专利名称：：用于hla-drb1基因分型检测的试剂盒的制作方法用于HLA-DHM基因分缀检剥的试拥盒所属技术領壤本发明涉及一种基因检测试剂盒，特别是涉及采用DNA微阵列和双温度杂交技术对人类白细胞抗原基因进行检测和分型的试剂盒及其制备和使用方法。
背景技术：
：HLA(Humanleukocyteantigei^人类白细胞抗原)是人类主要组织相容性系统。组织相容性是指不同个体间进行组织或器官移植时，供者和受者双方接受的程度。供受者组织不相容引起的反应，被证实是一种免疫反应，它是由细胞表面同种异型抗原诱导的，这个代表个体特异性的抗原称移植抗原或组织相容性抗原，其中起主要作用的抗原称主要组织相容性系统,S),HLA(人类白细胞抗原)就是人类的主要组织相容性系统。HLA基因复合体位于人类第6号染色体621.3区域，具有高度单核苷酸多态性(SNPs)。HLA存在多个基因座位,其中HLA-DRB1座位是影响移植排斥反应的主要作为之一。SNPs是决定组织相容性的本质因素，个体之间的SNPs差异程度决定着相容性程度。HLA-DRB1基因座位的SNPs主要集中在第二外显子长度约300bp的片段上。根据SNPs的差异特点，可以进行基因分型，将HLA-DRB1基因座位分成不同的型别和亚型，型别和亚型相同者，SNPs差异较小，相容性好，反之亦然。HLA基因分型技术广泛应用于itm干细胞移植、器官移植、疾病关联研究。HLA-DRB1基因分型方法是从卯年代开始发展起来的，目前主要包括PCR-SSP(PCR-序列特异性弓l物法)、PCR-SSOP(PCR-序列特异性寡核苷酸探针法)、SBT(测序法)、FCM(流式法)方法。这些方法目前被西方国家的少数企业垄断，我国处于空白状态，完全依赖进口。同时，这些方法也存在一些技术问题，比如引物过多造成检测错误、探针杂交单一温度造成特异性降低、检测通量过小等等。DNA微阵列法是近几年发展起来的新型基因分型法，相比其它分型方法，具有高通量、集约化、低成本、高准确性辦点，是融微电子学、生物学、物理学、化学、计算机科学为一体的高度交叉的新技术，具有重大的基础研究价值，又具有明显的产业化前景。由于用该技术可以将极其大量的探针同时固定于支持物上，所以一次可以对大量的生物分子进行检测分析，从而解决了传统核酸印迹杂交技术复杂、自动化程度低、检测目的分子数量少、低通量等不足。而且，通过设计不同的探针阵列、使用特定的分析方法可使该技术具有多种不同的应用价值，如基因表达谱测定、突变检测、多态性分析、基因组文库作图及杂交測序(Sequenciiigbyhybridization^SBH)等，为"后基因组计划"时期基因功能研究及现代医学科学、医学诊断学的发展提供了强有力的工具，现有的DNA微阵列法都是采用皿度杂交法，单温度杂交，成部分探针杂交特异性降低，这是方法学上自身画有的缺点。本发明是采用双温杂交DNA微阵列的方法对HLA-DRB1进行基因分型检测的试剂盒，不但解决了基因型的通量问题，也解决了单温杂交的特异性问题。发明肉容本发明的一个目的是提供一种用于人类白细胞抗原基因进行检测和分型的试剂盒，特征在于采用DNA微阵列和双温度杂交技术针对HLA-DRB1基因座位的第二外显子，设计二套特异性寡核苷酸探针(表1)，采用自动点样机器人，将二套探针印制在两张玻片的特定区域，每张玻片印制16个微阵列矩阵，制成高密度DNA微阵列。如此制得的二张芯片可以检测16个样本，再配以本领域技术人员熟知其它必要的组份，即得到用于HLA-DKB1基因分型检测的试剂盒。实际检测时，取16份人基因组DNA溶液，采用CY3标记引物和不对称PCR方法(PCR弓l物见表2)，扩增出人基因组HLA-DRB1基因的第二外显子单链CY3标记片段。然后，取DNA微阵列玻片一对，在第一张玻片的16个杂交区域，分别加入16种PCR产物和杂交液在第二张玻片的对应区域，加入同样的成分。再将一对玻片放在自动杂交洗涤仪的两个杂交槽内，分别将第一、二张玻片的杂交温度设定为521C和45X:(521C和451C是经过实验验证适合所有HLA-DRB1分型探针的核实温度)，杂交时间30分钟后，自动洗涤吹干。然后取出玻片，放入扫描仪(Ge加Pix41加A)进行扫推，使用分析软件对扫描图像信号进行图像数据转换处理后，分析产生样本基因型别结果，本发明的试剂盒采用高密度DNA微阵列技术进行人类白细胞抗原基因进行检测和分型，可以大大提髙检测通量，每二张玻片可以制备用于检测16个样本的DNA微阵列，一般是现有检测技术的10倍以上同时，由于采用了双片双温度杂交的特殊方法，避免了现有产品因为杂交温度不适造成的探针杂交结果假阳性和假阴性问题，大大提高了产品的特异性。表lHLA-DRB1基因分型探针<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>D31CCTOATGCCGAGTACTO17D32GTTCCTGGAGAGATAC16D33GAGAGACACTTCCATAAC17表2PCR引物序列名称序列(5'-3')碱基数特异性PI-1TTCTGGCAGCTTMGTTTGMT22特异性扩增HLA-D腿l柏l艰.Pl-2TCTCCCCACAGCACGTTTCC21特异性扩增HLA-DRB1*07,15，16SPl-3TCAGGAGGCCGCCTGTGTCACT22特异性扩增HLA-DRB1*03,08,11,12,13,14飛Pl-4TCTTCCCCGGAGGCCGCTTCTGTA23特异性扩增HLA-D腿l的4艰Pl-5CGTTOTTCMGCAGGATMGTT23特异性扩增HLA-DRB論刑Pl~6GTTTCTTGGAGGAGGTTMGTT22特异性扩增HLA-D肪WIO荆P2TCGCCGCTCCACTGTCAAG19扩增HLA-DRM所有艰以下结合本发明的具体实施方式.附闞说明附图1HLA-DRB1基因分型DNA微阵列杂交区和探针微阵列示意图本发明用下列实施例进行解释，目的只是为了解释而不是以任何方式限制本发明。实施树1:HLA-DRB1基因分型DNA微阵列PCR引物和寡核苷酸探针的设计和合成为了采用特异性PCR扩增HLA-DRB1基因座位的第2外显子，分别在第1内含子末端至第2外显子的始端位置,设计特异性5'引物Pl-1,PI-2,PI-3,PI-4,PI-5和PI-6,以及在第2外显子末端位置设计3'共用引物P2。(引物序列见
发明内容的表2)针对HLA-D冊1第2外显子基因序列的多态性，设计33种分型探针，探针分为两组(见
发明内容的表1),第一组24种探针，杂交温度为52t:;第二组9种探针，杂交温度45"C。实施倒2:HLAH1RB1基因分型0NA像阵列的制备采用基因芯片自动点样仪，将33种分型探针和两种对照探针点制到玻片的特定区域，制成DNA微阵列。(1)点样探针溶液将探针稀释到5XSSC、0.05鄉DS溶液中，终浓度为30uM;(2)点样矩阵(如圑l)将探针分成二组，第一组24种分型探针，2种对照探针。第一组探针点制在第一张玻片上，分成16个杂交区，杂交区按照2列8行排列。在每个杂交区内，探针的排列方式是每种探针重复3点，每行3种探针，9点，共9行，第9行只有2种对照，6点。第二组9种分型探针，2种对照探针。排列方式同上，共4行，其中第4行只有2种对照，6点。实簾倒3,采用HLA-鹏1基因分型糊及銷果分析取16份已知基因型别的DNA样本，采用CY3标B的PCR引物，上下游引物1:30(分子数比)不对称PCR方法，PCR循环参数为941C5，；94"30"，58"30，，,72*C30，，，40循环；721C5，。取一对微阵列玻片，分别取16种PCR产物各2ul加到第一片的16孔和第二片的16孔，再在各孔加入杂交液(5XSSC)8ul，玻片放到自动杂交洗涤仪的2个槽内，设定杂交温度第一片的52C,第二片451C。杂交时间40腾。杂交后自动洗涤和风干。采用GnenPix4100A扫描仪，扫描杂交信号，得到杂交结果扫描图，并将图像转换成数据。采用分析软件，将以上数据自动分析转换成为各个样本的基因型别，检测结果与样本原基因型别完全相符。见表3。实施例说明了本发明产品在检测通量方面的优势(一次检測16个样本)和检测准确性方面的可靠性(检测结果与原样本结果完全相符)。表3使用本发明试剂盒的检测结果与样本真实基因型的比较<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>序判表<110>中山大学安达基闪股份有限公司<120>HLA-DRB1基因分型用微阵列芯片的制备及其用法<140><，41><,40<210>1<211>22<212>DNA<213>人工序判<220><223>根据特定核苷酸序判设计，以用作PCR扩增的引物,<400>1TO鹏CAfiCTTMGTTTGAAT<2!0>2<211>20<212>DNA<213>人工序判<220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCRT增的引物,<40O>2TGTCCCCACAGCACGTTTCC<210>3<2">22<212>DNA<213>人工序判<220><223>根据特定核苷酸序判设计，以用作PCR扩增的引物,<40O3TCAGGAGGCCGCOTTGTGACT<210>4<2，1>24<212>DNA<213>人工序判<220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCRT增的引物。<400>4TCTTOCCGGAGGCCGCTTCTGTA<210>5<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物,<400>5CGTTTCTTCMGCAGGATMGTT<210>6<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核普酸序判设计，以用作PCRT增的引物,<400>6GTTTCTTGGAGGAGGTTAAGTT<210>7<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核哲酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。<400>7TCGCCGCTGCACTGTGMG<210>8<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作寡ftWS6探针。<400>gTGCTGGGGATOCCTC<210>9<211>14<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核奢酸序列设计，以用作寡核苷酸探针。<400>9TOGAGCAGGCOCGG<210>10<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作寡核營酸探针。<400>10GCCTAAGAGGGAGTOTC<2">16<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作寡核苷酸探针。<400>11AGAAGCGGGGCCGGOT<210>12<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作寡核普酸探针,<400>12GTACTCTACGTCTGAGT<211>17<212>DNA<213>人工序判<220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作寡核苷,针。<400>13GAGCAGGTTAAACATGA<210>14<211>18<212>DNA<213>AXff'判<220><223>根据特定核ff酸序列设计，以用作寡核昔酸探针。<400>14CCTGATCCGGAGTACTOG<210>15<211>,7<212>DNA<2i3>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作寡核苷酸探针,<400>15CTCmCGGOTGAGTCTT<210>16<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作寡核苷酸探针。<400>16GTTCCTOGAGAGACACTT<210>17<2">16<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作寡核苷酸探针。<400>17GGAAGACGAGCGGGCC<210>18<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作寡核苷酸探针。<400>18CCTGCGTCGGAGCACTG<210>19<211>16<212>DNA<213>人工序列<220<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作寡核苷酸探针,<400>19GGAAGACGOGCGGGCC<210>20<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>《23>根据特定核苷酸序列设计，以用作寡核苷酸探针。<400>20GCAGGGTAAGTATAAGTG<210>21<211>16<2，2>DNA<213>人工序列<223>根据特定核苷酸序判设计，以用作寡核苷酸探针,<400>21GCGGGCCCTGGTGGAC<210>22<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>根lg^定核苷酸序判设计，以用作寡核苷酸探针。<400>22TGCGGTATCTGCACAGA<210>23<211>16<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序判设计，以用作寡核苷酸探针。<400>23AGACGCGTCCATAACC<210>24，>16<212>DNA<2!3>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作寡核香酸探针。<400>24AGACGCATCCATAACC<210>25<2">16<212>DNA<213>人工序列<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作寡核苷酸探针。<400>25GCGGGCCCTOGTGGAC<210>26<211>18<212>DNA<213>人IL序列<220<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作寡核苷酸探针,<400>26GCGGTATCTGCACAGAGG<2，0>27<211>18<212>DNA<213>人工序判<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作寡核苷酸探针。<400>27GAAAGACGCGTCCATAAC<210>28<211>19<212>DNA<2，3>AX序判<220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作寡核苷,针。<400>28GCCTCCTGGAAGACAGGCGO<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作寡核苷酸探针。<4,29CAGAAGGACCTCCTOGA<210>30<2">17<212>DNA<213>人Xff判<220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作寡核苷酸探针。<4,30CCAGGAGGAGTTCGTGC<2">18<213>人XIT'列<223>根据特定核苷酸序判设计，以用作寡核苷酸探针。<400>31ATAACCAGGAGGAGAACG<210>32<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作寡核苷酸探针。<400>3215GCCTAGCGCCGAGTACTO<2，0>33<2">16<212>DNA<2，3>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作寡核苷酸探针。<400>33CTACGGOOCTOTGGAG<210>34<211>16<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序判设计，以用作寡核苷酸探针。<400>34GACATCCTGGAGGACA<210>35<211>16<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核，序列设计，以用作寡核苷酸探针。<400>35CTACGGGGCTGTGOAG<210>36<2">17<212>DNA<213>人工序列<220><223>极据特定核苷酸序列设计，以用作寡核苷酸探针。<400>36GACATCCTOGAGGACAG<210>37<211>17々12>DNA<2!3>人x/r'判<2》<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作寡^t酸探针,<400>37GTGCGGTACCTOGACAG<210>38<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作寡核苷酸探针。<400>38CCTGATGCCGAGTACTO<210>39<211>16<212>ONA<213>人工序判<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作寡核苷酸探针,<400>39GTTCCTGGAGAGATAC<21C>40<211>18<212>DNA<213>人工序判<220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作寡核苷酸探针。<400>40GAGAGACACTTCCATAAC权利要求1、一种用于HLA-DRB1基因分型检测的试剂盒，其特征在于该试剂盒包括由载有寡核苷酸探针的在两张玻片构成的DNA微阵列芯片，并且杂交过程是在两个不同的温度下进行的。2、基于权利要求1所述的试拥盒，其特征还在于对同一样本的检測在两张DNA微阵列玻片上的两个杂交区进行。3、基于权利耍求1所述的试剂盒，其特征还在于所^是扩增HLA-DRB1第二外显+得到的7个特异性引物(Pl-l-Pl-7)和一个公用引物(P2):IM4TTGTGOCAGCTTAAGTTTGAATPl-2TGTCCCCACAGCACGTTTCCPl-3TCAGGAGGCCGCCTGTGTGACTP14TCTTCCCCGGAGGCCGCTTCTOTAPl-5CGTTTCTTGAAGCAGGATAAGTTPl_6GTTTCTTGGAGGAGGTTAAGTTP2TCGCCGCTGCACTGTGAAO。4、根据权利耍求1所述的试剂盒，其特征还在于该试剂盒用于临床移植配型和造血干细胞库HLA-DRB1基因分型检测，全文摘要本发明涉及一种临床检测用途的基因检测试剂盒，尤其是涉及采用DNA微阵列芯片以及双温度杂交探针，能够高通量、高效率、高特异性对人类白细胞抗原基因进行检测分型的试剂盒及其用法。文档编号C12Q1/68GK101314790SQ20071002828公开日2008年12月3日申请日期2007年5月30日优先权日2007年5月30日发明者何蕴韶,帆张,钢程,胡守旺,顺胥申请人:中山大学达安基因股份有限公司