专利名称：一种重组葡激酶及其高效分泌表达的方法
技术领域：
本发明涉及一种生物菌株及其制备方法，具体地说是一种葡萄球 菌激酶及利用生物技术高效分泌表达重组葡萄球菌激酶的方法。
技术背景葡萄球菌激酶(Staphylokinase， SAK)是一种由某些金黄色葡萄 球菌(6YapA77ococcM 产生的外分泌蛋白，相对分子量为15.5-18.0kDa。早在1948年，Lack发现金黄色葡萄球菌培养物上清液 中有一种蛋白质(SAK)能溶解人血栓，就引起了许多学者的兴趣， 但由于天然SAK来源少、制剂纯度不高等一直限制了它的进一步研究 和应用。近年来研究者成功地克隆了^A基因，并在大肠杆菌、枯草 杆菌、链球菌和乳球菌中较好地表达了SAK蛋白，从此以临床应用为 目的的有关重组葡激酶的溶栓作用机制、结构和功能的研究以及建立 在此基础上的蛋白质工程研究成为近年来新型溶栓剂研究的热点之 一。关于SAK的研究使人们认识到了它是一种非常有前景的溶栓药， 其溶栓效果与组织纤溶酶原激活物(tissue-type plasminogen activator, t_PA)相近，但对血栓的选择性高于t-PA，并且在大肠杆 菌中可以实现低成本大规模生产，市场价格远低于t-PA。作为新一代 溶栓药物，SAK以其专一性高，出血副作用小的特点受到人们的广泛 关注。在动物模型中，SAK表现出比尿激酶(UK)和链激酶(SK)更 好的应用效果，故其应用前景非常被看好。但早期的报道中重组SAK 多以包含体存在，须经过变性、复性后才能得到有活性的表达产物； 国内早期的研究成果已于2005年拿到了世界第一张重组SAK的新药证 书，但这并未能推广SAK的应用，这与其价格仍高于普通病人的支付 能力是分不开的；所以本研究拟从金黄色葡萄球菌中分离葡激酶基因，构建其原核表达质粒并期望得到其在大肠杆菌中分泌表达的工程菌，为降低葡激酶的生产成本及临床推广应用打下基础。Sako等于 1983年首先克隆了ssA基因，并在大肠杆菌中实现表达。随后关于^A 克隆和表达方面的研究日益增多。Sang Jun Lee等(High level secretion of recombinant staphylokinase into periplasm of ^!sc力eric力j'a ccJj'，Biotechnology Letters, 1998)公开了——禾中在大肠杆菌中分泌表达葡激酶的方法，其构成是用PCR技术从含有s^ 基因的金葡菌株NCTC10033中经PCR扩增得到大量saA，并插入含有一 个tac启动子和一个ompA信号序列的表达载体pKK-ompA，转化到大肠 杆菌JM109， JM109携带重组质粒分泌产生重组SAK: 15mg/L到外周胞 质，5mg/L到胞外，不足之处是产量较低。宋钢等(低免疫原性的新 型葡激酶A醒Sak在大肠杆菌中的高效表达和分离纯化，中国生物化学与分子生物学报，2000)公开了一种在大肠杆菌中高效表达低疫原 性的新型葡激酶的方法，其构成是对已构建的葡激酶N端缺失突变 体(ANSak) cDNA进行改造后得到A丽Sak，插入原核表达载体pLY-4 后转化JF1125，经温度诱导，重组蛋白占菌体总蛋白的60%，以包含 体形式存在，不足之处是以包含体形式存在，须经过变性、复性后才 能得到有活性的表达产物。 发明内容本发明的目的就是针对现有技术的缺陷，提供一种葡萄球菌激酶 及利用生物技术高效分泌表达重组葡萄球菌激酶的方法，它克服了现 有技术表达量低及产量低的缺点。本发明的生物样品保藏号为CCTCC NO: M207112,生物样品名称 为大肠杆菌BL21-EpSS/pGEX-4T-l，保藏单位为中国典型培养物保 藏中心，地址湖北省武汉市武汉大学内，邮编430072，保藏日期 为2007年7月23日，其制备方法包括以下几个步骤(1)扩增葡激酶基因从中国菌种保藏中心购买金黄色葡萄球菌(6YapAWococc^ aw7^a5) AS 1.879，以该菌株染色体DNA为模板，根据已知的葡激酶基 因(含信号肽)的序列设计用于PCR的上游引物 5， - GCGAATTCATGCTCAAAAGAAGTTTAT-3';和下游引物5' -CCGTCGACTTATTTCTTTTCTATAACAAC-3，。 其中GAATTC为fcoM酶切位点，GTCGAC为&Z[酶切位点，ATG为起始密 码子，TTA为终止密码子。通过PCR直接扩增葡激酶基因，与pMD-18T 质粒载体重组后，经核苷酸序列分析得到以下序列tea agt tea ttc gac aaa gga aaa tat aaa aaa ggc gat gac gcg agt 48 Ser Ser Ser Phe Asp Lys Gly Lys Tyr Lys Lys Gly Asp Asp Ala Ser 15 10 15tat ttt gaa_ cca_ a_ca ggc ccg t3t ttg atg gt已gtg axt gga gtt 96 Tyr Phe Glu Pro Thr Gly Pro Tyr Leu Met Val Asn Val Thr Gly Val 20 25 30gag ggt aaa gaa aat gaa ttg eta tec cct cat tat gtc gag ttt cct 144 Glu Gly Lys Glu Asn Glu Leu Leu Ser Pro His Tyr Val Glu Phe Pro 35 40 45att aaa cct ggg act aca ctt aca aaa gaa aaa att gaa tac tat gtc 192 lie Lys Pro Gly Thr Thr Leu Thr Lys Glu Lys lie Glu Tyr Tyr Val 50 55 60gaa tgg gca tta gat gcg aca gca tat aaa gag ttt aga gta gtt gaa 240 Glu Trp Ala Leu Asp Ala Thr Ala Tyr Lys Glu Phe Arg Val Val Glu 65 70 75 80tta gat cca age gca aag ate gaa gtc act tat tat gat aag aat aag 288 Leu Asp Pro Ser Ala Lys lie Glu Val Thr Tyr Tyr Asp Lys Asn Lys 85 90 95aaa aaa gaa gaa acg aag tct ttc cct ata aca gaa aaa ggt ttt gtt 336 Lys Lys Glu Glu Thr Lys Ser Phe Pro lie Thr Glu Lys Gly Phe Val 100 105 110gtc cca gat tta tea gag cat att aaa aac cct gga ttc aac tta att 384 Val Pro Asp Leu Ser Glu His lie Lys Asn Pro Gly Phe Asn Leu lie 115 120 125aca aag gtt gtt at已gaa aag aaa taa 411 Thr Lys Val Val lie Glu Lys Lys 130 135与其他专利报道的序列不同处第99位核苷酸为G;第100位 核苷酸为G;第107位核苷酸为A。第33位氨基酸为GLU;第34 位氨基酸为GLY;第3 6位氨基酸为GLU。(2) 将扩增的葡激酶基因与载体pGEX-4T-1连接，构建成表达质粒 将上述克隆的葡激酶基因与原核表达质粒pGEX-4T-l分别用Aco^/^I[双酶后，然后进行连接，构建成表达质粒并命名为pSS。(3) 用所构建的表达质粒转化大肠杆菌￡ coh'(^sc力ehch's BL21将上述构建的表达质粒转化大肠杆菌A coh' BL21，用IPTG诱导 r-Sak基因的表达，工程菌命名为EpSS。(4) 培养转化的大肠杆菌EpSS在培养基初始pH6. 6、蔗糖2%、诱导前菌体密度为0.8、 IPTG 终浓度为O. 8ramol/L、 25"诱导9h条件下胞质及胞外重组葡激酶活性 均达最高值。本发明用PCR构建基因，基因表达水平极高，r-SAK以分泌方式表 达，以活性状态存在于菌体外胞质及胞外，纯化方法简单，产量高， 成本低。用本发明的方法在大肠杆菌中表达重组葡激酶蛋白，表达产 物以分泌方式表达，其中外胞质中约20% (300mg/U，胞外约50%(40 mg/L)，且总产量约为340mg/L。本方法不仅在大肠杆菌中表达了可溶 性，有活性的葡激酶，而且分泌表达的表达量及产量均高于已知方法。 说明书附l.是pSS重组质粒的构建。图2.是EpSS外胞质中表达产物鉴定，其中M:蛋白Marker， l:经 诱导的EpGEX;2: EpSS表达的胞内可溶性蛋白。图3.是EpSS胞外表达产物鉴定，其中M:蛋白Marker， l:经诱导的 EpGEX;2: EpSS表达的胞外蛋白，3: EpSS表达的胞内可溶性蛋白图4.是表达产物体外溶栓活性鉴定。其中1.2: SAK标准品，3.4: 阴性对照，5.6:胞内可溶性蛋白，7.8:发酵液上清(胞外蛋白)具体实施方式
以下通过实施例对本发明作详细描述 实施例一Sak基因工程菌的构建 1、引物设计及PC財广增根据已知的葡激酶基因(含信号肽)的序列设计上游含有^^/ I 酶切位点、启动子和葡激酶信号肽的引物，其序列为5， - GCGAATTCATGCTCAAAAGAAGTTTAT-3，； 和下游含有5"a JI酶切位点和终止子的引物5' -CCGTCGACTTATTTCTTTTCTATAACAAC-3'。 其中GAATTC为fco/a酶切位点，GTCGAC为6W頂每切位点，ATG为起始密 码子，TTA为终止密码子。引物合成后，以金黄色葡萄菌ASl. 879菌株染色体DNA为模板，循 环参数为94。C45秒一45。C60秒一7(TC70秒，经30个循环，得到ssA 基因片段。2、 cDNA克隆及测序将PCR扩增得到的^^基因片段经P/。琼脂糖凝胶回收纯化后，与载 体质粒pMD-18T重组，转化大肠杆菌，筛选出含有^^基因的阳性菌株， 命名为pTSS (图l)。对其进行DNA序列测定，与预期一致。3、 cDNA在大肠杆菌中的表达 pTSS质粒经^co7a/^刀双酶切，回收ssA基因片段。原核表达载体 口&￡乂-47-1经^^7 [/&^1双酶切，回收大片段，与回收的ssA基因重组， 转化大肠杆菌(图2)。用氨苄青霉素-LB平板筛选，挑取单个菌落， 制备质粒，进行PCR及酶切鉴定，含有ssA基因特征的质粒命名为pSS， 菌株命名为EpSS。 EpSS在37X:培养至朋6。。约0. 6后，力口IPTG 0. lmM(终 浓度)诱导4-6小时后，离心集菌并保留发酵液上清，分别对菌体沉淀(图3)和发酵液上清(图4)进行SDS-PAGE分析。4、 表达产物测定(1) 存在状态测定对工程菌诱导后的培养基上清进行生物活性 测定阳性，且SDS-PAGE显示培养基上清中有约15. 5kDa的特异蛋白带， 说明表达产物以分泌状态存在；对诱导后的工程菌超声破碎离心，离 心上清分别进行活性测定和SDS-PAGE分析，结果显示表达产物以可溶的、活性状态存在。(2) 生物活性测定a.标准曲线的制备称取O. lg琼脂糖加入18.6mL灭菌生理盐水中，加 热溶解后置56。C水浴中平衡，加入100IU/mL凝血酶11. 2 u L， 0. 5mg/mL人纤溶酶原224nL，混匀后加入6mg/mL的人纤维蛋白原1.76mL后，不停摇匀待浑浊后立即灌入准备好的蛋白电泳板中，充分凝固后，4°C 冰箱中放置30min后，打2mm孔，每孔加入2. 5化不同稀释浓度的SAK 标准品，做复孔，置湿盒中37'C孵育12h。纵横向量取溶圈直径，取 平均值，以标准品溶液各个稀释度的生物学活性的对数对相应的溶圈 直径的对数进行直线回归，求得回归方程。b.样品测定以同样方法制备纤维蛋白板、打孔。将诱导后的 工程菌离心，留取培养基上清及超声破碎后的工程菌上清，并将超声 破碎后的工程菌上清稀释10倍备用。每孔加入准备好的蛋白样品2. 5 叱，置湿盒中37。C孵育12h后测量溶圈直径。每个样品做三次取平 均值，根据供试品的溶圈直径的对数求供试品的生物学活性。测得的 总活性为2435AU/mL工程菌。 实施例二 EpSS工程菌诱导条件的初步研究根据工程菌EpSS培养过程中涉及的因素，选择IPTG浓度 (腿ol/U、诱导时间(h)、汉U吸光度、培养基的pH值、培养基中蔗糖含量和诱导温度rc)六个因素，每因素根据实际情况选择几个水平做单因素实验。将所做的单因素实验得到的蛋白样品进行活性测 定，得到EpSS在培养基初始p朋.6、蔗糖2%、诱导前菌体密度为0. 8、 IPTG终浓度为0. 8咖ol/L、 25t:诱导9h条件下胞质及胞外重组葡激 酶活性均达最高值，每升发酵液可收获2. 435*106AU的重组葡激酶蛋 白。SSAK-DNAAA-SEQUENCE. ST25. seq SEQUENCE LISTING<110〉 三峡大学<120> —种重组葡激酶及其高效分泌表达的方法 <130〉 070903 <160> 1<170> Patentln version 3. 3〈210〉 1〈211〉 411〈212〉 DNA<213〉 Escherichia coli<220〉<221> exon<222> (1).. (411)〈223〉 n X〈400〉 1tea agt tea ttc gac aaa gga aaa tat aaa aaa ggc gat gac gcg agt 48 Ser Ser Ser Phe Asp Lys Gly Lys Tyr Lys Lys Gly Asp Asp人la Ser 15 10 15tat ttt gaa cca aca ggc ccg tat ttg atg gta aat gtg act gga gtt % Tyr Phe Glu Pro Thr Gly Pro Tyr Leu Met Val Asn Val Thr Gly Val 20 25 30gag ggt aaa gaa aat gaa ttg eta tec cct cat tat gtc gag ttt cct 144 Glu Gly Lys Glu Asn Glu Leu Leu Ser Pro His Tyr Val Glu Phe Pro 35 40 45att a犯cct ggg act aca ctt aca aaa gaa aaa att gaa tac tat gtc 192 lie Lys Pro Gly Thr Thr Leu Thr Lys Glu lys lie Glu Tyr Tyr Val 5b ' 55 60gaa tgg gca tta gat gcg aca gca tat aaa gag ttt aga gta gtt gaa 240 Glu Trp Ala Leu Asp Ala Thr Ala Tyr Lys Glu Phe Arg Val Val Glu 65 70 75 80tta gat cca age gca aag ate gaa gtc act tat tat gat aag aat aag 288 Leu Asp Pro Ser Ala Lys lie Glu Val Thr Tyr Tyr Asp Lys Asn Lys 85 90 95aaa aaa gaa gaa acg aag tct ttx cct ata aca gaa aaa ggt ttt gtt 336 Lys Lys Glu Glu Thr Lys Ser Phe Pro lie Thr Glu Lys Gly Phe Val 100 105 110gtc cca gat tta tea gag cat att aaa aac cct gga ttc aac tta att 384 Val Pro Asp Leu Ser Glu His lie Lys Asn Pro Gly Phe Asn Leu lie 115 120 125aca aag gtt gtt ata gaa aag aaa taa_ 411 Thr Lys Val Val lie Glu Lys Lys 130 l!3权利要求
1、一种葡萄球菌激酶，其核苷酸序列如下tca agt tca ttc gac aaa gga aaa tat aaa aaa ggc gat gac gcg agt 48Ser Ser Ser Phe Asp Lys Gly Lys Tyr Lys Lys Gly Asp Asp Ala Ser1 5 10 15tat ttt gaa cca aca ggc ccg tat ttg atg gta aat gtg act gga gtt 96Tyr Phe Glu Pro Thr Gly Pro Tyr Leu Met Val Asn Val Thr Gly Val20 25 30gag ggt aaa gaa aat gaa ttg cta tcc cct cat tat gtc gag ttt cct 144Glu Gly Lys Glu Asn Glu Leu Leu Ser Pro His Tyr Val Glu Phe Pro35 40 45att aaa cct ggg act aca ctt aca aaa gaa aaa att gaa tac tat gtc 192Ile Lys Pro Gly Thr Thr Leu Thr Lys Glu Lys Ile Glu Tyr Tyr Val50 55 60gaa tgg gca tta gat gcg aca gca tat aaa gag ttt aga gta gtt gaa 240Glu Trp Ala Leu Asp Ala Thr Ala Tyr Lys Glu Phe Arg Val Val Glu65 70 75 80tta gat cca agc gca aag atc gaa gtc act tat tat gat aag aat aag 288Leu Asp Pro Ser Ala Lys Ile Glu Val Thr Tyr Tyr Asp Lys Asn Lys85 90 95aaa aaa gaa gaa acg aag tct ttc cct ata aca gaa aaa ggt ttt gtt 336Lys Lys Glu Glu Thr Lys Ser Phe Pro Ile Thr Glu Lys Gly Phe Val100 105 110gtc cca gat tta tca gag cat att aaa aac cct gga ttc aac tta att 384Val Pro Asp Leu Ser Glu His Ile Lys Asn Pro Gly Phe Asn Leu Ile115 120 125aca aag gtt gtt ata gaa aag aaa taa 411Thr Lys Val Val Ile Glu Lys Lys130 135其分类命名为大肠杆菌BL21-EpSS/Pgex-4T-1，保藏号为CCTCCNOM207112。
2、 一种高效分泌表达重组葡萄球菌激酶的方法，它包括以下几个步骤(1) 以金黄色葡萄球菌(6Y，力j^ococc〃5" a〃re〃s) AS1. 879的 菌株染色体DNA为模板，以5' - GCGAATTCATGCTCAAAAGAAGTTTAT-3， 作为上游引物，以5， -CCGTCGACTTATTTCTTTTCTATAACAAC-3，作为下 游引物进行PCR扩增，其中GAATTC为^bo^酶切位点，GTCGAC为&^1 酶切位点，ATG为起始密码子，TTA为终止密码子，引物合成后，以金 黄色葡萄菌ASl. 879菌株染色体DNA为模板，得到葡激酶基因基因片 段；(2) 将上述克隆的葡激酶基因与原核表达质粒pGEX-4T-l分别用i5bo^/6^Z[双酶后，然后进行连接，构建成表达质粒并命名为pSS;(3) 将上述构建的表达质粒转化大肠杆菌A coh'BL21，用IPTG 诱导r-Sak基因的表达，工程菌命名为EpSS。(4) 筛选出含有ssA基因的阳性菌株，得到葡萄球菌激酶。
3、 根据权利要求2所述的一种高效分泌表达重组葡萄球菌激酶的 方法，其中引物合成后，以金黄色葡萄菌AS1.879菌株染色体DNA为模 板，循环参数为94"45秒一45。C60秒一7(TC70秒，经30个循环，得到s^基因片段。
4、 根据权利要求2所述的一种高效分泌表达重组葡萄球菌激酶的 方法，其中EpSS在培养基初始p朋.6、蔗糖2%、诱导前菌体密度为O. 8、 IPTG终浓度为O. 8mmol/L、 25。C诱导9h条件下进行表达。
全文摘要
一种葡萄球菌激酶及利用生物技术高效分泌表达重组葡萄球菌激酶的方法。它以金黄色葡萄球菌的总DNA为模板，通过PCR扩增，获得含信号肽的葡激酶(Sak)基因。该基因序列第33、34及36位氨基酸，不同于已报道的Sak基因。将该基因与载体pGEX-4T-1进行连接，转化宿主菌，获得的重组工程菌，经IPTG诱导可分泌表达具有纤溶酶原激活作用的重组葡激酶。采用本发明方法表达重组葡激酶蛋白，基因表达水平高，表达产物主要为分泌型蛋白，并以活性状态存在于菌体外胞质及胞外，因此，纯化工艺简单，产量高，生产成本低。
文档编号C12N9/48GK101240284SQ200710053340
公开日2008年8月13日 申请日期2007年9月20日 优先权日2007年9月20日
发明者乐超银, 敏 刘, 伟 姚, 戴建武, 薇 梁, 梁宏伟, 伟 谢, 郭政红, 凡 陈, 陈发菊 申请人:三峡大学