一个优选实施例。本发明的核苷酸序列是包含编码序列和最终的进一步的序列的DNA。所 述核苷酸分子是双链或单链分子，单链的RNA或DNA可以是编码(意义) 链或非编码(反义)链。如果需要的话，所述核苷酸序列可包括另外的非编 码序列，例如，非编码的3'-和5'-序列(例如包括调节序列)。所有的核苷酸序列，除非另外设计的话，是从5'端写到3'端。术语"核苷酸序列"也包括下 述的片段或其修饰因子。更进一步，本发明的核苷酸序列可以融合到包括和 包含例如标记序列、指导序列和核苷酸序列编码的多肽序列来帮助多肽的分 离或纯化。代表性的序列包括但不限于那些编码谷胱甘肽-S-转移酶融合蛋 白、聚组氨酸(poly-histidine)(例如，6聚组氨酸His6)、血球凝集素 (hemagglutinin)、单纯疱疹病毒标签(HSV-Tag)。术语"功能"片段或核苷酸序列的修饰涉及核苷酸序列，能够构成典型的 修饰了的在PHA的代谢中的蛋白质的编码基因，或在微生物生产PHA的代 谢中干扰的蛋白质的编码基因，和/或编码生物活性(例如，在PHA或蛋白， 在PHA的生产中的代谢中干扰的)多肽的基因，如下所述。另外，在本发明中，核苷酸序列是指使PHA在细胞外媒质中沉积蛋白的 编码，其中的蛋白在微生物中与通过PHA合酶PHA和合成竞争。本发明所 述的"功能失常的"核苷酸序列包括原始的核苷酸序列，根据图17和图26至 33，其中的序列用已经用转位子插入来中断了 (例如，图14和15中所示例 的)上述揭示的核苷酸序列和相应的基因。更进一步，"功能失常的"核苷酸 序列可包括图11和图12的核苷酸序列，其已经被转位子插入所中断。术语核苷酸序列的"片段"包括此处描述的核苷酸序列的部分，来自至少 25个连续的核苷酸片段至50个连续的核苷酸片段，优选地为至少60个连续 的核苷酸片段，更优地至少120个核苷酸片段，更优地至少180个连续的核 苷酸片段，更优地至少250个连续的核苷酸片段，更优地至少410个连续的 核苷酸片段或更长。在本发明中，较短的片段用来作为探针和引物。尤其优 选的引物和探针与编码多肽的核苷酸序列的选择性的杂交。引物是核苷酸序 列，其功能是作为酶或合成延长的起始底物。探针是核苷酸序列，与本发明 的核苷酸序列杂交，的片段或互补性的核苷酸序列。本发明的编码多肽的片 段保持了上述的功能并特别有用。可在此用杂交来分析特定片段或基因的是否与本发明一致，因此也属于 本发明的范围。杂交描述了核苷酸序列链与互补的链通过碱基对结合的过程。 两个不一样但很相似的互补性的核苷酸序列，两条链的互补程度和链的长度各种各样，这样的条件被用来杂交化。本领域的技术人员熟悉这样的条件和
杂交方法，并且可以进行标准杂交分析(参见例如Sambrook J， Maniatis T (2001) s甲ra)。结果，与本发明的核苷酸序列或功能片段或功能变异体杂交 的的所有的核苷酸序列都属于本发明的范围。
核苷酸序列的变异体是指通过添加、替代、删除或插入一个或多个核苷 酸而保持上面所述的核苷酸序列的功能特性的核苷酸序列。这样的核苷酸序 列可表达某些特定方面的改变了的性质(例如，增加或减少了的表达率)。除 了这些，本领域技术人员将认识到本发明的多肽的氨基酸，如下所述，可被 多个不同的核酸密码子编码，因为由于遗传密码的兼并性绝大多数的氨基酸 序列是被不止一个核苷酸密码子编码。由于这些改变了的核苷酸序列将编码 同样的氨基酸序列，本发明也包括这些改变了的核苷酸序列。
本发明的核苷酸序列的变异体与在此描述的核苷酸序列具有很大的同一 性。尤其优选的是与在此描述的核苷酸序列具有至少30%的同一性、优选地 至少为40%的同一性、更优为至少50%的同一性、甚优为至少60%的同一性、 甚更优为至少80%的同一性、甚更优为至少90%，最优为至少95%的同一性。
为了确定上述的两种核苷酸序列的同一性的比率，这些序列可以调整来 达到最佳的比较目的(例如，可在第一条核苷酸序列中引入间隙)。相应的核 苷酸位置的核苷酸序列可以进行比较。当第一序列的一个位置与第二个序列 的位置是同样的核苷酸时，则分子在那个位置就是相同的。在两个序列之间 的同一性百分比是两个序列之间的共有的相同位置的个数的函数。因此，可 以用数学算法来确定两个序列的同一性百分比。优选的、非限定性的用于比 较两个序列同一性的算法例子是Karlin等人提出的算法(1993)， PNAS USA, 90:5873-5877。这样的算法被包括在NBLAST程序中，可用来识别与本发明 的核苷酸序列具有想要的同一性的序列。为了得到有空隙的联配，可用 Altschul等(1997)提出的Gapped BLAST的方法，Nucleic Acids Res, 25:3389-3402。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，可使用各自程序的 默认参数(例如，NBLAST)。确定两个核苷酸序列的所述方法可应用于氨基 酸序列中。本领域的技术人员可通过执行下述的标准方法来生产本发明的核苷酸序
列的片段或变异体(参见例如，Sambrook J, Maniatis T (2001) swpra)。 一般说 来，制备如此的核苷酸序列的功能片段或变异体可通过修饰(改变)编码本 发明的多肽的DNA序列、并用合适的方法如PCR技术倍增DNA序列来达 到。这些核苷酸序列的修饰(突变)可通过上述的基因工程技术来产生。核 苷酸序列的功能片段和功能变异体的分离可通过标准的方法如筛选法来进行 (例如，筛选基因组DNA库)，然后通过序列化或杂交(用合适的探针，例 如，通过产生目标核苷酸想要的序列的寡肽)以及纯化步骤，如果合适的话。
本发明也包括本发明所述的核苷酸序列的基因产物。本发明的基因产物 不仅涉及转录，根据RNA，优选为mRNA，还涉及等位基因、多肽或蛋白或 酶，尤其是纯化形式的。优选的基因产物是核苷酸序列编码的多肽。优选地， 本发明的多肽包括在图13、图17和图26至图33。
本发明所述的"功能"多肽意指所述多肽可用来生产沉积的例如分泌的 PHA，优选地与其他的与PHA代谢有关的多肽。优选地，PHA的过量生成 是通过PHA合成路径中的功能多肽来达到的。本领域中熟知测量和分析生 产、分泌和/或过量生成物质例如PHA的方法(参见例如Sambrook J, Maniatis T (2001) Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Habor,NY)并且也在本发明中有描述，例如，实 施例3至8，图l、图3、图4、图6。本发明的"功能多肽"并不限于此，可 包括图17和图26至图33中的天然多肽序列。
相应地，在本发明中，多肽可用于使PHA在细胞外媒质中沉积，尤其是 通过微生物中的PHA合酶的合成的竞争，因此，此处可称为"功能不良"的多 肽，例如，此处定义的类Zm5蛋白。这样的竞争可能会发生，如上所解释的 那样，由于硫酯酶对c的断开具有高度的特异性，形成了PHA合成的阻碍。 这些硫酯酶允许释放自由的3-HAA。然而，转化成3-HAA是与PHA合酶合 成PHA的反应竞争的，其作用与同样的细胞媒质(即3-羟酰基-辅酶A)。如 上所解释的，本发明发现，(i)释放自由的3-HAA和PHA的合成是干扰代谢 路径，(ii)特定硫酯酶的功能敲除，此处称为类^^蛋白硫酯酶，使得PHA在细胞外媒质中沉积。本发明的"功能不良"的多肽包括图17和图26至图33 所示的自然多肽序列或图16和图18至图25所示的核苷酸序列编码的多肽序 列，其中的序列已经被转录子插入所中断(例如，如图14和图15所示例的) 如上揭示的核苷酸序列和相应的基因。更进一步，本发明的多肽可包括图ll 和图12所示的已经被转录子插入所中断的核苷酸序列编码的多肽序列。
生产本发明的多肽已经为人们所熟知，并可通过执行许多不同的标准的为 本领域技术人员所熟知的方法(参见例如Sambrook J， Maniatis T (2001) w/ ra)，例如用固相肽合成或重组方法。两种方法都在美国专利4617149中描 述，其被完整地引用在本专利中。固相化学合成多肽的原理被本领域的技术人 员所熟知，并且被例如Dugas H. and Penney C. (1981)， Bioorganic Chemistry, 第54-92页中有描述。例如，肽可通过固相法，用Applied Biosystems 430A肽 合成器(可从美国应用生物系统(Applied Biosystems)公司，Foster City, Calif. 购得)来合成，而且合成循环用AppliedBiosystems来供应。关键的保护的氨基 酸，例如，叔丁氧羰基(t-butoxycarbonyl)保护的氨基酸，和另外的试剂可从 许多化学供应商得到。本发明的多肽可通过标准的方法例如离心、过滤或色谱 法和沉淀步骤从培养基中分离出(参见例如Sambrook J， Maniatis T (2001)
本发明的多肽也可与至少一个第二半族融合。所述至少第二半族可以是 氨基酸、寡肽或多肽并可在合适的位点连接到本发明的多肽上，例如，N-末 端，C-末端或中间。连接序列可用来将本发明的多肽与至少一个另外的半族 融合。根据本发明的一个实施例，连接序列优选地形成5到50个的各种残基， 更优为5到15个各种残基。在优选实施例中，连接序列包含至少20%，更 优为至少40%，甚更优为至少50%的甘氨酸残基。合适的连接序列可很容易 选择并由本领域的技术人员制备。另外的半族可连接到本发明的序列中，如 果想要的话。如果所述多肽是作为融合蛋白来产生的，融合伴侣(例如，HA、 HSV-标签、His6)可用来帮助纯化和/或分离。如果想要的话，所述融合伴侣 然后可以在生产过程的末端从多肽中移除(例如，通过蛋白水解断开或本领 域中的另外的方法)。本发明也提供包含核苷酸序列的载体。术语"构建"、"重组构建"和"载 体"是同样的意思，定义了包括一个或多个其他核苷酸序列(或功能片段或功 能变异体)的核苷酸序列。载体可通过转录到合适的细胞(寄主细胞)中引起
核苷酸的表达来使用。所述载体可以是质粒、噬菌粒(phage particle)或仅 仅是潜在的基因组插入物。 一旦被转录到合适的寄主物中，载体就复制并在 寄主物基因组中独立地发挥功能，或者在合适的条件下，整合到基因组本身 中。
上述载体的"另外的序列"涉及 一般地，合适的载体包括复制的起源， 例如，Orip， colE10ri，可以插入到要表达的(转录和/或翻译)和/或可选择 的核苷酸序列例如编码荧光蛋白，例如GFP，或基因具有抗体抗性，例如， 从Tn3的p-内酰胺酶基因，来自Tn903的抗卡那霉素的基因或来自Tn9的抗 氯霉素的基因。
术语"质粒"意思是指染色体外的自我复制的基因元素。质粒一般是通过 较低的"p"处理和/或然后用字母和数字来标识。此处所述的开始质粒要么可 商业上可购得，要么可不受限地公共可得或可以从公知的步骤从可得的质粒 来构建。另外，本领域的技术人员熟知等效的质粒。用来制备本发明的载体 的开始质粒可用标准的氯化铯DNA分离法例如从包含这些质粒的大肠杆菌 来得到。
本发明的载体包括(重组)DNA克隆载体和(重组)表达载体。本发明 的优选载体是大肠杆菌pBR32、 XL-Blue MRF'和pBK-CMV、 X噬菌体等。 DNA克隆载体指自动复制剂，包括但不限于质粒和噬菌体，包括DNA分子， 一个或多个另外的本发明加入的核苷酸序列。涉及任何DNA克隆载体重组 的表达载体，包括本发明的核苷酸序列可操作地连接到合适的寄主物中的合 适的控制序列中，此控制序列可作用于插入的核苷酸序列的表达。可操作的 连接意思是指核苷酸序列连接到控制序列，以使核苷酸序列可以表达(例如， 转录和/或翻译)的方式。转录意思是指包含在核苷酸序列DNA中的信息转 录到互补RNA序列的过程。
上述的控制序列被本领域的技术人员所熟知，并可选择来表达本发明的核苷酸序列并控制转录。这些控制序列包括但不限于多腺苷酸化信号、启动 子(例如，自然的或合成的启动子)或影响转录的增强子，可选的操纵子序
列来控制转录，局部控制区域或沉默子使得可组织特异性转录，在mRNA上 的适合于核糖体结合位点的序列，能够稳定mRNA的序列和控制转录和翻 译。这些控制序列可被修饰，例如，通过删除、添加、插入或替代一个或多 个核苷酸，而且同时保持它们的功能。另外的合适的控制序列在本领域中为 人们所熟知并且在例如Goeddel (1990)中有描述(Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185， Academic Press, San Diego, CA)。
在细菌系统中的启动子也包括可与编码想要的多肽相连接的 Shine-Dalgarno序歹U 。
例如，有用的表达载体可包括染色体片段、非染色体片段和合成的DNA 序列，例如各种己知的SV40和已知的细菌质粒，例如来自大肠杆菌包括col El、 pBK、 pCRl、 pBR322、 pMb9, pUC 19和它们的变异体，广泛的寄主质 粒载体，例如RP4,噬菌体DNAs ，例如X噬菌体，例如，NM989和另外 的噬菌体，例如，M13和丝状单链DNA噬菌体和从质粒和噬菌体DNA组合 而来的载体，例如，经过修饰而用了噬菌体DNA或另外的表达控制序列的 质粒。用表达载体的表达技术为本领域的技术人员所熟知，并在Sambnx)kJ， Maniatis T (2001) swpra中有描述。
优选地，本发明的载体，尤其是表达载体，包括基因簇，此基因簇包括 上面所定义的修饰，例如，具有在PHA的代谢中的蛋白的编码蛋白，或优选 地，与PHA的生产的代谢干扰有关的蛋白的编码基因的至少一个基因，其中 的至少一个修饰引起细胞外沉积，例如，分泌微生物生产的PHA到培养基中， 优选地，分泌微生物生产的中链或长链的PHA到培养基中。这样的表达载体 可引入到任何合适的上述的微生物中来产生发明的微生物产生分泌的PHA。 这样的基因簇典型地包括所有的需要或涉及PHA的代谢有关的基因。结果， 也包括上述的(表达载体)包括所述的基因簇。
本发明也提供细胞(也是寄主细胞)包括本发明的载体或核苷酸(或 功能片段或功能变异体)。细胞(寄主细胞)意指任何此处描述的有用的微生物。更进一步，细胞或寄主物具有能力来作为本发明的核苷酸或载体的表达 载体。优选地，所述细胞是原核细胞。细胞包括(例如，作为转录、转染或 转导的结果)此处所述的载体或核苷酸序列，但不限于细菌细胞(例如，食 烷菌属石油去污菌、大肠杆菌)。特定细胞的选择在一定程度上是依赖于特定 的用来驱动表达本发明的核苷酸序列的表达载体。
载体可被引入到细胞(寄主细胞)中，用任何合适的方法(例如，转录、
电穿孔、用氯化钙、氯化铷、磷酸钙、DEAE葡聚糖或任何其他物质来转染， 基因枪法，脂质体转染，感染或转导)。转导涉及引入DNA引入(核苷酸序 列)因此DNA可复制，要么通过染色体外元素或通过染色体整合。转化细 菌寄主物的方法在本领域中为人们所熟知。各种方法，例如，核注入，原生 质体融合或用妈处理法，如在Sambrook J, Maniatis T (2001) s甲ra中概述的 那样。转染是指用载体(寄主细胞)不管实际是否表达了编码序列。当任何 标志或操作或载体在细胞中发生时通常会被识别出来。 本发明的另一个方面是涉及生产PHA包括下列步骤
培养本发明的微生物细胞
从培养基中提取PHA 在适合的条件下培养微生物或细胞的标准方法已经在现有技术中为人所熟 知。参见，例如，在下列的例子中，也可在材料中(Sambrook J, Maniatis T (2001) ■swjora )。
PHA可以用传统的方法从培养基中分离出来，包括用离心或过滤、沉积 或将成分(PHA)从上清液中分离出来，然后是纯化，例如，用色谱法步骤， 例如离子交换色谱法、亲和层析法或类似的现有的步骤(也参见实施例4)。
本发明的另一方面涉及微生物，多肽、核苷酸、载体和/或本发明的细胞 生产和沉积例如分泌和/或过量生成PHA，尤其是中链和/或长链的PHA。
总之，本发明涉及与PHA的生产的代谢干扰有关的蛋白的编码基因的 至少一个基因的至少一个修饰可导致细胞外沉积，例如，分泌微生物生产的 PHA，或优选地，分泌微生物生产的中链和/或长链的PHA到培养基中。基 于miniTn5 Str/Sp元素和miniTn5 Km元素的转位子突变(见实施例1)，用于引入与PHA的生产的代谢干扰有关的蛋白的编码基因的至少一个基因的 至少一个修饰。结果，进行在生物膜形成中筛选miniTn5修饰缺陷，通过测 量修饰细胞贴附在塑料表面的能力不足(见实施例2)。修饰(下文中用"C9" 或"C9突变"表示)被分离出来，展示了由于表达了分泌的后来被识别为PHA 的多聚物物质，生物膜的形成有明显的缺陷。
通过用化学分析的方法，确定了用本发明的基因工程微生物，例如从食 垸菌属石油去污菌中得到的微生物，以及那些微生物通过以颗粒的形式积累 的细胞内的PHA的生产和沉积，例如分泌PHA。用这些基因工程微生物尤 其是在高的碳/氮比的条件下的十八烷上生长的食烷菌属石油去污菌分泌的 混合的不同的PHA (羟基己酸甲酯、羟基辛酸甲酯、羟基癸酸甲酯、羟基十 二垸酸甲酯)能够以细胞内颗粒和存储物的形式来产生。
除此之外，本发明还成功地分离和表征了具有至少一个修饰因子的微生 物的，尤其是具有至少一个编码干扰PHA的生产中的代谢中干扰的蛋白的修 饰因子，其中的至少一个修饰引起细胞外沉积。本发明绕过了细胞内生产的 PHA的提取的成本问题，并可导致高的PHA产量。
下面的图和例子是为了阐释本发明，而不应视为对本发明的范围的限 制。本发明所引用的参考文献都完整地包括在本发明中。
在另外的实施例中，提供了如上述的生产3-HAA的酶。这样的酶包括 但不限于从食烷菌属石油去污菌、恶臭假单胞菌、铜绿假单胞菌、丁香假单 胞菌、荧光假单胞菌、不动杆菌、新月柄杆菌的可生产3-HAA的硫酯酶。
本发明进一步包括酶的使用，提供来生产上述的3-HAA，和/或它们的 编码核苷酸，来产生PHA，优选地，中链或长链的PHA。这样的酶类可被用 现有技术中的方法来转染到上述的微生物中，例如，作为载体或作为(裸露) 核苷酸，或以蛋白质的形式，例如，与细胞穿透肽融合在一起。


图1是野生型的食垸菌属石油去污菌SK2(以下称为"SK2"或"SK2野生 型")和突变型食烷菌属石油去污菌SK2 (以下称为"C9突变型")以2%的丙酮酸盐或1.5%十八烷来作为碳源生产PHA。检査细胞和相应的上清液中的 PHA含量，以g/1表示。PHA的产量的顺序如下C9突变型上清液十八烷〉 C9突变型上清液丙酮酸盐〉SK2野生型细胞+上清液十八垸> SK2野生型 细胞+上清液丙酮酸盐。来自生长在丙酮酸盐上或十八垸上的C9突变型细胞 的PHA的数量从太低而不能量化(第三和第五个探针)。在丙酮酸盐上生长 的C9突变型产出的PHA的量是在丙酮酸盐上生长的SK2野生型产出的PHA 的量的10倍。另外，在十八垸上生长的C9突变型产出的PHA的量是在十 八烷上生长的SK2野生型产出的PHA的量的10倍。因此，根据本发明，基 因工程微生物可以沉积，例如，分泌和过量生成PHA。
图2是食烷菌属石油去污菌SK2族变形的超薄部分的电子显微镜照片。 细胞被培养在含有1.5X(w/v)的十八烷和0.27g/1的NH4C1 (存储条件)中， 并在静态生长期收获。这些超薄切片证实了细胞内颗粒的存在。
图3是生长在Permanox疏水性的用十八烷覆盖的细胞培养片上的SK2 野生型细胞和C9突变细胞的电子扫描显微镜照片。图3A和3C展示了 SK2 野生型细胞的结果，图3B和3D展示了C9突变细胞的结果，证实了分别产 生并分泌细胞外PHA和将PHA分泌到周围的培养基中。虽然两副图都包含 杆状的细胞，但是显然，C9突变细胞嵌入在一些沉积的例如分泌的物质中间， 而SK2野生型的细胞并不如此。这些结果支持假设C9突变族在一些细胞外 的通过化学分析的方法证明是PHA的多聚物的生产有关。进一步的投影技术 的方法得到的在存储条件的十八垸上生长的SK2野生型和C9突变型EM照 片支持假设突变族生产的PHA沉积例如分泌在培养基中。C9突变族的投 影技术得到的EM图片揭示了 C9突变细胞的表面的小孔可能与细胞内生产 的PHA的分泌有关。
图4是C9突变细胞和SK2野生型细胞的生长特性的比较图。由图可见， 当丙酮酸盐作为碳源时，C9突变型与SK2野生型具有可比较的生长特性。 当用十八垸作为碳源时，甚至C9突变型的生长特性比SK2野生型的还更好。 SK2野生型在十八烷上生长时与C9突变型比较具有一些缺陷。这一现象可 解释为高的细胞内的PHA含量抑制了 SK2野生型细胞的分裂。细胞计数也显示了在十八烷上生长的C9突变细胞(数据没有展示出来)在高的碳氮比 的条件下，将合成的PHA释放到媒质种，仍然可进行细胞分裂。结论是，本 发明的微生物肯定可以用于商业上和工业上的生物技术。
图5展示的表1是生产PHA并将其运转的食垸菌属石油去污菌SK2的 基因序列数据的计算机分析的结果。
图6展示的表2是PHA和其组分的分析。
为了确定野生型食烷菌属石油去污菌SK2(下面以"SK2"或"SK2野生型" 代表)和突变型食烷菌属石油去污菌(下面以"C9变异型"代表)沉积的例如 分泌的实际上为PHA的物质，进行了进一步的化学分析，并且揭示了 PHA 的存在。细胞生长在丙酮酸盐上或十八烷上，将之作为PHA积累条件下(流 入，PHA存储条件)的碳和能量来源，例如，高的C/N比(C:N为100:1), 并且将细胞从媒质中分离出来。检査细胞和相应的上清液PHA含量。来自 C9突变型和SK2野生型的细胞或上清液用氯化钠消化，并接着用丙酮/乙醚 来溶解提取(Solaiman"fl/.,1999)。 PHA的生产的量的大小顺序如下
C9突变型上清液十八烷〉C9突变型上清液丙酮酸盐> SK2野生型细 胞+上清液十八烷〉SK2野生型细胞+上清液丙酮酸盐
从在丙酮酸盐或十八烷上生长的C9突变型细胞中分离出来的PHA的量 由于太低而不能量化(也参见图1)，生长在十八烷上的SK2野生型细胞生 产的PHA的量大约是生长在丙酮酸盐上的细胞生产的PHA的量的3倍 (18mg/l比6.5mg/0。
如在表2中所示的，SK2野生型细胞所生产的PHA的量是很少的(在 丙酮酸盐中为6.5mg/1，在十八垸中为18mg/l)，并且依赖于碳源，在垸烃中 生产更多的PHA。 SK2野生型生产的PHA包括羟基已酸乙酯(C6)、羟基辛 酸酯(C8)、羟基癸酸甘油酯(CIO)、羟基十二酸甘油酯(C12)，其中羟基 癸酸甘油酯是主要的单体成分。因此，尽管以前的研究(Yakimov等1998) 发现，在高的C/N比的条件下，食烷菌属石油去污菌族从烷烃中产生多羟基 链烷酸酯的混合物。此外，食烷菌属石油去污菌SK2后来的在高的C/N比条 件下的确显示了光学显微镜下可见的包含PHA的颗粒(也见图2)。表2也展示了 SK2野生型也在细胞内积累PHA (没有细胞外生产)，而 C9突变型所生产的PHA沉积例如分泌到细胞媒质中(细胞外生产)。单体重 复单元组分和聚合物的分子量(来自所有批次的)分别通过气相色谱、法/质谱 分析法和凝胶渗透色谱法来确定。
图7所示的表3是来自食垸菌属石油去污菌的PHA的分子量。展示了 在丙酮酸盐和十八烷上生长的C9突变型和在丙酮酸盐和十八垸上生长的 SK2野生型。食烷菌属石油去污菌SK2野生型的聚合物具有C6到C12的重 复单元组分。分子量从180000至540000Da (每个分子达2500个单体)。此 对应于每个不同的聚合物每个单体，重复1027至2246个单元。C9突变型具 有相似的组分和/或分子量，虽然组分的PHA的分子量比在SK2野生型中的 稍低。单体的分子量并不与碳源有关。
这些数据有力地支持了以下假设基因修饰影响了 PHA生产的方式，但 不影响产生的聚合物的组分。
图8是假设的在烃类/丙酮酸盐上生长的多羟基链烷酸酯的PHA生物合 成的路径(Modified version of Klinke 1999 Hypothetical pathway of MCL PHA biosynthesis of PHA polymerase- and thioesterase I-containing五.co/z. JMU193 grown on gluconate)。烃类通过单氧酶、醇类脱氢酶和醛类脱氢酶的连续作用 的最终氧化步骤而被降解，产生被酰基辅酶A合成酶激活的自由脂肪酸，并 进入酰基辅酶A的p-氧化。在(3-氧化中产生的(S)-3-羟酰基-辅酶A通过异构 酶的作用而异构成(R)-3-羟酰基-辅酶A。丙酮酸以酰基辅酶A的形式进入脂 肪酸生物合成。脂肪酸生物合成产生的酰基ACP通过和的激活而 转化成自由脂肪酸。脂肪酸生物合成中产生的自由脂肪酸被酰基辅酶A合成 酶所活化，并进入P-氧化循环。在(3-氧化中产生的3-羟酰基-辅酶A被用 来通过类^^的酰基辅酶硫酯酶的活化而进行生物合成A3-羟基丁酸，或被 用来通过phaC合成酶而进行PHA的合成。在类的酰基辅酶硫酯酶的突 变使得不产生3-HAA，并导致PHA不受控制的生产。
因此，换句话说，根据本发明，类^^8基因的突变使得3-羟垸基酰胺-辅酶A不释放自由的3-羟垸基酰胺，这将增加PHA的前体3-羟酰基-辅酶A，导致不受控的PHA的生成和后续的分泌。
图9是两个类基因的操纵子的结构和形成单个操纵子的"假定的酰 基转移酶"的结构。
确定转位子(见例l)的插入位点揭示了mini-Tn5插入到了酰基辅酶A 硫酯酶类(Abo—1044)，它是编码PHA的代谢/生产/合成的蛋白质的多 个基因中的一个，并且很可能破坏基因的功能，因此使基因失活。类^^接 着是下游的磷酸甘油乙酰基转移酶(l-acyl-sn-glycerol-3-phosphate acyltransferase)的"假定酰基转移酶"基因(Abo—1045)。"假定酰基转移酶"的 ORF基因包括645bp的、表达与前述的类&^B基因的ORF有3个重叠，并 且其预测编码214氨基酸序列的蛋白，预测的分子量是23.7kDa。类基 因和"假定酰基转移酶"基因在图9所示的一个操纵子中排列。
为了分析如上所述的PHA分泌和过量生成的表现型是编码与PHA代谢 /生产/合成有关的蛋白的基因，尤其是类tes5酰基辅酶A硫酯酶基因的结果， 并且估计转位子对下游基因的极化作用的可能性，构建了位点导向的突变， 并将其表现型与C9突变型做比较(见实施例3)。为了构建敲除突变，此基 因的野生型在载体中被放大并克隆，此载体在食垸菌属石油去污菌中并不复 制。链霉素抗性盒(Str resistance cassette)被插入到此基因的独特位点中， 构建结果用来代替此基因的野生型拷贝。此结果通过光学显微镜和培养基的 化学分析来得到确认(数据没有展示出)。它们也显示出，敲除突变沉积例如 分泌了PHA在媒质中，这意味着插入到了 "假定酰基转移酶"中的mini-Tn5 具有极化作用。因此，考虑到类&s5在PHA生产中的正面作用，PHA分泌 和表现型的过量生成可在类^s万的失活之外，并也可被插入到"假定酰基转 移酶"基因中的Tn-5来引起。
图10的表4展示了被类tes5基因编码的酰基辅酶A硫酯酶蛋白的几个 紧密相连的革兰氏阴性细菌食垸菌属石油去污菌SK2(Abo一1044)的基因同源 性。这些数据是相应的假定酰基转移酶蛋白的同源性搜索的结果(BLAST搜 索)。可从表4看出，类^^蛋白与假定的酰基辅酶A硫酯酶n、假定蛋白 和类硫酯酶命名不同。这些搜索的细菌是多功能降解菌KT2440(i^eMdomomw /7M"f/a KT2440 )、铜绿假单胞菌PA01 (i^ewdomowas am^'"osa PA01 )、 丁香假单胞菌B728a (尸sewc/omowas ,/"gae pv B728a)、 荧光假单胞菌(尸^M^ mowos y7womsce"s PfO-l)、变形菌L2TR (/Wo附fln'wfl /0//n'e"w's L2TR)、不动杆菌(j"'"eto^c&r )和新月柄杆菌CB15
(Om/oZ)actercTesce"^f CB15)。然而，应当理解，术语"类to 5"、"类 基因"和/或"类to万蛋白"和此处的描述的涉及上述的所有的不同命名。表4 中的蛋白展示了食垸菌属石油去污菌SK2的与类化W基因的高度同源性 (Abo—1044)。
图11是形成单个的操纵子的两个类te^8基因的核苷酸序列(Abo—1044) (带下划线的)和"假定的酰基转移酶"(Abo—1045)。第一行是来自类/e^5 的上游区域。类的起始密码子是atg，并且用黑体字表示。Tn5插入发 生在类to5的位点527，并用//标出。来自类^5基因的下游是"假定的酰 基转移酶"基因。在类ZM万(Abo一1044)的末端和"假定的酰基转移酶" (Abo—1045)的起始位点之间有3bp的重叠。
图12是食烷菌属石油去污菌的类tes5核苷酸序列。Tn5插入发生在位 置557，并且用//标出。起始和结束密码子以黑体字母来标识。
图13是类的食烷菌属石油去污菌的氨基酸序列。
图14是miniTn5 Km元素的核苷酸序列。
图15是新霉素和卡那霉素抗性的新霉素磷酸转移酶的氨基酸序列。
图16是食烷菌属石油去污菌的"假定的酰基转移酶"的核苷酸序列。起始
和结束密码子以黑体字母来标识。
图17是食烷菌属石油去污菌的"假定的酰基转移酶"的氨基酸序列。
图18是恶臭假单胞菌KT2440的假定的酰基辅酶A硫酯酶II的核苷酸序列。
图19是铜绿假单胞菌PA01的假定的PA2871蛋白的核苷酸序列。 图20是丁香假单胞菌pv B728a的假定的酰基辅酶A硫酯酶II的核苷酸 序列。
图21是荧光假单胞菌PfO-l的酰基辅酶A硫酯酶的核苷酸序列。图22是变形菌L2TR的类酰基辅酶A硫酯酶的核苷酸序列。 图23是不动杆菌ADP1的假定酰基辅酶A硫酯酶II的核苷酸序列。 图24是新月柄杆菌的假设蛋白CC2472的核苷酸序列。 图25是赤细菌属杆菌(五o^w^c^ HTCC2594的假设蛋白
ELI0992的核苷酸序列。
图26是恶臭假单胞菌KT2440的假定酰基辅酶A硫酯酶II的氨基酸序列。
图27是铜绿假单胞菌PA01的假设蛋白PA2871的氨基酸序列。 图28是丁香假单胞菌pv B728a的假定的酰基辅酶A硫酯酶II的氨基酸 序列。
图29是荧光假单胞菌PfO-l的酰基辅酶A硫酯酶的氨基酸序列。 图30是变形菌L2TR的类酰基辅酶A硫酯酶的氨基酸序列。 图31是不动杆菌ADP1的假定酰基辅酶A硫酯酶II的氨基酸序列。 图32是新月柄杆菌的假设蛋白CC2472的氨基酸序列。 图33是赤细菌属杆菌(￡o^raZ)acter /z'torafc) HTCC2594的假设蛋白 ELI0992的氨基酸序列。
具体实施例方式
材料细菌族、媒质和生长条件
食垸菌属石油去污菌SK2用于所有的野生型的实验。细菌在修饰过的 ONR7a媒质中30。C下生长(Yakimov等1998)，其中加入了 0.27g/l的NH4C1 代替KN03来作为氮源。丙酮酸盐(2%)或十八烷(1.5%)用于作为碳和 能量来源。
大肠杆菌在加入了必需的链霉素(50pg/ml)、氯霉素(12,5pg/ml)、卡 那霉素(50|ig/ml)、萘瞎酸(nalidixic acid) (10)ig/ml)的Luria-Bertani媒质 中在37"C下生长。用与大肠杆菌族S17-1结合来将质粒引入食垸菌属石油去 污菌中。实施例1: Mini-Tn5突变
转位子突变基于Lorenzo等(1998)提出的miniTn5 Str/Sp元素(和Tn5 Km元素)。食垸菌属石油去污菌SK2在ONR7a媒质中在3(TC生长，处于 生长静止期时，对细胞进行离心。大肠杆菌的原料和辅助部分在LB培养基 上与链霉素或氯霉素37i:生长过夜，用新鲜的LB培养基冲洗并离心。食垸 菌属石油去污菌和大肠杆菌和辅助部分以4: 1: l的比例混合，并放在具有 LB琼脂和盐(Na2HP04.2H20, 0.45 g/l; NaN03, 2.5 g/l; NaCl, 11.5 g/l; KC1, 0.38 g/l; CaCl2.2H20, 0.7 g/l)和作为碳和能量来源的2%的丙酮酸盐的膜滤器上。 板在3(TC放置24小时。细胞用10mMMgSO4冲洗，转化结合子在具有萘啶 酸和链霉素的ONR7a上选择。
mini-Tn5的族的插入位点通过以前所述的(Ochman等1988)反向PCR 来确定。简单说来，分离出突变型的总的DNA，并用不切断mini-Tn5元素 的ClaI来消化。得到的DNA片段成为圆形，插入的mini-Tn5空白区用两个 启动子来放大OTR末端(GGC CGC ACT TGT GTA TAA GAG TCA G)和 1TR末端(GCGGCC AGATCTGATCAAGAG ACAG)。 PCR的条件是 94°C 1， 5分钟，48°C l分钟，70。C4分钟，30次循环。PCR产物用凝胶纯 化，并用ABI Prism 377 sequencer (AP Biosystems)上的BigDye terminators来 进行自动的DNA测序。为了确定类Z^B的转位子突变的精确位点，我们设 计了可以读中断基因1086F (TTA CTG GCT TCG CAG GAA TGG)和
实施例2:生物膜形成试验
为了筛选出生物膜形成中的mini-Tn5突变缺陷，用了 O，Toole和Kolter (1998)所描述的试验方法。这个试验对细菌细胞粘附在聚氯乙烯(PVC)塑料的 96孔板上的粘附能力进行评价。ONR7A培养基(100 pl/孔)用复制装置 (replicator device)进行接种。接种后，板被置于30。C， 48小时，然后每孔 中加入25 pl的1%结晶紫(crystal violet ， CV)(此染料会染细胞，但不会 染PVC)。此板在室温下静置15分钟，用水反复彻底冲洗，并对生物膜的形成进行评价。
生物膜的形成通过加入2 x 200 ^il的95%乙醇到CV-染色后的微孔板 中来量化。CV-染色后的生物膜用200^1的95%乙醇来溶解，其中的125ml 被转移到新的聚苯乙烯微孔板中，其吸光度用酶标仪在600nm来确定(700 微孔板酶标仪系列，Cambridge Technology )。
实施例3:位点导向的"假定酰基转移酶"基因
为了分析，如果观察到的C9突变族是类的对最小转位子对下游基 因的极化效果失活的结果，构建了作为目标的"假定酰基转移酶"。下游的"假 定酰基转移酶"从具有引物1087F: (CAGTGATGGCTATGGTCAAAG)和 1087R: (CTTTGATCAGTCCGGCAAAAC)的食烷菌属石油去污菌SK2来放 大，并且克隆到包含抗氨苄青霉素(ampicillin)基因的pCR2.1 TOPO克隆 载体(Invitrogen)来反选择。抗链霉素盒从Tn5 Str/Sp质粒得到(de Lorenzo 等.，1998)并插入到基因的独特的位点中。非功能的"假定酰基转移酶"然 后通过同源重组再次引入食垸菌属石油去污菌SK2的基因组中。为了确保与 DNAStrR克隆联系的载体的丢失，被平行放在含有链霉素、萘啶酸的ONT7A 琼脂和包含氨苄青霉素的ONT7A琼脂中来识别出分离出的丢失了与 TopoCloning载体一起的AmpR标记。测量敲除突变型的生长特性及PHA积 累，并与mini-Tn5的突变型和野生型相比较。
实施例4: PHA的化学分析
为了分析野生型食烷菌属石油去污菌SK2和突变族释放到培养基中的 PHA，细菌培养在含2%的丙酮酸盐或1.5%的十八垸来作为碳源(存储条件) 的ONR7a培养基中。细菌被培养在旋转混合器中(100rpm)在3(TC直到处 于生长期的静态末期。细胞通过离心的方法来收集(60' 12000)上清液和细 胞团分别收集，冻干后接着用来进行PHA的化学分析。
实施例5: PHA量化细胞和上清液的等份试样用冰水冲洗，并在8(TC的真空干燥过夜。PHA 用次氯酸钠消化细胞，并且用丙酮/二乙醚来提取(SolamainWa/.,1999)。
实施例6:气相色谱法/质谱法
为了确定PHA的组分，将大约2mg的PHA放入盛有氯仿、甲醇、硫 酸(比例为l: 0.85: 0.15)的小烧瓶中，在100'C的恒温控制曹中反应2小 时。此方法通过将其(3-羟基甲酯(FAME)的甲醇分解作用而将PHA降解。 反应之后，加入0.5ml的蒸馏水，摇晃试管l分钟。相分离之后，有机相被 去除，转移到小烧瓶中用于分析。FAME用具有30mx0.25mmHP-5(5y。 二 苯亚砜和95%聚二甲基硅氧烷)融合的硅毛细管柱；流动率为lml/分钟；样 品输入温度是，以8。C/分钟的速率至23(TC，界面温度是25(TC;离子源温 度是175°C;电子冲击模式70 eV，以0.5s/扫描从45到450 amu的气相色谱 -质谱仪来分析(GC/MS， model Varian 3400CX, Varian Chromatography Systems, Sugar Land, TX,和VGAutospec spectrometer)。本发明的用来试验的PHA的 样品的纯度为高达99.5%。在其中没有检测到微量的蛋白质、碳水化合物和 酯类。见表l中的数据。
实施例7:凝胶渗透色谱法
实施例6中的样品在HPLC系统中用光谱物理泵(Spectra-Physics pump) 和HPX-87H交换树脂柱(Aminex HPX-87H column)来在下列的条件下分析 (Bio-Rad, Hercules, Calif.):柱温5(TC、梯度、等强度、移动相，5 mM的硫 酸，流率0.5ml/分钟，光散射。见表2中的数据。
实施例8:电子显微镜
细胞在含有1.5% (w/v)的十八垸和NH4C1 (存储条件)ONR7a中培养， 并在生长静止期收集。用来进行扫描电子显微镜的细胞也在同样的条件下生 长，唯一不同的是，十八垸是嵌入在尸emm"ox细胞培养片上的(NalgeNunc)。 按照Golyshina (2000)的方法对细胞进行投影，细胞嵌入并根据Yakimov(1998)的方法制作超薄切片，并用Liinsdorf等(2001)所述的方法扫描电子 显微镜进行观察。
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权利要求
1、一种基因工程微生物，其特征在于，其在至少一个基因中具有至少一个修饰因子，所述至少一个基因对多羟基链烷酸酯(PHA)的代谢相关蛋白质进行编码，或者对在PHA的产生过程中干预微生物代谢的蛋白质进行编码，所述至少一个修饰因子导致中链和/或长链的PHA的细胞外沉积和/或过量生成。
2、 根据权利要求1所述的基因工程微生物，其特征在于，所述至少一 个基因对在PHA的产生过程中干预微生物代谢的蛋白质进行编码，所述蛋白 质是一种酶，其为中间物而与PHA的合成路径酶竞争。
3、 根据权利要求1所述的基因工程微生物，其特征在于，所述酶是硫 酯酶。
4、 根据权利要求2或3所述的基因工程微生物，其特征在于，所述硫 酯酶作为底物对3-羟酰基-辅酶A起作用。
5、 根据权利要求2或3所述的基因工程微生物，其特征在于，所述硫 酯酶是类^^酰基辅酶A硫酯酶。
6、 根据权利要求2至5中任一权利要求所述的基因工程微生物，其特 征在于，所述酶由一段核苷酸序列进行编码，所述核苷酸序列包括图11和图 12所示的修饰后的核苷酸序列或其同源物。
7、 根据权利要求2所述的基因工程微生物，其特征在于，所述酶由一 段核苷酸序列进行编码，所述核苷酸序列包括图14、 16和图18到图25所示 的自身的核苷酸序列或其同源物，所述自身的核苷酸序列通过所述至少一个 修饰因子进行修饰。
8、 根据权利要求1至7中任一权利要求所述的基因工程微生物，其特 征在于，所述至少一个修饰因子导致修饰后的基因完全或部分失活。
9、 根据权利要求1至8中任一权利要求所述的基因工程微生物，其特 征在于，所述至少一个修饰因子是从包括Tn5和TnlO转位子在内的转位子 插入而产生的，包括Tn5转位子的插入，进一步包括在所述基因的下游至修饰后的基因之间插入。
10、 根据权利要求1至9中任一权利要求所述的基因工程微生物，其特 征在于，所述至少一个修饰因子通过转位子突变而产生，包括基于miniTn5 Km元素的突变，进一步包括基于miniTn5 Str/Sp元素的突变。
11、 根据权利要求1至10中任一权利要求所述的基因工程微生物，其 特征在于，所述基因被结合到所述微生物的染色体中。
12、 根据权利要求1所述的基因工程微生物，其特征在于，所述至少一 个基因编码PHA合酶、PHB合酶、酰基辅酶A转移酶、enyol-辅酶A水合 酶或还原酶。
13、 根据权利要求1所述的基因工程微生物，其特征在于，所述的至少 一个修饰因子引起PHA在细胞外沉积或过量生成。
14、 根据权利要求13所述的基因工程微生物，其特征在于，所述细胞 外沉积或过量生成PHA，是相应的野生型的微生物的PHA生产的至少5倍、 10倍、15倍、25倍、40倍、60倍、80倍或100倍。
15、 根据权利要求13所述的基因工程微生物，其特征在于，所述微生 物包括以下细菌食垸菌属石油去污菌、恶臭假单胞菌、铜绿假单胞菌、丁 香假单胞菌、荧光假单胞菌、变形菌、不动杆菌、新月柄杆菌、产碱杆菌属 细菌、产碱杆菌、固氮菌、红球菌属真养菌、紫色色杆菌、光合细菌。
16、 根据权利要求1至15中任一权利要求所述的基因工程微生物，其 特征在于，所述的微生物是食烷菌属，包括食烷菌属石油去污菌，进一步包 括食烷菌属石油去污菌SK2。
17、 一种组成至少一个基因的核苷酸序列，其特征在于，所述至少一个 基因中具有至少一个修饰因子，所述至少一个基因对多羟基链烷酸酯(PHA)的代谢相关蛋白质进行编码，或者对在PHA的产生过程中干预微生物代谢的 蛋白质进行编码，所述至少一个修饰因子导致中链或长链的PHA的细胞外沉 积和/或过量生成。
18、 根据权利要求17所述的基因工程化的核苷酸序列，其特征在于， 所述基因包括PHA合酶、PHB合酶、酰基辅酶A转移酶、enyol-辅酶A。
19、 根据权利要求17所述的基因工程化的核苷酸序列，其特征在于， 所述基因是类te^g的酰基辅酶A硫酯酶，包括是食垸菌属石油去污菌、恶臭 假单胞菌、铜绿假单胞菌、丁香假单胞菌、荧光假单胞菌、变形菌、不动杆 菌、新月柄杆菌、产碱杆菌属细菌、产碱杆菌、固氮菌、红球菌属真养菌、 紫色色杆菌、光合细菌的类f^B的酰基辅酶A硫酯酶。
20、 根据权利要求17所述的基因工程化的核苷酸序列，其特征在于， 所述基因是类tes5的酰基辅酶A硫酯酶，包括食垸菌属石油去污菌的类 的酰基辅酶A硫酯酶，进一步包括是食垸菌属石油去污菌SK2的类tes5的 酰基辅酶A硫酯酶。
21、 根据权利要求17至20所述的基因工程化的核苷酸序列，其特征在 于，所述至少一个修饰因子通过转位子插入而产生，包括Tn5转位子在所述 基因的下游至修饰后的基因之间插入。
22、 根据权利要求17至21所述的基因工程化的核苷酸序列，其特征在 于，所述至少一个修饰因子是通过转位子突变而产生，包括基于miniTn5 Km 元素的突变，进一步包括基于miniTn5 Str/Sp元素的突变。
23、 根据权利要求17至22所述的基因工程化的核苷酸序列，其特征在 于，所述核苷酸包括如图11和图12所示的核苷酸序列或其同源物。
24、 根据权利要求17至22所述的基因工程化的核苷酸序列，其特征在 于，所述核苷酸包括如图14、图16和图18至图25所示的自身的核苷酸序 列，所述自身的核苷酸序列通过所述至少一个修饰因子进行修饰。
25、 根据权利要求17至24中任一权利要求所述核苷酸序列编码的多肽。
26、 根据权利要求25所述的多肽，其特征在于，所述多肽包括图ll或 图12所示的氨基酸序列中的其中一者。
27、 一种包括权利要求17至24中任一权利要求所述的核苷酸序列的载体。
28、 一种包括用于生产PHA的基因簇的载体，其特征在于，所述基因 簇包括具有至少一个修饰因子的一个基因，所述至少一个基因对多羟基链烷 酸酯(PHA)的代谢相关蛋白质进行编码，或者对在PHA的产生过程中干预权利要求1至16中任一项所述基因工程微生物的代谢的蛋白质进行编码，所 述至少一个修饰因子导致中链或长链的PHA的细胞外沉积和/或过量生成。
29、 一种包括权利要求27或28所述载体和/或权利要求17至24中任一 项所述核苷酸序列的细胞。
30、 一种生产PHA (PHA)的方法，包括下列步骤a. 培养权利要求1至16中任一权利要求所述的微生物或权利要求29所 述的细胞；以及b. 从培养基中回收PHA。
31、 权利要求1至16中任一项所述的微生物，和/或权利要求17至24 中任一项所述的核苷酸序列，和/或权利要求26或27所述的载体，和/或权 利要求29所述的细胞，在中链和/或长链PHA的生产及沉积中的应用。
32、 权利要求1至16中任一项所述的微生物，和/或权利要求17至24 中任一项所述的核苷酸序列，和/或权利要求26或27所述的载体，和/或权 利要求29所述的细胞，在中链和/或长链PHA的过量生成中的应用。
全文摘要
本发明涉及多羟基链烷酸酯(PHA)的生物合成领域。本发明涉及一种基因工程微生物，其具有与PHA的代谢特别是与其生成有关的至少一个基因。该微生物适用于PHA的工业生产。本发明还涉及一种生产PHA的方法。
文档编号C12N9/16GK101297030SQ200680029128
公开日2008年10月29日 申请日期2006年8月9日 优先权日2005年8月9日
发明者彼得·戈利夏因, 曼纽尔·费勒, 朱利亚·萨比罗瓦, 沃尔夫-雷纳·亚伯拉罕, 海因里希·伦斯多尔夫, 肯尼恩·蒂米斯 申请人:亥姆霍茨感染研究中心