专利名称：鱼类线粒体dna控制区扩增引物及其设计方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及鱼类鉴别技术领域，具体的说，涉及一种鱼类线粒体DNA控制区扩增引物及其设计方法和应用。
背景技术：
动物线粒体DNA(mtDNA)由于具有拷贝数高、分子量小而稳定、无组织特异性、一级结构进化速度快等特点，在遗传上具有自主性，是严格的母系遗传，已成为保护生物学和进化生物学研究一个强有力的工具。线粒体基因组由37个编码基因及一段主要的非编码区(控制区)组成，不同序列区域的进化速率不同。而位于编码脯氨酸(Pro)和苯丙氨酸(Phe)tRNA基因之间的区域是mtDNA上主要的非编码区，又称为控制区(control region)或D-loop区。一般认为，D-loop区是线粒体基因组上进化最快的部分，它的变异速率约为mtDNA完整分子或mtDNA分子上其它区域的5～10倍，适于亲缘关系较近的群体间的比较研究，是进行鱼类群体遗传结构揭示、濒危物种的遗传多样性程度鉴定等研究方面的重要遗传标记。
利用mtDNA D-loop碱基突变和重复序列区变异分析群体遗传纯度和鉴定不同群体、个体的亲缘关系已在许多动物研究中广泛开展。D-loop在mtDNA复制和转录中的特殊作用，使得D-loop结构和功能的研究成为mtDNA研究的热点。当前通过序列差异来鉴别外型上相似的鱼类是一种十分便利和准确的方法，其中线粒体控制区序列差异的研究，已应用于种类鉴别和分子系统进化分析等方面。
发明内容
本发明的目的在于提供一对可高效扩增鱼类线粒体DNA D-loop控制区的扩增引物。
本发明的另一个目的是提供上述引物的设计方法。
本发明的进一步目的是提供上述引物在鱼类种类鉴定、地理种群鉴别或种质资源评估中的应用。
本发明设计的鱼类线粒体DNA控制区扩增引物是一对简并引物，其上游引物MitD1-F有21个碱基CAC CCYTRR CTC CCAAAGCYA，下游引物MitD1-R有23个碱基GGT GCG GRK ACT TGC ATGTRT AA。
本发明的鱼类线粒体DNA控制区扩增引物设计的步骤为登陆GenBank搜索目前已测定线粒体DNA全序列的161种鱼类的线粒体控制区(D-loop)基因，去掉不完全和部分的序列，主要选取淡水鱼类的线粒体的D-loop基因序列进行同源性比较，寻找保守序列，利用简并性原则，获得一对通用的简并引物其上游引物MitD1-F有21个碱基CAC CCY TRR CTC CCA AAG CYA，下游引物MitD1-R有23个碱基GGT GCG GRK ACT TGC ATG TRT AA。扩增片断大小在1kb左右。
可扩增多数鱼类线粒体DNA D-loop控制区基因的简并引物PCR反应体系和反应条件如下
PCR反应体系为28μL，内含dNTP(1mM)、Ex Taq Buffer(10×)、10μM的引物MitD1-F和引物MitD1-R、Ex-Taq酶、含50～150ng的DNA模板溶液、ddH2O。
Ex Taq Buffer(10×)2.5μLdNTPs 2μLMitD1-F2μLMitD1-R1.5μLTemplate 1μLddH2O 19μLEx-Taq酶 0.1μL扩增条件为92℃预变性5min，然后98℃变性10s，54℃退火20s，72℃延伸60s，共33个循环，最后在72℃充分延伸10min。扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测其大小、纯度及亮度。
本发明所述的鱼类线粒体DNA控制区扩增引物能扩增鱼类线粒体DNA D-loop控制区基因，均能获得单一的目的DNA片段，产物大小为1kb左右，并对所有PCR扩增产物进行直接测序。其步骤为PCR扩增产物经初步定量后，浓度达100ng/μl的样品委托公司进行双向直接测序，测序引物为扩增引物MitD1-F(10μM)和MitD1-R(10μM)，序列分析仪为ABI 3730型全自动DNA测序仪。
本发明所述的鱼类线粒体DNA控制区扩增引物，运用设计的简并引物扩增部分重要经济鱼类和外来物种鱼类线粒体DNA D-loop控制区基因，均能获得单一的目的DNA片段，产物大小为1kb左右，并对所有PCR扩增产物进行胶回收纯化并测序。其步骤为PCR扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测大小、纯度和亮度，采用Omega公司的E.Z.N.ARGel Extraction Kit进行割胶纯化，切割目的DNA片断，严格按照试剂盒的实验步骤进行纯化，取1μl纯化产物电泳检查，并与marker条带比较以初步定量，纯化产物委托公司进行双向直接测序，测序引物为扩增引物MitD1-F(10μM)和MitD1-R(10μM)，序列分析仪为ABI 3730型全自动DNA测序仪。
本发明所述的鱼类线粒体DNA控制区扩增引物，运用设计的简并引物扩增部分重要经济淡水鱼类和外来物种鱼类线粒体DNAD-loop控制区基因，均能获得单一的目的DNA片段，产物大小为1kb左右，并对所有PCR扩增产物进行胶回收纯化，纯化的PCR产物与pMD19 T Vector连接，转化，鉴定阳性克隆并测序。其步骤为经胶回收纯化的PCR扩增产物在连接酶的作用下与Takara公司的pMD19-T vector进行连接反应。连接体系为T-vector 1μL，PCR纯化产物4.2μL，Buffer 5μL。连接操作在冰上进行，连接反应液置于12℃，连接2h以上。同时选用大肠杆菌E.Coli DH5α采用CaCL2法制备新鲜感受态细胞，热激法进行转化，用均匀涂布50μl 20mg/ml的X-Gal和50μl 0.2mol/L的IPTG的含有Amp的LB平板进行蓝白斑显色，筛选阳性克隆(重组子)，并应用菌落PCR扩增以确诊真正的阳性克隆。阳性克隆经扩大培养后的菌液或提取质粒后委托公司进行双向直接测序，测序引物为扩增引物MitD1-F(10μM)和MitD1-R(10μM)，序列分析仪为ABI 3730型全自动DNA测序仪。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果本发明的鱼类线粒体DNA控制区扩增引物对广东省珠江流域主要的野生淡水鱼类线粒体DNAD-loop控制区基因进行扩增，均能获得单一的目的DNA片断，特异性扩增产物大小为1kb左右，经测序及与GenBank上同源序列的比较，证实为包含线粒体控制区全序列的扩增产物。本发明设计的鱼类线粒体DNA控制区扩增引物可以快速地对多种鱼类进行大规模的遗传背景分析，准确鉴定某些难于鉴别的近缘物种，为我国鱼类的种类鉴定、地理种群鉴别或种质资源的评估提供了重要的工具。
图1、图2、图3均为MitD1-F/MitD1-R扩增不同鱼类线粒体DNA控制区的电泳图谱。
其中MDNA分子量标准(DL2000)，1～38依次为线纹尖塘鳢、云斑尖塘鳢、北江光唇鱼、河豚、雀鳝、唐鱼、斑鱯、斑鳢、赤眼鳟、鳜鱼、鲫鱼、金鲫、鲤鱼、鲢鱼、鲮鱼、罗非鱼、泥鳅、三角鲂、中华倒刺鲃、山斑、宽鳍鱲、塘虱、鳙鱼、海南拟餐、似鮈、银鮈、鲀吻鮠、平舟原缨口鳅、伍氏华吸鳅、东陂拟腹吸鳅、美丽小条鳅、美丽沙鳅、中华花鳅、刺鳅、福建纹胸鮡、半刺光唇鱼、东方墨头鱼、长脂拟鲿。
具体实施例方式
登陆GenBank搜索目前已测定线粒体DNA全序列的161种鱼类的线粒体控制区(D-loop)基因，去掉不完全和部分的序列，主要选取淡水鱼类的线粒体的D-loop基因序列进行同源性比较，寻找保守序列，利用简并性原则，获得一对通用的简并引物其上游引物MitD1-F有21个碱基CAC CCY TRR CTC CCAAAG CYA，下游引物MitD1-R有23个碱基GGT GCG GRK ACT TGC ATG TRT AA。扩增片断大小在1kb左右。
可扩增多数鱼类线粒体DNA D-loop控制区基因的简并引物PCR反应体系和反应条件如下PCR反应体系为28μL，内含dNTP(1mM)、Ex Taq Buffer(10×)、10μM的引物MitD1-F和引物MitD1-R、Ex-Taq酶、含50～150ng的DNA模板溶液、ddH2O。
Ex Taq Buffer(10×) 2.5μLdNTPs2μLMitD1-F 2μLMitD1-R 1.5μLTemplate 1μLddH2O19μLEx-Taq酶 0.1μL扩增条件为92℃预变性5min，然后98℃变性10s，54℃退火20s，72℃延伸60s，共33个循环，最后在72℃充分延伸10min。扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测其大小、纯度及亮度。
本发明所述的鱼类线粒体DNA控制区扩增引物及其设计和应用，运用设计的简并引物扩增多数淡水鱼类线粒体DNA D-loop控制区基因，均能获得单一的目的DNA片段，产物大小为1kb左右，并对所有PCR扩增产物直接进行测序。其步骤为PCR扩增产物经初步定量后，浓度达100ng/μl的样品委托公司进行双向直接测序，测序引物为扩增引物MitD1-F(10μM)和MitD1-R(10μM)，序列分析仪为ABI3730型全自动DNA测序仪。
本发明所述的鱼类线粒体DNA控制区扩增引物及其设计和应用，运用设计的简并引物扩增部分重要经济鱼类和外来物种鱼类线粒体DNA D-loop控制区基因，均能获得单一的目的DNA片段，产物大小为1kb左右，并对所有PCR扩增产物进行胶回收纯化并测序。其步骤为PCR扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测大小、纯度和亮度，采用Omega公司的E.Z.N.ARGel Extraction Kit进行割胶纯化，切割目的DNA片断，严格按照试剂盒的实验步骤进行纯化，取1μl纯化产物电泳检查，并与marker条带比较以初步定量，纯化产物委托公司进行双向直接测序。测序引物为扩增引物MitD1-F(10μM)和MitD1-R(10μM)。序列分析仪为ABI 3730型全自动DNA测序仪。
本发明所述的鱼类线粒体DNA控制区扩增引物及其设计和应用，其特征在于运用设计的简并引物扩增部分重要经济淡水鱼类和外来物种鱼类线粒体DNA D-loop控制区基因，均能获得单一的目的DNA片段，产物大小为1kb左右，并对所有PCR扩增产物进行胶回收纯化，纯化的PCR产物与pMD19 T Vector连接，转化，鉴定阳性克隆并测序。其步骤为经胶回收纯化的PCR扩增产物在连接酶的作用下与Takara公司的pMD19-T vector进行连接反应。连接体系为T-vector 1μL，PCR纯化产物4.2μL，Buffer 5μL。连接操作在冰上进行，连接反应液置于12℃，连接2h以上。同时选用大肠杆菌E.ColiDH5α采用CaCL2法制备新鲜感受态细胞，热激法进行转化，用均匀涂布50μl 20mg/ml的X-Gal和50μl 0.2mol/L的IPTG的含有Amp的LB平板进行蓝白斑显色，筛选阳性克隆(重组子)，并应用菌落PCR扩增以确诊真正的阳性克隆。阳性克隆经扩大培养后的菌液或提取质粒后委托公司进行双向直接测序。测序引物为扩增引物MitD1-F(10μM)和MitD1-R(10μM)。序列分析仪为ABI 3730型全自动DNA测序仪。
采用本发明的鱼类线粒体DNA控制区扩增引物对广东省珠江流域主要的淡水鱼类线粒体DNA D-loop控制区基因进行扩增，均能获得单一的目的DNA片断，特异性扩增产物大小为1kb左右，经测序及与GenBank上同源序列的比较，证实为包含线粒体控制区全序列的扩增产物。其主要扩增的淡水鱼类包括以下种类线纹尖塘鳢、云斑尖塘鳢、北江光唇鱼、河豚、雀鳝、唐鱼、斑鱯、斑鳢、赤眼鳟、鳜鱼、鲫鱼、金鲫、鲤鱼、鲢鱼、鲮鱼、罗非鱼、泥鳅、三角鲂、中华倒刺鲃、山斑、宽鳍鱲、塘虱、鳙鱼、海南拟餐、似鮈、银鮈、鲀吻鮠、平舟原缨口鳅、伍氏华吸鳅、东陂拟腹吸鳅、美丽小条鳅、美丽沙鳅、中华花鳅、刺鳅、福建纹胸鮡、半刺光唇鱼、东方墨头鱼、长脂拟鲿。其电泳图谱如图1、图2、图3所示，从而可对这些鱼进行分析鉴别。
鱼类线粒体DNA控制区扩增引物及其设计方法和SEQUENCE LISTING<110>中山大学<120>鱼类线粒体DNA控制区扩增引物及其设计方法和应用<130>
<160>1<170>Patent In version 3.2<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>1引物MitD1-FCAC CCY TRR CTC CCA AAG CYA<210>2<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>2引物MitD1-RGGT GCG GRK ACT TGC ATG TRT AA
权利要求
1.鱼类线粒体DNA控制区扩增引物，其特征在于是一对简并引物，其上游引物MitDl-F有21个碱基CAC CCY TRR CTC CCAAAGCYA；下游引物MitDl-R有23个碱基GGT GCG GRKACTTGC ATGTRTAA。
2.权利要求1所述扩增引物的设计方法，其特征在于包括如下步骤找出已测定线粒体DNA全序列的161种鱼类的线粒体控制区基因，去掉不完全和部分的序列，选取鱼类线粒体的D-loop基因序列进行同源性比较，寻找保守序列，利用简并性原则，从而获得一对通用的简并引物。
3.权利要求1所述鱼类线粒体DNA控制区扩增引物在鱼类种类鉴定、地理种群鉴别或种质资源评估中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种鱼类线粒体DNA控制区扩增引物及其设计方法和应用。本发明设计的鱼类线粒体DNA控制区扩增引物是一对简并引物，其上游引物MitDl－F有21个碱基CAC CCY TRR CTCCCAAAG CYA，下游引物MitDl－R有23个碱基GGT GCG GRK ACTTGC ATG TRT AA。本发明设计的鱼类线粒体DNA控制区扩增引物可以快速地对多种鱼类进行大规模的遗传背景分析，准确鉴定某些难于鉴别的近缘物种，为我国鱼类的种类鉴定、地理种群鉴别或种质资源的评估提供了重要的工具。
文档编号C12N15/11GK101086014SQ20071002824
公开日2007年12月12日 申请日期2007年5月25日 优先权日2007年5月25日
发明者黄志坚, 徐晓鹏, 唐晶晶, 张飓, 何建国 申请人:中山大学