专利名称：分离和纯化的方法
技术领域：
本发明涉及用于制备S西酞普兰(escitalopram)的旋光中间体新的制备方法，其包括选择性酶酰化或脱酰化作用。
背景技术：
西酞普兰是已知的抗抑郁药，已上市若干年。
它是选择性的中枢作用血清素(5-羟基色胺；5-HT)再摄取抑制剂，因此具有抗抑郁活性。
西酞普兰在DE 2,657,013中首次公开，相应于US 4,136,193，专利公开说明了由相应的5-溴-衍生物通过与氰化亚铜在合适的溶剂中反应和通过5-溴-phtalane的烷基化制备西酞普兰的方法。
相应于EP-B1-347 066的US 4,943,590描述了制备S西酞普兰(西酞普兰的S-对映体)的两种方法。
两种方法使用下式的外消旋二醇作为原料。
根据第一种方法，式(I)的二醇与对映体纯的酸衍生物，例如(+)或(-)-α-甲氧基-α-三氟甲基-苯基乙酰基氯反应以形成非对映体酯的混合物，它们用HPLC或分馏结晶分离，随后具有合适立体化学的酯对映体选择性地转化为S西酞普兰。根据第二种方法，式(II)的二醇通过用对映体纯的酸，例如(+)-二-对甲苯酰基酒石酸的立体选择性结晶分离成对映体，随后式(A)的二醇S对映体对映体选择性地转化为S西酞普兰。
S西酞普兰目前已开发为抗抑郁药，因此，人们需要制备S西酞普兰的改进方法。
我们现在发现上述式(I)的二醇的S-对映体以及其酰化衍生物可通过在对映体二醇中的伯羟基的选择性酶酰化得到高旋光纯度的S-二醇或其酰化衍生物，随后得到的对映体可通过一系列分离和纯化操作分离而制备。
发明内容
因此，本发明涉及新的制备下式二醇的S-或R-对映体或其盐的方法 其中R是氰基或可转化为氰基的基团，Z是基团-CH2-N(R′R″)，其中R′和R″是C1-6烷基或R′和R″互相连接以形成包括与它们连接的N-原子的环结构，或Z是可转化为二甲基氨基甲基的基团，虚线表示双键或单键，Hal是卤素，和/或制备下式的酰化二醇的相反对映体或其盐的方法
其中R、Z、虚线和Hal是如上定义的，W是O或S，R3是-Y-R1，其中R1是C1-10-烷基、C2-10-烯基或C2-10-炔基，它们均可任选被取代基取代一次或多次，取代基选自C1-10-烷氧基、C1-10-烷硫基、羟基、卤素、氨基、硝基、氰基、C1-10-烷基氨基、二(C1-10-烷基)氨基、芳基、芳氧基、芳硫基和杂芳基，或R1是芳基；其中任何芳基和杂芳基可任选被取代基取代一次或多次，取代基选自C1-10-烷基、C2-10-烯基、C2-10-炔基、C1-10-烷氧基、C1-10-烷硫基、羟基、卤素、氨基、硝基、氰基、C1-10-烷基氨基和二(C1-10-烷基)氨基，和Y是键、O、S或NH，其包括a)使下式的外消旋化合物 其中R、Z、虚线和Hal是如上定义的，使用下式的酰化试剂 或式R1-N＝C＝O的异氰酸酯或式R1-N＝C＝S的硫代异氰酸酯进行选择性酶酰化其中X是O或S；W是O或S；U是O或S，V是卤素；R0是C1-10-烷基、C2-10-烯基或C2-10-炔基，它们均可任选被取代基取代一次或多次，取代基选自C1-10-烷氧基、C1-10-烷硫基、羟基、卤素、氨基、硝基、氰基、C1-10-烷基氨基、二(C1-10-烷基)氨基、芳基、芳氧基、芳硫基和杂芳基，或R0是芳基；其中任何芳基和杂芳基可任选被取代基取代一次或多次，取代基选自C1-10-烷基、C2-10-烯基、C2-10-炔基、C1-10-烷氧基、C1-10-烷硫基、羟基、卤素、氨基、硝基、氰基、C1-10-烷基氨基和二(C1-10-烷基)氨基；R1是如R0所定义的；R2是如R0所定义的，或R2是合适的离去基团；或R0和R1一起形成3-5个碳原子的链；其前提是，当X是S时W和U不是S；形成R-或S-形式的式(II)原料与下式的酰化二醇的相反对映体的混合物 其中R、W、Hal、R3、虚线和Z是如上定义的；或b)使下式的外消旋化合物 其中R、Z、W、Hal、虚线和R3是如上定义的；进行选择性酶脱酰化过程以形成R-或S-形式的下式脱酰化化合物
其中R、Hal、虚线和Z是如上定义的，和相反对映体形式的式(IV)酰化原料的混合物；随后任选，以任何顺序，分离式(II)化合物的S-或R-对映体和/或式(IV)化合物的相反对映体或其盐。
本发明还涉及由式(II)的相反对映体分离式(IV)对映体混合物的方法和上述式(IV)化合物的R-或S-对映体。
最后，本发明涉及由通过本发明的选择性酶酰化或脱酰化过程得到的式(II)化合物的对映体或通过本发明的选择性酶酰化或脱酰化过程得到的式(IV)的旋光酰基衍生物的对映体制备S西酞普兰和外消旋西酞普兰的方法。
具体实施例方式
在用于式(II)、(IV)和(V)化合物时，术语“对映体”、“R-对映体”、“S-对映体”、“R-型”、“S-型”、“R-二醇”和“ S-二醇”是指基团围绕与4-卤代苯基连接的碳原子的方向。
因此，在一个实施方案中本发明涉及上述选择性酶酰化过程，在另一实施方案中，涉及上述选择性酶脱酰化过程。
选择性酶酰化过程是指酶酰化优先对式(II)化合物的对映体之一的转化是有效的，在反应混合物中优先留下未转化的式(II)化合物的其它对映体。
选择性酶脱酰化过程是指酶脱酰化过程优先对式(IV)化合物的对映体之一的转化是有效的，在反应混合物中优先留下未转化的式(IV)化合物的其它对映体。
因此，本发明的选择性酰化过程得到优先含有S形式的式(II)化合物和R形式的式(IV)化合物的混合物，或它可得到优先含有R形式的式(II)化合物和S形式的式(IV)化合物的混合物。
同样，选择性酶脱酰化过程得到优先含有S形式的式(IV)化合物和R形式的式(II)化合物的混合物，或它可得到优先含有R形式的式(IV)化合物和S形式的式(II)化合物的混合物。
根据本发明的酰化或脱酰化过程后得到的组分混合物取决于所使用的特定水解酶和反应进行的条件。本发明的酶酰化/脱酰化过程的特征是与另一种相比，相当大比例的一种对映体被转化。通过本发明的旋光拆分得到的式(II)的二醇和/或酰化的式(IV)化合物的旋光纯度通常为至少90％ee，优先至少95％ee，更优选至少97％ee，最优选至少98％ee，然而，较低的旋光纯度值也是可接受的。
用于本发明的酶方法的原料是式(II)的外消旋二醇或式(IV)的外消旋酰基衍生物。
在本发明的优选实施方案中，R是卤素或氰基，最优选氰基。
在本发明另一优选实施方案中，Hal是氟。
在本发明的另一实施方案中，在式(II)和(IV)中虚线是单键。
在一个实施方案中，Z是二甲基氨基甲基或可转化为二甲基氨基甲基的基团，在合适的实施方案中，Z是二甲基氨基甲基。
最优选Hal是氟，R是氰基，虚线是单键和Z是二甲基氨基甲基。
用于本发明的酶酰化过程的酰化试剂可合适的是式(IIIa)、(IIIb)和(IIIc)化合物之一。
在另一实施方案中，用于本发明的酰化试剂是式(IIIa)和(IIIb)的任何一种。
在本发明的进一步实施方案中，所使用的酰化试剂是式(IIIa)化合物。
根据本发明的另一实施方案，所使用的酰化试剂是式(IIIb)化合物。
根据本发明的另一实施方案，酰化试剂是式(IIIc)化合物。
当酰化试剂是式化合物(IIIa)时，U合适地是O。
当酰化试剂是上述任何一种时，W合适地是O。
当酰化试剂是上述任何一种时，X合适地是O。
合适的是，在上述任一实施方案中定义的任何酰化试剂(IIIa)、(IIIb)和(IIIc)中，取代基R0、R1和R2是如下R0、R1和R2分别选自C1-6-烷基、C2-6-烯基和C2-6-炔基，它们均可任选被取代基取代一次或多次，取代基选自C1-6-烷氧基、C1-6-烷硫基、羟基、卤素、氨基、硝基、氰基、C1-6-烷基氨基和二(C1-6-烷基)氨基或R2是合适的离去基团，例如琥珀酰亚氨基、HOBt和pfp，或R0和R1一起形成3-5个碳原子的链；更合适R0、R1和R2分别选自C1-4-烷基、C2-4-烯基和C2-4-炔基，它们均可任选被取代基取代一次或多次，取代基选自C1-4-烷氧基、C1-4-烷硫基、羟基、卤素、氨基、硝基、氰基、C1-4-烷基氨基和二(C1-4-烷基)氨基或R2是合适的离去基团，例如琥珀酰亚氨基、HOBt和pfp，或R0和R1一起形成3-5个碳原子的链；更优选R0、R1和R2分别选自C1-3-烷基、C2-3-烯基和C2-3-炔基，它们均可任选被取代基取代一次或多次，取代基选自C1-3-烷氧基、C1-3-烷硫基、羟基、卤素、氨基、硝基、氰基、C1-3-烷基氨基和二(C1-3-烷基)氨基，更优选R0和R1是C1-3-烷基，尤其是是非支链C1-3-烷基和R2是被卤素取代一次或多次的C1-3-烷基或R2是C2-3-烯基。
合适的是，在上述任一实施方案中定义的式(IIIa)酰化试剂中，取代基R0和R1是如下R0和R1分别选自C1-6烷基、C2-6-烯基和C2-6-炔基，它们均可任选被取代基取代一次或多次，取代基选自C1-6-烷氧基、C1-6-烷硫基、羟基、卤素、氨基、硝基、氰基、C1-6-烷基氨基和二(C1-6-烷基)氨基；更合适R0和R1分别选自C1-4-烷基、C2-4-烯基和C2-4-炔基，它们均可任选被取代基取代一次或多次，取代基选自C1-4-烷氧基、C1-4-烷硫基、羟基、卤素、氨基、硝基、氰基、C1-4-烷基氨基和二(C1-4-烷基)氨基；优选R0和R1分别选自C1-3-烷基、C2-3-烯基和C2-3-炔基，它们均可任选被取代基取代一次或多次，取代基选自C1-3-烷氧基、C1-3-烷硫基、羟基、卤素、氨基、硝基、氰基、C1-3-烷基氨基和二(C1-3-烷基)氨基，更优选R0和R1分别是C1-4-烷基，最优选R0和R1是C1-3-烷基，尤其是非支链C1-3-烷基，合适的是丙基。
合适的是，在上述任一实施方案中定义的式(IIIb)酰化试剂中，取代基R1和R2是如下R1和R2分别选自C1-6-烷基、C2-6-烯基和C2-6-炔基，它们均可任选被取代基取代一次或多次，取代基选自C1-6-烷氧基、C1-6-烷硫基、羟基、卤素、氨基、硝基、氰基、C1-6-烷基氨基和二(C1-6-烷基)氨基或R2是另一个离去基团，例如琥珀酰亚氨基、HOBt和pfp；更合适R1和R2分别选自C1-4-烷基、C2-4-烯基和C2-4-炔基，它们均可任选被取代基取代一次或多次，取代基选自C1-4-烷氧基、C1-4-烷硫基、羟基、卤素、氨基、硝基、氰基、C1-4-烷基氨基和二(C1-4-烷基)氨基或R2是另一个离去基团，例如琥珀酰亚氨基、HOBt和pfp；优选R1选自C1-3-烷基、C2-3-烯基和C2-3-炔基，它们均可任选被取代基取代一次或多次，取代基选自C1-3-烷氧基、C1-3-烷硫基、羟基、卤素、氨基、硝基、氰基、C1-3-烷基氨基和二(C1-3-烷基)氨基和R2是被卤素取代一次或多次的C1-4-烷基，R2是C2-4-烯基或R2是另一个离去基团，例如琥珀酰亚氨基、HOBt和pfp；更优选R1是C1-3-烷基、C2-3-烯基或C2-3-炔基，它们均可任选被取代基取代一次或多次，取代基选自C1-3-烷氧基、C1-3-烷硫基、羟基、卤素、氨基、硝基、氰基、C1-3-烷基氨基和二(C1-3-烷基)氨基和R2是被卤素取代一次或多次的C1-3-烷基或R2是C2-3-烯基，更优选R1是C1-3-烷基和R2是被卤素取代一次或多次的C1-3-烷基或R2是C2-3-烯基，更合适的是，R1是C1-3-烷基，尤其是是非支链C1-3-烷基，例如甲基、乙基或丙基，和R2是C2-3-烯基。
表示被卤素取代一次或多次的C1-3-烷基的R2是合适的离去基团，包括基团，例如2，2，2-三氯乙基和2，2，2-三氟乙基，尤其是2，2，2-三氟乙基。
在本发明的特定实施方案中，上述式(IIIb)的酰化试剂是其中R2是乙烯基的化合物。
根据本发明的另一特定实施方案，式(IIIb)的酰化试剂是上述其中R1是丙基的化合物。特定实施方案包括本发明的优选酰化试剂，即乙烯基丁酸酯。
根据本发明的另一实施方案，酰化试剂是式(IIIc)化合物。
合适的是，在上述任一实施方案中定义的式(IIIc)化合物中，取代基R1是如下R1是C1-6-烷基、C2-6-烯基和C2-6-炔基，它们均可任选被取代基取代一次或多次，取代基选自C1-6-烷氧基、C1-6-烷硫基、羟基、卤素、氨基、硝基、氰基、C1-4-烷基氨基和二(C1-6-烷基)氨基；更合适R1是C1-4-烷基、C2-4-烯基和C2-4-炔基，它们均可任选被取代基取代一次或多次，取代基选自C1-4-烷氧基、C1-4-烷硫基、羟基、卤素、氨基、硝基、氰基、C1-4-烷基氨基和二(C1-4-烷基)氨基；优选R1是C1-3-烷基、C2-3-烯基和C2-3-炔基，它们均可任选被取代基取代一次或多次，取代基选自C1-3-烷氧基、C1-3-烷硫基、羟基、卤素、氨基、硝基、氰基、C1-3-烷基氨基和二(C1-3-烷基)氨基；更优选R1是C1-3-烷基、C2-3-烯基或C2-3-炔基，更合适的是，R1是C1-3-烷基，尤其是是非支链C1-3-烷基，例如甲基、乙基或丙基。
V合适地是氯。
用于本发明的酰化试剂还可以是式R1-N＝C＝O的异氰酸酯或式R1-N＝C＝S的硫代异氰酸酯。
因此，在本发明的进一步实施方案中，酰化试剂是式R1-N＝C＝O的异氰酸酯。
根据本发明的另一实施方案，酰化试剂是式R1-N＝C＝S的硫代异氰酸酯。
合适的是，在上述任一实施方案中定义的异氰酸酯和硫代异氰酸酯中，取代基R1是如下R1是C1-6-烷基、C2-6-烯基或C2-6-炔基，它们均可任选被取代基取代一次或多次，取代基选自C1-6-烷氧基、C1-6-烷硫基、羟基、卤素、氨基、硝基、氰基、C1-4-烷基氨基和二(C1-6-烷基)氨基；更合适R1是C1-4-烷基、C2-4-烯基或C2-4-炔基，它们均可任选被取代基取代一次或多次，取代基选自C1-4-烷氧基、C1-4-烷硫基、羟基、卤素、氨基、硝基、氰基、C1-4-烷基氨基和二(C1-4-烷基)氨基；优选R1是C1-3-烷基、C2-3-烯基或C2-3-炔基，它们均可任选被取代基取代一次或多次，取代基选自C1-3-烷氧基、C1-3-烷硫基、羟基、卤素、氨基、硝基、氰基、C1-3-烷基氨基和二(C1-3-烷基)氨基；更优选R1是C1-3-烷基、C2-3-烯基或C2-3-炔基，更合适的是，R1是C1-3-烷基，尤其是非支链C1-3-烷基，例如甲基、乙基或丙基。
本发明还包括如上定义的式(IV)外消旋化合物的选择性酶脱酰化方法。
合适的是，所使用的式(IV)外消旋化合物是其中Y是O或S的化合物。
根据进一步的实施方案，所使用的式(IV)外消旋化合物是其中Y是O的化合物。
在本发明的另一实施方案中，所使用的式(IV)外消旋化合物是其中Y是S的化合物。
在本发明的另一实施方案中，所使用的式(IV)外消旋化合物是其中Y是键的化合物。
合适的是，在上述任一实施方案中定义的外消旋化合物(IV)中，取代基R1是如下R1是C1-10-烷基、C2-10-烯基或C2-10-炔基，它们均可任选被取代基取代一次或多次，取代基选自C1-10-烷氧基、C1-10-烷硫基、羟基、卤素、氨基、硝基、氰基、C1-10-烷基氨基和二(C1-10-烷基)氨基；更合适R1是C1-10-烷基、C2-10-烯基或C2-10-炔基，它们均可任选被取代基取代一次或多次，取代基选自羟基、卤素、氨基、硝基、氰基；优选R1是C1-10-烷基，优选非支链C1-10-烷基，更优选R1是非支链C4-10-烷基。
根据本发明，选择性酶酰化过程在基本上抑制水解的条件下进行，水解是酰化反应的逆向反应，如果在反应体系中存在水，则发生水解。
因此，选择性酶酰化过程优选在无水有机溶剂或几乎无水的有机溶剂(酶通常需要存在部分水以活化)中进行。如下实施例说明如何加入影响转化的水。在特定反应体系中允许的水的百分数可由本领域的技术人员确定。
可用于酰化反应的有机溶剂不是显著重要的，只要它们不失活所使用的酶即可。合适的溶剂包括烃，例如己烷、庚烷、苯和甲苯；醚，例如乙醚、异丙基醚、四氢呋喃、1，4-二烷、叔丁基甲基醚和二甲氧基乙烷；酮，例如丙酮、二乙酮、丁酮和甲基乙基酮；酯，例如乙酸甲酯、乙酸乙酯、丁酸乙酯、丁酸乙烯基酯和苯甲酸乙酯；卤代烃，例如二氯甲烷、氯仿和1，1，1-三氯乙烷；仲和叔醇，例如叔丁醇；含氮溶剂，例如二甲基甲酰胺、乙酰胺、甲酰胺、乙腈和丙腈；和极性非质子传递溶剂，例如二甲基亚砜、N-甲基吡咯烷酮和六甲基磷三酰胺。
其中，烃，例如己烷、庚烷、苯和甲苯；醚，例如乙醚、异丙基醚、四氢呋喃、1，4-二烷和叔丁基甲基醚和酯，例如丁酸乙烯基酯是优选的。对于一种酶，最优选的溶剂可以是芳香烃，例如苯或甲苯和醚，最优选甲苯，对于另一种酶，最优选的溶剂可以是醚，例如1，4-二烷(参见如下实施例)。上述溶剂可单独地或两种或多种溶剂结合使用。
式(II)的外消旋二醇和酰化试剂的浓度不应太高，在溶剂中高浓度的会导致外消旋二醇的非选择性酰化。外消旋二醇和酰化试剂的合适浓度是分别低于1.0M，更合适的是低于0.5M，更加合适的是低于0.2M或更合适的是低于0.1M。本领域技术人员将能够确定外消旋二醇和酰化试剂的最佳浓度。
选择性酶脱酰化过程优选在水或水和有机溶剂的混合物中，合适地在缓冲剂存在下进行。可用于该反应的有机溶剂不是特别重要，只要这不失活所使用的酶即可。合适的有机溶剂是与水混溶的溶剂，例如醇、乙腈、DMF、DMSO、二烷、DME和二甘醇二甲醚。技术人员能够确定其它合适的溶剂，本领域技术人员能够确定用于反应的式(IV)外消旋化合物的最佳浓度。
所使用的酶的立体选择性可通过在有机酸和/或有机碱存在下进行酰化或脱酰化过程增加。
因此，本发明还涉及一种方法，其中酶酰化或酶脱酰化过程在有机碱或有机酸或它们的混合物存在下进行。
在特定实施方案中，本发明涉及一种方法，其中酶酰化或酶脱酰化过程在有机酸，合适地在有机羧酸存在下进行。
在进一步实施方案中，酶酰化过程在有机酸，合适的在有机羧酸存在下进行。
合适的上述有机酸是芳香羧酸或脂族羧酸。
作为可用于反应的有机酸，可提及烷基羧酸、环烷基羧酸、环烷基烷基羧酸、任选取代的苯基烷基羧酸和任选取代的苯基羧酸。合适的脂族羧酸是羧酸，例如甲酸、乙酸、丙酸、正丁酸、异丁酸、2-乙基丁酸、正戊酸、异戊酸、新戊酸、正己酸、异己酸、癸酸、丁烯酸、棕榈酸、环戊烷羧酸、环己烷羧酸、苯基-C1-4-烷基羧酸，例如3-苯基丙酸、4-苯基丁酸、草酸、丙二酸和酒石酸。合适的芳香羧酸包括酸，例如苯甲酸、对氯苯甲酸、对硝基苯甲酸、对甲氧基苯甲酸、对甲苯甲酸、邻甲苯甲酸、间甲苯甲酸、萘甲酸、邻苯二甲酸和对苯二甲酸、水杨酸、氢化肉桂酸。
因此，根据本发明的一项实施方案，用于改善酶的立体选择性的有机酸选自正丙酸、异丙酸、正丁酸、异丁酸、异戊酸、2-乙基丁酸、丁烯酸、棕榈酸、环己烷羧酸、新戊酸、苯甲酸和对甲苯甲酸、水杨酸和3-苯基丙酸。根据本发明的进一步实施方案，所使用的羧酸是新戊酸。
对使用的有机酸的量没有特定限制，但相对于作用物的摩尔比通常是0.1-10，优选1.0-3.0，更优选1.0-2.0。
此外，叔胺可以单独地或与任何上述有机酸结合用于改善酶的选择性。作为合适的有机碱，可提及三乙胺、吡啶、4-二甲基氨基吡啶，优选吡啶。有机酸和有机碱的合适组合是例如苯甲酸和吡啶。
对使用的叔胺的量没有特定限制，但相对于作用物的摩尔比通常是0.5-3.0，优选0.5-2.0。
本发明的酶酰化或酶脱酰化过程使用水解酶，例如脂肪酶、酯酶、酰基转移酶或蛋白酶进行。
因此，根据本发明的一项实施方案，酶酰化过程用水解酶，例如脂肪酶、酯酶、酰基转移酶或蛋白酶进行。
用于本发明的酶是能够进行式(II)外消旋化合物中伯羟基的R-选择性酰化或S-选择性酰化过程的酶。
根据本发明的另一项实施方案，酶脱酰化过程用水解酶，例如脂肪酶、酯酶、酰基转移酶或蛋白酶进行。用于本发明的酶是能够进行式(IV)外消旋化合物中酰基的R-选择性脱酰化或S-选择性脱酰化过程的酶。
一般或有关具体酶时，用于本文的“水解酶”和“酶”不仅是指酶本身，而且包括含有酶的培养产物，例如含有细胞体的培养液或培养的细胞体、和培养产物的加工产物(例如粗提取物、冻干微生物或细胞、丙酮干燥的微生物或细胞和微生物或细胞的粉碎产物等)。
此外，“酶”或“水解酶”可用已知技术固定化为酶本身或细胞体，可以固定化形式使用。固定化过程可用本领域技术人员已知的方法进行，该方法包括，例如载体键合、交联、包被作用等。
因此，在本发明的一项实施方案中，水解酶以固定化的酶或交联酶结晶(CLEC)酶的形式使用。
我们发现，本发明的酶酰化过程可使用由Candida antartica获得的Novozyme 435、由Thermomyces lanuginosus或脂蛋白脂肪酶假单胞菌(由洋葱假单胞菌属分离，由Fluka获得)获得的LipoZyme TL IM进行，在使用由Candida antartica获得的Novozyme 435或脂蛋白脂肪酶假单胞菌属时被发现获得尤其好的结果。
因此，根据本发明的一项实施方案，所使用的酶是假单胞菌属脂蛋白脂肪酶、Candida antartica脂肪酶B或Thermomyces lanuginosus脂肪酶。
根据本发明的另一项实施方案，所使用的酶是假单胞菌属脂蛋白脂肪酶或Candida antartica脂肪酶B。
如上所述，使用上述本发明的酶之一也包括使用含有该酶的培养产物，例如含有细胞体的培养液或培养的细胞体、培养产物的加工产物和这些酶/培养产物的任何固定形式。
本发明任何上述具体提到的酶的使用还包括使用上述具体提到酶的能够进行本发明的选择性酰化或脱酰化过程的突变体、变种或任何等价物。变种或等价物可由假单胞菌、假丝酵母或Thennomyces的各种菌株或任何其它来源分离，或它们可通过编码上述酶的DNA突变引起酶的氨基酸组成改变而制备。合适的上述酶突变体或变种是其中单个的氨基酸被除去或被其它氨基酸置换的变种或突变体，变种或突变体的合适氨基酸序列是超过60％与上述酶相同，优选超过80％相同或最优选超过90％相同。
因此，根据本发明的一项实施方案，所使用的酶是假单胞菌属脂蛋白脂肪酶或它们的突变体或变种，优选使用假单胞菌属脂蛋白脂肪酶。
根据本发明的另一实施方案，所使用的酶是Candida antartica脂肪酶B或它们的突变体或变种，优选使用Candida antartica脂肪酶B。
根据本发明的进一步实施方案，酶是Novozyme435(固定在丙烯酸树脂上的Candida antartica脂肪酶B，由公司Novozymes A/S获得)。
根据本发明的另一项实施方案，所使用的酶是Thermomyceslanuginosus脂肪酶或它们的突变体或变种，优选使用Thermomyceslanuginosus脂肪酶。
根据本发明的进一步实施方案，所使用的酶是LipozymeTMTLIM，同样由公司Novozymes A/S获得。
用于酶酰化/脱酰化过程的优选反应条件根据所使用的酶变化，与它是否固定化无关。
反应的合适温度在0-80℃之间，更优选在20-60℃，更优选在30-50℃。
所用的酶的量没有特定限制，作为相对于作用物的重量比，通常为0.01-1.0，优选0.02-0.5，更优选0.02-0.3。
反应可以间歇方法进行或作为连接方法进行，酶可以分多次重复或连接地使用。反应时间没有特定限制，通常取决于所使用的酶和产生方法的规模和类型(间歇或连续)。
本发明还涉及式(IV)化合物的S-或R-对映体 其中R、Hal、R3、W、虚线和Z是如上定义的，或其盐。
根据本发明的一项实施方案，上述旋光酰基衍生物是S-对映体，根据本发明的一项实施方案，上述旋光酰基衍生物是R-对映体。
根据本发明的一项实施方案，上述R-或S-对映体是其中R是卤素或氰基，优选R是氰基的化合物。
根据本发明的进一步的实施方案，上述R-或S-对映体是其中Hal是氟的化合物。
根据本发明的进一步实施方案，上述R-或S-对映体是其中虚线表示单键的化合物。
在本发明另一实施方案中，上述R-或S-对映体是其中Z是二甲基氨基甲基或可转化为二甲基氨基甲基的基团，更合适的是Z是二甲基氨基甲基，和其它取代基是如上定义的化合物。
在本发明的另一实施方案中，上述R-或S-对映体是其中Z是二甲基氨基甲基，Hal是氟，虚线表示单键和R是氰基或卤素，合适地是氰基的化合物。
在本发明的另一实施方案中，上述R-或S-对映体是其中Y是O或S，优选Y是O，其它取代基是如上定义的化合物。在本发明的另一实施方案中，上述R-或S-对映体是其中Y是S和其它取代基是如上定义的化合物。
在本发明的另一实施方案中，上述R-或S-对映体是其中Y是键和其它取代基是如上定义的化合物。
在本发明的另一实施方案中，上述R-或S-对映体是其中Y是NH和其它取代基是如上定义的化合物。
合适的是，在上述任一实施方案中定义的R-或S-对映体是化合物，其中R1是C1-6-烷基、C2-6-烯基或C2-6-炔基，它们均可任选被取代基取代一次或多次，取代基选自C1-6-烷氧基、C1-6-烷硫基、羟基、卤素、氨基、硝基、氰基、C1-4-烷基氨基和二(C1-6-烷基)氨基；更合适R1是C1-4-烷基、C2-4-烯基或C2-4-炔基，它们均可任选被取代基取代一次或多次，取代基选自C1-4-烷氧基、C1-4-烷硫基、羟基、卤素、氨基、硝基、氰基、C1-4-烷基氨基和二(C1-4-烷基)氨基；优选R1是C1-3-烷基、C2-3-烯基或C2-3-炔基，它们均可任选被取代基取代一次或多次，取代基选自C1-3-烷氧基、C1-3-烷硫基、羟基、卤素、氨基、硝基、氰基、C1-3-烷基氨基和二(C1-3-烷基)氨基；最优选R1是C1-3-烷基，尤其是非支链C1-3-烷基。
根据本发明的另一合适实施方案，在上述任一实施方案中定义的R-或S-对映体是化合物，其中R1是C1-10-烷基、C2-10-烯基或C2-10-炔基，它们均可任选被取代基取代一次或多次，取代基选自C1-10-烷氧基、C1-10-烷硫基、羟基、卤素、氨基、硝基、氰基、C1-10-烷基氨基和二(C1-10-烷基)氨基；更合适R1是C1-10-烷基、C2-10-烯基或C2-10-炔基，它们均可任选被取代基取代一次或多次，取代基选自羟基、卤素、氨基、硝基和氰基；优选R1是C1-10-烷基，优选非支链C1-10-烷基，更优选R1是非支链C4-10-烷基。
在酰化反应或脱酰化反应完成后，式(II)表示的二醇衍生物的对映体作为与式(IV)化合物的相反对映体的混合物得到，该反应混合物随后任选由酶分离。
为得到高化学纯度的所需式(II)和/或(IV)对映体，需要用有效的方法将其分别由式(IV)和(II)的相反对映体分离。然而，通过一般已知方法难以有效地分离对映体，这是因为式(IV)的酰基衍生物的结构与式(II)二醇的结构太类似。
本发明人对此作了深刻研究，结果发现当反应混合物用含有有机溶剂和水的混合溶剂在酸存在下处理时，与酸的盐形式的式(II)化合物的对映体有效地分布于水层中，与酸的盐形式的式(IV)化合物的相反对映体有效地分布于有机层中。
因此，根据另一实施方案，本发明涉及分离和纯化方法，下式的酰基衍生物，或其盐 其中R是氰基或可转化为氰基的基团，Hal是卤素，虚线表示双键或单键和Z是基团-CH2-N(R′R″)，其中R′和R″是C1-6烷基或R′和R″互相连接以形成包括与它们连接的N-原子的环结构，或Z是可转化为二甲基氨基甲基的基团，W是O或S，R3是-Y-R1，其中Y是键、O、S或NH和R1是C1-10-烷基、C2-10-烯基或C2-10-炔基，它们均可任选被取代基取代一次或多次，取代基选自C1-10-烷氧基、C1-10-烷硫基、羟基、卤素、氨基、硝基、氰基、C1-10-烷基氨基、二(C1-10-烷基)氨基、芳基、芳氧基、芳硫基和杂芳基，或R1是芳基；其中任何芳基和杂芳基可任选被取代基取代一次或多次，取代基选自C1-10-烷基、C2-10-烯基、C2-10-炔基、C1-10-烷氧基、C1-10-烷硫基、羟基、卤素、氨基、硝基、氰基、C1-10-烷基氨基和二(C1-10-烷基)氨基，和/或下式的二醇或其盐
其中R、Hal、虚线和Z是如上定义的，由含有式(IV)化合物和式(II)二醇的混合物分离，其包括a)在水和有机溶剂的混合物中在酸存在下处理含有式(IV)的酰基衍生物和式(II)的二醇的所述混合物；b)由有机相分离含有作为所述酸的盐的式(II)二醇的水相，得到含有作为所述酸的盐的式(IV)酰基衍生物的有机相；任选作为碱或其盐分离式(II)化合物和任选作为碱或其盐的式(IV)化合物。
根据本发明的一项实施方案中，在上述分离和纯化方法中，R是卤素或氰基，优选氰基。
根据本发明的另一实施方案，在上述分离和纯化方法中，Hal是氟。
根据优选实施方案，虚线表示单键。
在本发明的另一实施方案中，Z是二甲基氨基甲基或可转化为二甲基氨基甲基的基团，合适的Z是二甲基氨基甲基。
根据本发明的优选实施方案，Hal是氟，Z是二甲基氨基甲基，虚线是单键，R是氰基或卤素，优选氰基。
在本发明的另一实施方案中，在上述分离和纯化方法中，式(IV)化合物是其中Y是O或S，优选Y是O，其它取代基是如上定义的化合物。在本发明的另一实施方案中，在上述分离和纯化方法中，式(IV)化合物是其中Y是S的化合物。
在本发明的另一实施方案中，在上述分离和纯化方法中，式(IV)化合物是其中Y是键，其它取代基是如上定义的化合物。
在本发明的另一实施方案中，在上述分离和纯化方法中，式(IV)化合物是其中Y是NH，其它取代基是如上定义的化合物。
在本发明的优选实施方案中，在上述分离和纯化方法中，式(IV)化合物是如下化合物其中R1是C1-6-烷基、C2-6-烯基或C2-6-炔基，它们均可任选被取代基取代一次或多次，取代基选自C1-6-烷氧基、C1-6-烷硫基、羟基、卤素、氨基、硝基、氰基、C1-4-烷基氨基和二(C1-6-烷基)氨基；更优选R1是C1-4-烷基、C2-4-烯基或C2-4-炔基，它们均可任选被取代基取代一次或多次，取代基选自C1-4-烷氧基、C1-4-烷硫基、羟基、卤素、氨基、硝基、氰基、C1-4-烷基氨基和二(C1-4-烷基)氨基；优选R1是C1-3-烷基、C2-3-烯基和C2-3-炔基，它们均可任选被取代基取代一次或多次，取代基选自C1-3-烷氧基、C1-3-烷硫基、羟基、卤素、氨基、硝基、氰基、C1-3-烷基氨基和二(C1-3-烷基)氨基；最优选R1是C1-3-烷基，尤其是非支链C1-3-烷基。
在本发明的另一优选实施方案中，在上述分离和纯化方法中，式(IV)化合物是如下化合物其中R1是C1-10-烷基、C2-10-烯基或C2-10-炔基，它们均可任选被取代基取代一次或多次，取代基选自C1-10-烷氧基、C1-10-烷硫基、羟基、卤素、氨基、硝基、氰基、C1-10-烷基氨基和二(C1-10-烷基)氨基；更优选R1是C1-10-烷基、C2-10-烯基或C2-10-炔基，它们均可任选被取代基取代一次或多次，取代基选自羟基、卤素、氨基、硝基和氰基；优选R1是C1-10-烷基，优选非支链C1-10-烷基，更优选R1是非支链C4-10-烷基。
通过上述分离和纯化方法，通过在酸存在下，用有机溶剂和水处理含有式(II)对映体和式(IV)相反对映体、反应溶剂等的混合物，和在酸的存在下，式(II)化合物的R-或S-对映体与酸的盐可选择性地提取入水层中，式(IV)化合物的相反对映体与酸的盐可选择性地分离入有机层中。在此情况下，式(IV)对映体的盐和式(II)对映体的盐可以所需对映体的较少损失分离。
根据上述分离和纯化方法的一项实施方案，式(IV)化合物的S-对映体与式(II)化合物的R-对映体分离。
根据上述分离和纯化方法的一项实施方案，式(II)化合物的S-对映体与式(IV)化合物的R-对映体分离。
作为式(II)和水的比例，所使用的水量是1∶2-1∶100，优选1∶5-1∶50。此外，在用水提取前，可蒸发反应溶剂以减少其数量或可用另一种有机溶剂替换。
在上述分离和纯化过程中可使用的酸没有特定限制，但例如可提及，无机酸，例如盐酸、硫酸和磷酸；有机酸，尤其是由脂族羧酸代表的羧酸，例如甲酸、乙酸、丙酸、正丁酸、异丁酸、2-乙基丁酸、正戊酸、异戊酸、新戊酸、正己酸、异己酸、环戊烷羧酸、环己烷羧酸、草酸、丙二酸和酒石酸；或芳香羧酸，例如苯甲酸、对氯苯甲酸、对硝基苯甲酸、对甲氧基苯甲酸、对甲苯甲酸、邻甲苯甲酸、间甲苯甲酸、萘甲酸、邻苯二甲酸和对苯二甲酸。其中优选有机酸，尤其是羧酸，例如正丁酸、异戊酸、环己烷羧酸、新戊酸、苯甲酸和对甲苯甲酸，尤其优选新戊酸。显然，上述酸可单独地或两种或多种结合使用。所使用的酸的数量没有特别限制，但式(IV)和(II)化合物的总量和酸的摩尔比通常为1∶1-1∶5，优选1∶1-1∶3。
在本发明分离和纯化步骤中使用的酸可以与用于本发明酰化或脱酰化反应的有机酸相同，或可以是不同的酸。
作为可以用于分离和纯化步骤的有机溶剂，可提及例如烃，例如己烷、庚烷、苯和甲苯；醚，例如乙醚、四氢呋喃、1，4-二烷、叔丁基甲基醚和二甲氧基乙烷；酮，例如丙酮、二乙酮和甲基乙基酮；酯，例如乙酸甲酯、乙酸乙酯、丁酸乙酯和苯甲酸乙酯；卤代烃，例如二氯甲烷、氯仿和1，1，1-三氯乙烷。其中，脂族烃，例如己烷和庚烷和芳香烃，例如苯和甲苯是优选的，更优选芳香烃，最优选甲苯。上述溶剂可单独地或两种或多种溶剂结合地使用。
分离和纯化步骤的温度优选在0-80℃，更优选10-40℃，最优选20-30℃。
随后，根据上述分离和纯化方法，分离式(II)和(IV)化合物的盐，部分混合于式(II)化合物与酸的盐的水层中的少量式(IV)化合物等可通过用有机溶剂洗涤水层有效地除去。
式(II)二醇的盐可作为盐的水溶液使用，如果需要，它可作为通过浓缩、溶剂替换或类似操作得到的在另一种溶剂中的溶液或浓缩液使用。此外，它可作为通过结晶或类似操作得到的结晶使用。然而，通常式(II)二醇作为通过如下操作得到的游离二醇形式使用通过用普通的碱，例如氢氧化钠或氢氧化钾处理水层以控制水层的pH至至少9，优选至少11，随后用有机溶剂撮式(II)二醇的游离胺形式，随后洗涤和浓缩提取物得到含有式(II)二醇和有机溶剂和/或其浓缩液的混合物。通过一系列分离和纯化方法得到的式(II)二醇的化学纯度通常为至少95％，优选至少97％，更优选至少99％，最优选至少99.5％。
另一方面，通过上述操作得到的式(IV)化合物可用水相洗涤以改善产物化学纯度。通过用碱处理通过上述操作得到的式(IV)化合物的铵盐可得到式(IV)化合物的游离胺。通过一系列分离和纯化方法得到的式(IV)二醇的化学纯度通常为至少95％，优选至少97％，更优选至少99％，最优选至少99.5％。
在如上式(II)和(IV)对映体分离后得到的产物的旋光纯度可通过进一步加工改善。旋光纯度的改善可通过如在WO 03/011278所述的色谱法或在US 4,943,590中所述的用旋光酸结晶非对映体酯或盐获得。
根据本发明的另一实施方案，通过上述分离和纯化方法分离的式(II)化合物和式(IV)化合物的混合物是经过本发明的选择性酰化过程和在另一实施方案中的选择性脱酰化过程制备的。
本发明还涉及由其它对映体的式(IV)酰基衍生物分离式(II)的R-或S-二醇的另一种新方法，从而可分离和纯化所需的化合物。
根据该分离和纯化酰基衍生物的其它方法，下式的酰基衍生物或其盐 其中R是氰基或可转化为氰基的基团，Hal是卤素，虚线表示双键或单键和Z是基团-CH2-N(R′R″)，其中R′和R″是C1-6烷基或R′和R″互相连接以形成包括与它们连接的N-原子的环结构，或Z是可转化为二甲基氨基甲基的基团，W是O或S，R3是-Y-R1，其中Y是键、O、S或NH和R1是C1-10-烷基、C2-10-烯基或C2-10-炔基，它们均可任选被取代基取代一次或多次，取代基选自C1-10-烷氧基、C1-10-烷硫基、羟基、卤素、氨基、硝基、氰基、C1-10-烷基氨基、二(C1-10-烷基)氨基、芳基、芳氧基、芳硫基和杂芳基，或R1是芳基，其中任何芳基和杂芳基可任选被取代基取代一次或多次，取代基选自C1-10-烷基、C2-10-烯基、C2-10-炔基、C1-10-烷氧基、C1-10-烷硫基、羟基、卤素、氨基、硝基、氰基、C1-10-烷基氨基和二(C1-10-烷基)氨基，和/或下式的二醇或其盐 其中R、Hal、虚线和Z是如上定义的，由含有式(IV)化合物和式(II)化合物混合物分离，方法包括a)在水、质子传递有机溶剂和非极性有机溶剂的混合物中处理含有式(IV)化合物和式(II)二醇的所述混合物；b)由有机相分离含有式(II)二醇的水相，得到含有式(IV)化合物的有机相；任选作为碱分离式(II)和/或(IV)二醇和任选转化式(II)和/或(IV)化合物成其盐。
任何上述分离的相(水和有机相)可附加地分别用有机或含水溶剂洗涤一次或多次以改善产物的化学纯度。
根据上述分离和纯化方法的一项实施方案，式(II)化合物的S-二醇与式(IV)化合物的R-对映体分离。
根据上述分离和纯化方法的一项实施方案，式(IV)化合物的S-对映体与式(II)化合物的R-对映体分离。
根据本发明的一项实施方案中，在上述分离和纯化方法中，R是卤素或氰基，优选氰基。
根据本发明的另一实施方案，在上述分离和纯化方法中，Hal是氟。
根据优选实施方案，虚线表示单键。
在本发明的另一实施方案中，Z是二甲基氨基甲基或可转化为二甲基氨基甲基的基团，合适的Z是二甲基氨基甲基。
根据本发明的优选实施方案，Hal是氟，Z是二甲基氨基甲基，虚线是单键，R是氰基或卤素，优选氰基。
在本发明的另一实施方案中，在上述分离和纯化方法中，式(IV)化合物是其中Y是O或S，优选Y是O，其它取代基是如上定义的化合物。在本发明的另一实施方案中，在上述分离和纯化方法中，式(IV)化合物是其中Y是S的化合物。
在本发明的另一实施方案中，在上述分离和纯化方法中，式(IV)化合物是其中Y是键，其它取代基是如上定义的化合物。
在本发明的另一实施方案中，在上述分离和纯化方法中，式(IV)化合物是其中Y是NH，其它取代基是如上定义的化合物。
在本发明的优选实施方案中，在上述分离和纯化方法中，式(IV)化合物是如下化合物其中R1是C1-6-烷基、C2-6-烯基或C2-6-炔基，它们均可任选被取代基取代一次或多次，取代基选自C1-6-烷氧基、C1-6-烷硫基、羟基、卤素、氨基、硝基、氰基、C1-4-烷基氨基和二(C1-6-烷基)氨基；更优选R1是C1-4-烷基、C2-4-烯基或C2-4-炔基，它们均可任选被取代基取代一次或多次，取代基选自C1-4-烷氧基、C1-4-烷硫基、羟基、卤素、氨基、硝基、氰基、C1-4-烷基氨基和二(C1-4-烷基)氨基；优选R1是C1-3-烷基、C2-3-烯基和C2-3-炔基，它们均可任选被取代基取代一次或多次，取代基选自C1-3-烷氧基、C1-3-烷硫基、羟基、卤素、氨基、硝基、氰基、C1-3-烷基氨基和二(C1-3-烷基)氨基；最优选R1是C1-3-烷基，尤其是非支链C1-3-烷基。
在本发明的另一优选实施方案中，在上述分离和纯化方法中，式(IV)化合物是如下化合物其中R1是C1-10-烷基、C2-10-烯基或C2-10-炔基，它们均可任选被取代基取代一次或多次，取代基选自C1-10-烷氧基、C1-10-烷硫基、羟基、卤素、氨基、硝基、氰基、C1-6-烷基氨基和二(C1-10-烷基)氨基；更合适的R1是C1-10-烷基、C2-10-烯基或C2-10-炔基，它们均可任选被取代基取代一次或多次，取代基选自羟基、卤素、氨基、硝基和氰基；优选R1是C1-10-烷基，优选非支链C1-10-烷基，更优选R1是非支链C4-10-烷基。
作为可用于分离和纯化步骤的质子传递有机溶剂，可提及，例如醇，例如甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、2-丁醇和叔丁醇。上述溶剂可单独地或两种或多种溶剂结合使用。
作为可用于分离和纯化步骤的非极性有机溶剂，可提及例如烃，例如己烷、庚烷、苯和甲苯；醚，例如乙醚、叔丁基甲基醚和二甲氧基乙烷；卤代烃，例如二氯甲烷、氯仿和1，1，1-三氯乙烷。其中，优选烃，例如己烷、庚烷、苯和甲苯，更优选庚烷。上述溶剂可单独地或两种或多种溶剂结合地使用。
根据本发明的具体实施方案，用于上述分离和纯化方法的式(IV)化合物和式(II)二醇的混合物是经过本发明的选择性酶酰化过程和在另一实施方案中通过选择性酶脱酰化过程制备的。
在如上式(II)和(IV)对映体分离后得到的产物的旋光纯度可通过进一步加工改善。旋光纯度的改善可通过如在WO 03/006449所述的色谱法或在US 4,943,590中所述的用旋光酸结晶非对映体酯或盐获得。
本发明还涉及制备下式的S西酞普兰或其可药用的盐的方法 其包括在一项实施方案中，通过如上述任一实施方案中定义的本发明的选择性酶酰化方法和在另一实施方案中，通过如上述任一实施方案中定义的本发明的选择性酶脱酰化方法制备下式的二醇的S-对映体或其盐
其中R是氰基或可转化为氰基的基团，虚线表示双键或单键，Z是二甲基氨基甲基或可转化为二甲基氨基甲基的基团和Hal是卤素，或下式的酰化二醇的S-对映体或其盐 其中R、Z、虚线和Hal是如上定义的，W是O或S，R3是-Y-R1，其中R1是C1-10-烷基、C2-10-烯基或C2-10-炔基，它们均可任选被取代基取代一次或多次，取代基选自C1-10-烷氧基、C1-10-烷硫基、羟基、卤素、氨基、硝基、氰基、C1-10-烷基氨基、二(C1-10-烷基)氨基、芳基、芳氧基、芳硫基和杂芳基，或R1是芳基，其中任何芳基和杂芳基可任选被取代基取代一次或多次，取代基选自C1-10-烷基、C2-10-烯基、C2-10-炔基、C1-10-烷氧基、C1-10-烷硫基、羟基、卤素、氨基、硝基、氰基、C1-10-烷基氨基和二(C1-10-烷基)氨基，和Y是键、O、S或NH，随后任选，以任何顺序，将基团R转化为氰基，还原虚线表示的双键，转化基团Z为二甲基氨基甲基和/或转化基团Hal为氟和在碱性条件下式(IIs)或(IVs)的S-对映体或其不稳定酯衍生物的环闭合以形成下式的化合物 随后，以任何顺序，如果R不是氰基，将基团R转化为氰基，如果虚线表示双键，还原成单键，如果Z不是二甲基氨基甲基，转化基团Z为二甲基氨基甲基和如果Hal不是氟，转化Hal为氟，随后分离S西酞普兰或其可药用的盐。
根据本发明的一项实施方案，上述式(IIs)的S-对映体或用于制备S西酞普兰的式(IVs)的S-对映体在环闭合前分别由式(IV)和(II)的R-对映体分离。
根据上述制备S西酞普兰的方法的一项实施方案，通过酶酰化过程得到的式(II)化合物的R-或S-对映体和式(IV)化合物的相反对映体的混合物，根据上述新的分离和纯化方法之一，通过分离和纯化过程彼此分离。根据另一实施方案，混合物通过其它的上述新的分离和纯化方法分离。
根据上述制备S西酞普兰的方法的另一项实施方案，通过酶脱酰化过程得到的式(II)化合物的R-或S-对映体和式(IV)化合物的相反对映体的混合物，根据上述新的分离和纯化方法之一，通过分离和纯化过程彼此分离。根据另一实施方案，混合物通过其它的上述新的分离和纯化方法分离。
根据本发明的另一实施方案，上述式(IIs)的S-对映体或用于制备S西酞普兰的式(IVs)S-对映体在环闭合前不分别由式(IV)和(II)的R-对映体分离。
如上所述，基团R是指氰基或任何可转化为氰基的其它基团。
可转化为氰基的基团包括卤素，例如氯、溴、碘或氟，优选氯或溴。
可转化为氰基的其它基团包括CF3-(CF2)n-SO2-O-，其中n是0-8、-OH、-CHO、-CH2OH、-CH2NH2、-CH2NO2、-CH2Cl、-CH2Br、-CH3、-NHR5、-CHNOH、-COOR6、-CONR6R7，其中R5是氟或C1-6烷基羰基，R6和R7选自氢、任选取代的C1-6烷基、芳基-C1-6烷基或芳基和下式的基团 其中Z是O或S；R8-R9分别选自氢和C1-6烷基或R8和R9一起形成C2-5亚烷基链从而形成螺环；R10选自氢和C1-6烷基；R11选自氢、C1-6烷基、羧基或其前体，或R10和R11一起形成C2-5亚烷基链从而形成螺环。
当R是卤素，尤其是溴或氯时，向氰基的转化过程可如US4,136,193、WO 00/13648、WO 00/11926和WO 01/02383中所述进行。
根据US 4,136,193，溴基团向氰基的转化通过与CuCN反应进行。
WO 00/13648和WO 00/11926描述了通过用氰化物源在Pd或Ni催化剂氰化将卤素或三氟磺酸酯基团转化为氰基。
用于将溴化合物转化为相应氰基衍生物的其它方法包括使溴化合物与镁反应以形成格利雅试剂，随后与甲酰胺反应形成醛。将醛转化为肟或腙，它们分别通过脱水和氧化转化为氰基。
或者，溴化合物与镁反应形成格利雅试剂，随后与含有键合于离去基团的CN基团的化合物反应。
上述两种方法的详细描述在WO 01/02383找到。
其中基团R是-CHO的化合物可通过类似于WO 99/00210中描述的方法转化为其中R是氰基的相应化合物。
其中基团R是NHR12，其中R12是氢或烷基羰基的化合物可通过类似于WO 98/19512中描述的方法转化为其中基团R是氰基的相应化合物。
其中R是-COOR6基团的化合物可通过经相应的酰氯或其酯转化为酰胺，随后酰胺脱水转化为其中R是氰基的相应化合物。WO01/68632。
或者，其中R是-COOH的化合物可，如WO 00/44738所述，与氯磺酰基异氰酸酯反应形成腈或用脱水剂和磺酰胺处理。
其中基团R是-CONR13R14，其中R13和R14选自氢和任选取代的烷基、芳烷基或芳基的化合物可通过类似于WO 98/00081和WO98/19511中描述的方法转化为相应氰基化合物。
其中基团R是式(VII)的化合物可通过类似于WO 00/23431中描述的方法转化为相应的氰基化合物。
其中R是-OH、-CH2OH、-CH2NH2、-CH2NO2、-CH2Cl、-CH2Br、-CH3或任何上述基团的化合物可通过类似于WO 01/68632中描述的方法转化为相应的氰基化合物。
式(II)的外消旋化合物可通过在上述专利中描述的方法或通过在US 4.136.193中描述的烷基化方法或在EP 171 943中描述的双键格利雅反应或通过类似方法制备。式(IV)的外消旋化合物可由式(II)的外消旋化合物通过使用如上式(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)、R1-N＝C＝O和R1-N＝C＝S定义的酐、酯、碳酸酯、异氰酸酯或硫代异氰酸酯的非选择性酰化过程制备。
在某些情况下，式(II)的外消旋化合物可以酸加成盐，例如硫酸盐形式获得，在此情况下，式(II)化合物的游离碱可通过用碱在水或水和有机溶剂的混合物中处理盐将式(II)化合物转移到有机相得到。
在式(II)、(IIs)、(IIr)、(IV)、(IVs)、(IVr)和(V)化合物中，R优选是氰基，如果R不是氰基，环闭合后合适地将基团R转化为氰基以形成式(IV)化合物。
在式(II)、(IIs)、(IIr)、(IV)、(IVs)、(IVr)和(V)化合物中，Hal优选是氟，如果Hal不是氟，在环闭合后合适地将基团Hal转化为氟以形成式(V)化合物。进行该转化的方法在Speciality Chemicalsmagazine，April 2003，36-38页描述。
可转化为二甲基氨基甲基的Z基团是基团，例如-CH2-L、-CH2-NO2、-MgHal、氰基、醛、-CH2-O-Pg、-CH2-NPg1Pg2、-CH2-NMePg1、-CH2-NHCH3、-CH2-NH2、-CO-N(CH3)2、-CH(A1R12)(A1R13)、-(A1R14)(A2R15)(A3R16)、-COOR17、-CH2-CO-NH2、-CH＝CH-R18或-CONHR19，其中Pg是醇基团保护基团，Pg1和Pg2是氨基保护基团，R12和R13分别选自C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基和任选烷基取代的芳基或芳烷基或R12和R13一起形成2-4个碳原子的链，每个R14-R18分别选自C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基和任选C1-6烷基取代的芳基或芳基-C1-6烷基，R19是氢或甲基和A1、A2和A3选自O和S；L是离去基团，例如卤素或-O-SO2-A，其中A是C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基或任选C1-6烷基取代的芳基或芳基-C1-6烷基。
在本发明的一项实施方案中，在式(II)、(IIs)、(IIr)、(IV)、(IVs)、(IVr)和(V)化合物中，Z是二甲基氨基甲基、-CH2-L、-CH2-NPg1Pg2、-CH2-NMePg1、-CH2-NHCH3、-CH2-NH2、-CO-N(CH3)2、醛或-COOR17。
如WO 01/43525、WO 01/51478或WO 01/68631中所述或类似方法，其中Z是-CH2-O-Pg的化合物可通过如下方法转化为基团Z是二甲基氨基甲基的相应化合物，首先除去保护基团形成相应的醇，随后将醇基团转化为不稳定的离去基团，得到的化合物与a)与二甲基胺或其盐反应，b)与甲胺反应，随后甲基化或还原胺化，或c)与叠氮化物反应，随后还原以形成相应的胺，随后甲基化或还原胺化。
其中Z是-CH2-L，其中L是离去基团的化合物可以相同方法转化为二甲基氨基甲基。
如WO 01/43525或WO 01/68631中所述或通过类似方法，其中Z是-CO-N(CH3)2和-CO-NHR19，其中R19是氢或甲基的化合物可通过酰胺的还原和如果形成伯或仲胺，随后甲基化或还原胺化形成二甲基氨基甲基转化为其中Z是二甲基氨基甲基的相应化合物。
如WO 01/43525或WO 01/68631中所述或通过类似方法，其中Z是-CH2-Nme(Pg1)或CH2-N(Pg1)(Pg2)的化合物可通过除去保护基团，即得到其中Z是-CH2-NH2或-CH2-Nmer的化合物，随后氨基甲基化或还原胺化形成二甲基氨基甲基转化为其中Z是二甲基氨基甲基的相应化合物。
如WO 01/43525或WO 01/68631中所述或通过类似方法，其中Z是-CH(A1R12)(A1R13)的化合物可通过脱保护形成醛(其中Z是-CH2-CA1H的化合物)，随后用二甲胺还原胺化形成二甲基氨基甲基转化为其中Z是二甲基氨基甲基的相应化合物。
如WO 01/68631中所述或通过类似方法，其中Z是-(A1R14)(A2R15)(A3R16)的化合物可通过如下方法转化为其中Z是二甲基氨基甲基的相应化合物i)通过水解形成羧酸或其酯，随后还原形成醇，然后将醇转化为不稳定的离去基团，随后如上所述用二甲基氨基置换离去基团，或ii)通过与NH(Me)2、NH2Me、NH3或其盐反应转化羧酸或其酯为酰胺，随后以任何顺序还原酰胺，和如果需要甲基化或还原胺化以形成二甲基氨基。
其中Z是-COOR17的化合物可如上所述用羧酸酯为原料转化为其中Z是二甲基氨基甲基的相应化合物。
如WO 01/43525或WO 01/68631中所述或通过类似方法，其中Z是-CH2-CO-NH2的化合物可通过用次卤酸盐处理得到伯胺，随后游离胺甲基化或还原胺化形成二甲基氨基甲基转化为其中Z是二甲基氨基甲基的相应化合物。
如WO 01/43525或WO 01/68631中所述或通过类似方法，其中Z是-CH＝CH-R18的化合物或通过氧化形成醛，它可通过还原胺化转化为二甲基氨基甲基转化为其中Z是二甲基氨基甲基的相应化合物。
如WO 01/68629中所述或通过类似方法，其中Z是氰基或-CH2-NO2的化合物可通过还原，随后游离氨基的甲基化或还原胺化形成二甲基氨基甲基转化为其中Z是二甲基氨基甲基的相应化合物。
如WO 01/68629中所述或通过类似方法，其中Z是-MgHal的化合物可通过与式(CH3)2NCH2O-烷基的二甲基氨基甲基烷基醚反应转化为其中Z是二甲基氨基甲基的相应化合物。
优选Z是二甲基氨基甲基，如果Z不是二甲基氨基甲基，Z转化为二甲基氨基甲基基团合适地在环闭合后进行。
合适的是，当虚线表示键时，Z是二甲基氨基甲基、-CH2-L、-CH2-NPg1Pg2、-CH2-NMePg1、-CH2-NHCH3、-CH2-NH2、醛、-CO-N(CH3)2、-COOR17。
其中Z是二甲基氨基甲基、-CH2-NPg1Pg2、-CH2-NMePg1、-CH2-NHCH3或-CH2-NH2的式(II)或(IV)化合物，尤其是其中Z是二甲基氨基甲基、-CH2-NHCH3或-CH2-NH2的化合物尤其适用于其中分离式(II)和(IV)化合物的本发明的纯化分离方法。
在式(II)、(IIs)、(IIr)、(IV)、(IVs)、(IVr)和(V)化合物中，虚线优选是单键，其中虚线表示双键的化合物可通过WO 01/68630中所述的方法转化为其中虚线是单键的相应化合物，还原优选在环闭合后进行。
式(IVs)或(IIs)化合物的对映体选择性环闭合形成式(V)化合物可合适地通过用碱，例如KOC(CH3)3和其它醇盐、NaH和其它氢化物、三乙胺、乙基二异丙基胺或吡啶，在低温在惰性有机溶剂，例如四氢呋喃、甲苯、DMSO、DMF、叔丁基甲基醚、二甲氧基乙烷、二甲氧基甲烷、二烷、乙腈或二氯甲烷中处理化合物的不稳定酯衍生物进行。该方法在US 4,943,590中描述。
式(IIs)化合物的环闭合合适地通过在能够与二醇的伯醇形成不稳定基团，例如甲磺酰氧基、对甲苯磺酰氧基、10-樟脑磺酰氧基、三氟乙酰氧基和三氟甲基磺酰氧基和卤素的试剂存在下用如上所述的碱处理进行。
在某些情况下，有利的是，在进行环闭合前，用更不稳定的基团交换式(IVs)化合物中的-W-R3基团，该不稳定基团(离去基团)通常选自甲磺酰氧基、对甲苯磺酰氧基、10-樟脑磺酰氧基、三氟乙酰氧基和三氟甲基磺酰氧基或卤素通常式(IVs)化合物用含水碱，例如NaOH、KOH或LiOH在水或醇或它们的混合物中进行水解以形成式(Hs)化合物，随后与活性离去基团，例如甲磺酰氯或甲苯磺酰氯在有机溶剂中在有机碱存在下反应。
S西酞普兰产物的旋光纯度可在环闭合后改善。根据在WO03/000672中描述的方法，旋光纯度的改善可通过在手性固定相上进行色谱法或通过外消旋西酞普兰碱或其盐的结晶实现。
根据在WO 03/000672中描述的方法，根据本发明得到的式(II)和(IV)化合物的R-对映体可用于在酸性环境中制备外消旋西酞普兰和S西酞普兰。进行酸性环闭合的合适酸是无机酸、羧酸、磺酸或磺酸衍生物，更合适的是硫酸或磷酸。
因此，在另一实施方案中，本发明涉及制备外消旋西酞普兰和/或S西酞普兰或其可药用的盐的方法，其包括在一项实施方案中，通过如上述任一实施方案中定义的本发明的选择性酶酰化方法和在另一实施方案中，通过如上述任一实施方案中定义的本发明的选择性酶脱酰化方法，制备下式的二醇的R-对映体或其盐 其中R是氰基或可转化为氰基的基团，虚线表示任选的键，Z是二甲基氨基甲基或可转化为二甲基氨基甲基的基团和Hal是卤素，或下式的酰化二醇的R-对映体或其盐 其中R、Z、虚线和Hal是如上定义的，W是O或S，R3是-Y-R1，其中R1是C1-10-烷基、C2-10-烯基或C2-10-炔基，它们均可任选被取代基取代一次或多次，取代基选自C1-10-烷氧基、C1-10-烷硫基、羟基、卤素、氨基、硝基、氰基、C1-10-烷基氨基、二(C1-10-烷基)氨基、芳基、芳氧基、芳硫基和杂芳基，或R1是芳基，其中任何芳基和杂芳基可任选被取代基取代一次或多次，取代基选自C1-10-烷基、C2-10-烯基、C2-10-炔基、C1-10-烷氧基、C1-10-烷硫基、羟基、卤素、氨基、硝基、氰基、C1-10-烷基氨基和二(C1-10-烷基)氨基，和Y是键、O、S或NH，随后任选，以任何顺序，将基团R转化为氰基，还原虚线表示的双键为单键，转化基团Z为二甲基氨基甲基和/或转化基团Hal为氟和在酸性条件下式(IIs)或(IVs)的R-对映体的环闭合以形成下式的化合物 其中Hal、Z、R和虚线是如上定义的，和少量相应R-对映体的混合物，随后，以任何顺序，如果R不是氰基，将基团R转化为氰基，如果虚线表示双键，还原成单键，如果Z不是二甲基氨基甲基，转化基团Z为二甲基氨基甲基和如果Hal不是氟，转化Hal为氟，随后通过沉淀外消旋西酞普兰游离碱或其盐和由沉淀母液回收S西酞普兰分离S西酞普兰和/或外消旋西酞普兰或其可药用的盐。
合适的是，上述用于转化R-二醇为S西酞普兰的方法用于制备S西酞普兰。
将基团R转化为氰基，还原虚线表示双键成单键，转化基团Z为二甲基氨基甲基和转化Hal为氟的过程可如上所述进行。
根据上述制备S西酞普兰的方法的一项实施方案，通过酶酰化过程得到的式(II)化合物的R-或S-对映体和式(IV)化合物的相反对映体的混合物，根据上述新的分离和纯化方法之一，通过分离和纯化过程彼此分离。根据另一实施方案，混合物通过其它的上述新的分离和纯化方法分离。
根据上述制备S西酞普兰的方法的另一项实施方案，通过酶脱酰化过程得到的式(II)化合物的R-或S-对映体和式(IV)化合物的相反对映体的混合物，根据上述分离和纯化方法之一，通过分离和纯化过程彼此分离。根据另一实施方案，混合物通过其它的上述分离和纯化方法分离。
根据本发明的另一实施方案，用于制备S西酞普兰的式(IIr)的S-对映体或式(IVr)的S-对映体在环闭合前没有分别由式(IV)和(II)的R-对映体分离。
S西酞普兰产物的旋光纯度可在环闭合后改善。根据在WO03/000672中描述的方法，旋光纯度的改善可通过在手性固定相上进行色谱法或通过外消旋西酞普兰碱或其盐的结晶实现。
用于本文，术语C1-10-烷基是指含有1-10个碳原子的支链或非支链烷基，例如甲基、乙基、1-丙基、2-丙基、1-丁基、2-丁基、2-甲基-2-丙基、2-甲基-1-丙基、戊基、己基和庚基。C1-6-烷基是指含有1-6个碳原子的支链或非支链烷基，例如甲基、乙基、1-丙基、2-丙基、1-丁基、2-丁基、2-甲基-2-丙基、2-甲基-1-丙基、戊基和己基。C1-4-烷基是指含有1-4个碳原子的支链或非支链烷基，例如甲基、乙基、1-丙基、2-丙基、1-丁基、2-丁基、2-甲基-2-丙基和2-甲基-1-丙基。C1-3-烷基是指含有1-3个碳原子的支链或非支链烷基，例如甲基、乙基、1-丙基、2-丙基。
同样，C2-10-烯基和C2-10-炔基分别表示含有2-10个碳原子，分别包括一个双键和三键的支链或非支链烯基和炔基，例如乙烯基、丙烯基、丁烯基、乙炔基、丙炔基和丁炔基。C2-6-烯基和C2-6-炔基分别表示含有2-6个碳原子，分别包括一个双键和三键的支链或非支链烯基和炔基，例如乙烯基、丙烯基、丁烯基、乙炔基、丙炔基和丁炔基。C2-4-烯基和C2-4-炔基分别表示含有2-4个碳原子，分别包括一个双键和三键的支链或非支链烯基和炔基，例如乙烯基、丙烯基、丁烯基、乙炔基、丙炔基和丁炔基。C2-3-烯基和C2-3-炔基分别表示含有2-3个碳原子，分别包括一个双键和三键的支链或非支链烯基和炔基，例如乙烯基、丙烯基、乙炔基和丙炔基。
术语C1-10烷氧基、C1-10烷硫基、C1-10烷基氨基和二-(C1-10-烷基)氨基等表示其中烷基是如上定义的C1-10-烷基的基团。术语C1-6烷氧基、C1-6烷硫基、C1-6烷基氨基和二-(C1-6-烷基)氨基等表示其中烷基是如上定义的C1-6-烷基的基团。术语C1-4烷氧基、C1-4烷硫基、C1-4烷基氨基和二-(C1-4-烷基)氨基等表示其中烷基是如上定义的C1-4-烷基的基团。术语C1-3烷氧基、C1-3烷硫基、C1-3烷基氨基和二-(C1-3-烷基)氨基等表示其中烷基是如上定义的C1-3-烷基的基团。
卤素是指氟、氯、溴或碘。
术语芳基是指单环或双环碳环芳香基团，例如苯基或萘基，尤其是苯基。
芳氧基、芳硫基是指其中芳基是如上定义的基团。
术语杂芳基是指5或6元单环杂芳基或双环杂芳基，合适的杂芳基含有1-3个选自O、S和N的杂原子。
R0和R1可一起形成3-5个碳原子的链，于是形成酐。
当Z是基团-CH2-N(R′R″)，其中R′和R″互相连接以形成包括与它们连接的N-原子的环结构时，环结构形成基团，例如哌啶基、吡咯烷基、吗啉基和哌嗪基。
HOBt是指羧基苯并三唑基，pfp是指五氟苯酚。
实验在如下实施例中，转化％和旋光纯度测定如下用于实施例1-28的HPLC分析条件(用于转化率)柱YMC-Pack ODS-A 0.46cm I.D.×25cm(由YMC Co.，LTD.制造)洗脱液25mM磷酸缓冲液/乙腈＝60/40流量1.0ml/min温度40℃检测器波长237nm用于实施例29-42的HPLC分析条件(用于转化率)柱A Lichrospher RP-8柱，250×4mm(5，μm粒径)洗脱液缓冲MeOH/水，制备如下将1.1ml Et3N加入150ml水中，加入10％H3PO4(含水)至pH＝7，加入水至总共200ml，将混合物加入1.8 LMeOH中。
温度35℃流量1mL/min压力16,0mPa检测UV 254nm注射体积10μL转化率(％)＝P/(S+P)×100，(P产物数量，S残余原料数量)
用于实施例1-28的HPLC分析条件(用于旋光纯度)柱Chiralpak AD 0.46cm I.D.×25cm(由DAICEL CHEMICALINDUSTRIES，LTD.制造)洗脱液庚烷/甲醇/乙醇/二乙胺＝85/7.5/7.5/0.1流量1.0ml/min温度30℃检波器波长240nm转化率(％)＝P/(S+P)×100，(P产物数量，S残余原料数量)用于实施例29-42的超临界液相色谱分析条件(用于旋光纯度)柱Daicel AD柱，尺寸250×4.6mm(5μm粒径)移动相二氧化碳改性剂含有二乙胺(0.5％)和三氟乙酸(0.5％)的甲醇改性剂梯度1-2％，4分钟2-4％，4分钟4-8％，4分钟8-16％，4分钟16-32％，4分钟32-45％，1,62分钟温度室温流量2mL/min压力20mPa检测UV 230nm和254nm注射体积10μL旋光纯度(％ee)＝(A-B)/(A+B)×100，(A和B表示相应的立体异构体，A＞B)E-值＝ln((1-c/100)×(1-Es/100))/ln((1-c/100)×(1+Es/100))(c转化比率，Es残余原料的旋光纯度)实施例1(S)-4-[4-二甲基氨基-1-(4′-氟苯基)-1-羟基丁基]-3-羟基甲基-苯甲腈将水(200.7g)和甲苯(440.8g)加入(±L)-4-[4-二甲基氨基-1-(4′-氟苯基)-1-羟基丁基]-3-羟基甲基-苯甲腈，1/2硫酸盐(100.4g，0.257mol)，随后搅拌15分钟，其温度上升到60℃。随后在5分钟内滴加30％氢氧化钠(34.5g，0.259mol)直至水层的pH达到11.4，搅拌30分钟。搅拌后，使混合物静置5分钟，分离。弃掉水层，得到的有机层用220.0g水洗涤，进一步在60℃下减压浓缩以除去残余的水分。通过加入甲苯调节浓度，从而得到583.1g 4-[4-二甲基氨基-1-(4′-氟苯基)-1-羟基丁基]-3-羟基甲基-苯甲腈在甲苯中的溶液(纯4-[4-二甲基氨基-1-(4′-氟苯基)-1-羟基丁基]-3-羟基甲基-苯甲腈的含量87.6g，收率99.7％，0.256mol)。随后在17.5g固定的酶(Novozym 435)上倾倒52.5g甲苯，随后加入583.1g 4-[4-二甲基氨基-1-(4′-氟苯基)-1-羟基丁基]-3-羟基甲基-苯甲腈在甲苯中的溶液，混合物的温度控制在40℃。随后，向上述混合物在20分钟内加入含有新戊酸(28.7g，0.281mol)、乙烯基丁酸酯(29.2gm，0.256mol)和甲苯(28.8g)的混合溶液，混合物在40℃直至在轻微流动的氮气下搅拌12小时。在2小时内冷却混合物至20℃后，混合物在相同温度下搅拌1小时，停止搅拌。过滤出酶，随后酶用105g甲苯洗涤，合并甲苯层。甲基层含有583.1g 4-[4-二甲基氨基-1-(4′-氟苯基)-1-羟基丁基]-3-羟基甲基-苯甲腈在甲苯中的溶液(纯(S)-4-[4-二甲基氨基-1-(4′-氟苯基)-1-羟基丁基]-3-羟基甲基-苯甲腈的含量36.0g，整个酶拆分过程的收率41.1％，0.105mol)。
含有上清液和洗涤液体的混合溶液用水(438g，263g×2)提取三次，1005.4g得到的水层用79g甲苯洗涤五次。结果得到985.2g(S)-4-[4-二甲基氨基-1-(4′-氟苯基)-1-羟基丁基]-3-羟基甲基苯甲腈，新戊酸盐水溶液{纯(S)-4-[4-二甲基氨基-1-(4′-氟苯基)-1-羟基丁基]-3-羟基甲基苯甲腈的含量为32.6g，收率(整个用水提取过程和用甲苯洗涤过程)90.6％，0.0952mol}。向所得到的985.2g(S)-4-[4-二甲基氨基-1-(4′-氟苯基)-1-羟基丁基]-3-羟基甲基苯甲腈，新戊酸盐水溶液中加入218.2g甲苯，随后在搅拌下向混合物中缓慢加入30％NaOH(13.3g，0.0998mol)直至水层的pH达到11.9，混合物保持搅拌30分钟。在搅拌后，混合物静置30分钟，分离甲苯层，其余的水层用142.5g甲苯重新提取。合并的甲苯层用169.0g水洗涤两次，在60℃下减压浓缩从而得到64.0g的(S)-4-[4-二甲基氨基-1-(4′-氟苯基)-1-羟基丁基]-3-羟基甲基-苯甲腈在甲苯中的溶液。所述甲苯溶液含有32.0g(0.0935mol)(S)-4-[4-二甲基氨基-1-(4′-氟苯基)-1-羟基丁基]-3-羟基甲基苯甲腈。总体收率36.4％。HPLC测量的旋光纯度为98.7％ee，化学纯度为99.9面积％，{(R)-5-氰基-2-[二甲基氨基-(4′-氟苯基)-羟基丁基]苄基丁酸酯0.04面积％。
在上述体系中，上述“化学纯度”由如下公式表示。
(化学纯度)＝[4-[4-二甲基氨基-1-(4′-氟苯基)-1-羟基丁基]-3-羟基甲基苯甲腈的面积值]/[(所有检测化合物的面积值)-(甲苯面积值)-(系统产物的面积值)]×100(面积％)实施例2在配备塞子的试管中加入50mg(0.146mmol)(±)-4-[4-二甲基氨基-1-(4′-氟苯基)-1-羟基丁基]-3-羟基甲基苯甲腈、25mg各种脂肪酶、33mg(0.29mmol)乙烯基丁酸酯和1ml甲苯，在40℃下搅拌16小时。对于至少50％ee旋光纯度的原料，计算E-值，结果未于表1中。
表1实施例3在配备塞子的试管中加入10-100mg(0.029-0.29mmol)(±)-4-[4-二甲基氨基-1-(4′-氟苯基)-1-羟基丁基]-3-羟基甲基苯甲腈、10-100mg的Novozym 435(Novozymes产品，E/S比率＝1.0)、33-333mg(10eq.)乙烯基丁酸酯和1ml甲苯，在30℃下搅拌16小时。结果示于表2中。
表2
实施例4在配备塞子的试管中加入100mg(0.292mmol)(±)-4-[4-二甲基氨基-1-(4′-氟苯基)-1-羟基丁基]-3-羟基甲基-苯甲腈、50mg Novozym435(Novozymes产品)、333mg(2.92mmol)乙烯基丁酸酯、0.292mmol各种添加剂和1ml甲苯，在40℃的温度下搅拌16小时。结果示于表3中。
表3实施例5在200-ml配备搅拌器和温度计的4颈烧瓶中，将1.5g(4.38mmol)(±)-4-[4-二甲基氨基-1-(4′-氟苯基)-1-羟基丁基]-3-羟基甲基苯甲腈溶解在30ml甲苯中，随后加入0.45g的Novozym 435(Novozymes产品)、0.347g(4.38mmol)吡啶、4.38mmol各种酸和1.00g(8.76mmol)乙烯基丁酸酯，在40℃搅拌16-21.5小时，结果示于表4中。
表4实施例6在200-ml配备搅拌器和温度计的4颈烧瓶中，将3.0g(8.76mmol)(±)-4-[4-二甲基氨基-1-(4′-氟苯基)-1-羟基丁基]-3-羟基甲基苯甲腈溶解在30ml甲苯中，随后加入0.9g的Novozym 435(Novozymes产品)、0.693g(8.76mmol)吡啶、8.76mmol各种酸和2.00g(17.52mmol)乙烯基丁酸酯，在40℃搅拌15.5-16.5小时，结果示于表5中。
表5实施例7在200ml配备搅拌器和温度计的4颈烧瓶中，将4.5g(13.1mmol)(±)-4-[4-二甲基氨基-l-(4′-氟苯基)-1-羟基丁基]-3-羟基甲基苯甲腈溶解在30ml甲苯中，随后加入0.90g Novozym 435(Novozymes产品)、2.68g(26.2mmol)新戊酸和0.900-1.500g(0.6-1.0eq)乙烯基丁酸酯，在40℃搅拌24小时。结果示于表6中。
表6实施例8在500-ml配备搅拌器和温度计的分液烧瓶中，将20.0g(58.4mmol)(±)-4-(4-二甲基氨基-1-(4′-氟苯基)-1-羟基丁基)-3-羟基甲基苯甲腈溶解在144ml甲苯中，随后加入新戊酸(1.1-3eq.)、4.0g Novozym435(Novozymes产品)和6.67g(58.4mmol)乙烯基丁酸酯，在氮气流下(5ml/min)在40℃搅拌20-24小时。结果示于表7中。
表7实施例9在配备塞子的中加入10mg(0.029mmol)(±)-4-[4-二甲基氨基-1-(4′-氟苯基)-1-羟基丁基]-3-羟基甲基苯甲腈、10mg Novozym435(Novozymes产品)、0.29mmol各种酰基供体和1ml异丙基醚，在30℃下搅拌16小时。对于旋光纯度至少30％ee的原料，计算E-值。结果示于表8中。
表8实施例10在配备塞子的试管中加入10mg(0.029mmol)(±)-4-[4-二甲基氨基-1-(4′-氟苯基)-1-羟基丁基]-3-羟基甲基苯甲腈、10mg Novozym435(Novozymes产品)、33mg(0.29mmol)乙烯基丁酸酯和1ml各种溶剂，在30℃搅拌16小时。反应后，分析转化比率和旋光纯度，计算E-值，结果示于表9中。
表9实施例11在配备搅拌器和温度计的200-ml 4颈烧瓶中加入0.9-1.35g(E/S比率为0.2-0.3)Novozym 435(Novozym产品)。向烧瓶中加入4.5g(13.1mmol)(±)-4-[4-二甲基氨基-1-(4′-氟苯基)-1-羟基丁基]-3-羟基甲基苯甲腈在30ml甲苯中的溶液、2.01g新戊酸(19.7mmol)和1.50g(13.1mmol)乙烯基丁酸酯，在35-45℃搅拌21小时。在反应后，反应溶液通过倾析分离，残余的酶用30ml甲苯，并回收。除使用回收的酶外，重复如上所述的相同操作4次以进行环化反应。酶活性根据如下公式计算，结果示于表10中。
酶活性(U/g)＝(每分钟制备的产物数量(μmol/min))/(酶重量(g))表10
实施例12(S)-4-[4-二甲基氨基-1-(4′-氟苯基)-1-羟基丁基]-3-羟基甲基-苯甲腈新戊酸盐在配备搅拌器和温度计的4颈烧瓶中加入10.0 g(0.029 mol)(±)-4-[4.二甲基氨基-1-(4′-氟苯基)-1-羟基丁基]-3-羟基甲基苯甲腈在甲苯的溶液66.6 g，控制温度为40℃，随后在上述混合物中加入2.27 g(0.029 mo1)吡啶、2.98 g(0.029 m01)新戊酸、3.35 g(0.029 mo1)乙烯基丁酸酯和2.0 g固定的酶(Novozym 435)。反应混合物在40℃下在氮气的轻微气流下搅拌15小时，停止搅拌，用Kiriyama漏斗由反应混合物中过滤出酶，酶用21.6 g甲苯洗涤。结果得到(S)-4-[4-二甲基氨基-1-(4′-氟苯基)-1-羟基丁基]-3-羟基甲基苯甲腈(3.6 g，0.011 mol，收率36.0％，旋光纯度98.5％ee)，新戊酸盐。合并的甲苯在20℃下用水(50 ml，30 ml，30 ml)洗涤三次，得到含有(s)-4-[4-二甲基氨基-1-(4′-氟苯基)-1-羟基丁基]-3-羟基甲基苯甲腈(3.5 g，0.011 mol，提取收率95％)，新戊酸盐的水层。
实施例13(S)-4-[4-二甲基氨基-1-(4′-氟苯基)-1-羟基丁基]-3-羟基甲基-苯甲腈新戊酸盐在配备搅拌器和温度计的4颈烧瓶中加入20.0 g(0.028 mol)(±)-4-[4-二甲基氨基-1-(4′-氟苯基)-1-羟基丁基]-3-羟基甲基苯甲腈在甲苯的溶液66.7g，控制温度为40℃，随后在上述混合物中加入5.93g(0.058mol)新戊酸、6.62g(0.058mol)乙烯基丁酸酯和4.1g固定的酶(Novozym435)。反应混合物在40℃下在氮气的轻微气流下搅拌18小时，停止搅拌，用Kiriyama漏斗由反应混合物中过滤出酶，酶用41.3g甲苯洗涤。结果在甲苯溶液中得到6.7g(0.020mol)(S)-4-[4-二甲基氨基-1-(4′-氟苯基)-1-羟基丁基]-3-羟基甲基苯甲腈，收率33.5％，旋光纯度99.7％ee。
实施例14(S)-4-[4-二甲基氨基-1-(4′-氟苯基)-1-羟基丁基]-3-羟基甲基-苯甲腈环己烷羧酸盐在配备搅拌器和温度计的4颈烧瓶中加入250.0g的25.0g(0.073mol)(±)-4-[4-二甲基氨基-1-(4′-氟苯基)-1-羟基丁基]-3-羟基甲基苯甲腈在甲苯中的溶液，温度控制在40℃。随后向上述混合物中加入5.77g(0.073mol)吡啶、8.33g(0.073mol)乙烯基丁酸酯、9.52g(0.073mol)环己烷羧酸和5.0g固定的酶(Novozym 435)。反应混合物在轻微氮气气流下在40℃搅拌17.5小时，停止搅拌。过滤出酶，用54.1g甲苯洗涤。结果得到含有(S)-4-[4-二甲基氨基-1-(4′-氟苯基)-1-羟基丁基]-3-羟基甲基苯甲腈(8.6g，0.025mol，收率34.4％，旋光纯度98.7％ee)，环己烷羧酸盐的甲苯层。
合并的甲苯层用水(187.5ml×5)在20℃下洗涤5次，得到含有(S)-4-[4-二甲基氨基-1-(4′-氟苯基)-1-羟基丁基]-3-羟基甲基苯甲腈(7.6g，0.0221mol，提取收率89％)，环己烷羧酸盐的水层。
实施例15(S)-4-[4-二甲基氨基-1-(4′-氟苯基)-1-羟基丁基]-3-羟基甲基-苯甲腈o-甲苯甲酸盐在配备搅拌器和温度计的4颈烧瓶中加入250.0g的25.0g(0.073mol)(±)-4-[4-二甲基氨基-1-(4′-氟苯基)-1-羟基丁基]-3-羟基甲基苯甲腈在甲苯中的溶液，温度控制在40℃。随后向上述混合物中加入5.77g(0.073mol)吡啶、8.33g(0.073mol)乙烯基丁酸酯、9.93g(0.073mol)o-甲苯甲酸和5.0g固定的酶(Novozym 435)。反应混合物在轻微氮气气流下在40℃搅拌21小时，停止搅拌。用Kiriyam漏斗由反应混合物过滤出酶，用54.1g甲苯洗涤。结果得到含有(S)-4-[4-二甲基氨基-1-(4′-氟苯基)-1-羟基丁基]-3-羟基甲基苯甲腈(9.7g，0.028mol，收率38.8％，旋光纯度97.8％ee)，o-甲苯甲酸的甲苯层。
合并的甲苯层用水(250ml，63ml，63ml)在60℃下洗涤3次，得到含有(S)-4-[4-二甲基氨基-1-(4′-氟苯基)-1-羟基丁基]-3-羟基甲基苯甲腈(7.8g，0.0228mol，提取收率80％)，o-甲苯甲酸的水层。
实施例16(S)-4-[4-二甲基氨基-1-(4′-氟苯基)-1-羟基丁基]-3-羟基甲基-苯甲腈异丁酸盐在配备搅拌器和温度计的4颈烧瓶中加入10.0g(0.029mol)(±)-4-[4-二甲基氨基-1-(4′-氟苯基)-1-羟基丁基]-3-羟基甲基苯甲腈在甲苯的溶液33.3g，控制温度为40℃，随后在上述混合物中加入2.29g(0.029mol)吡啶、2.57g(0.029mol)异丁酸、3.33g(0.029mol)乙烯基丁酸酯和2.0g固定的酶(Novozym 435)。反应混合物在40℃下在氮气的轻微气流下搅拌24小时，停止搅拌，用Kiriyama漏斗由反应混合物中过滤出酶，酶用21.6g甲苯洗涤。结果得到含有(S)-4-[4-二甲基氨基-1-(4′-氟苯基)-1-羟基丁基]-3-羟基甲基苯甲腈(3.8g，0.011mol，收率38.0％，旋光纯度95.9％ee)，异丁酸盐的甲苯层。
实施例17(S)-4-[4-二甲基氨基-1-(4′-氟苯基)-1-羟基丁基]-3-羟基甲基-苯甲腈苯甲酸盐在配备搅拌器和温度计的4颈烧瓶中加入250.0g的50.0g(0.146mol)(±)-4-[4-二甲基氨基-1-(4′-氟苯基)-1-羟基丁基]-3-羟基甲基苯甲腈在甲苯中的溶液，温度控制在40℃。随后向上述混合物中加入11.5g(0.146mol)吡啶、33.2g(0.291mol)乙烯基丁酸酯、17.8g(0.146mol)苯甲酸和10.0g固定的醇(Novozym 435)。反应混合物在轻微氮气气流下在40℃搅拌20小时，停止搅拌。用kiriyama漏斗由反应混合物中过滤出酶，用108g甲苯洗涤。结果得到含有(S)-4-[4-二甲基氨基-1-(4′-氟苯基)-1-羟基丁基]-3-羟基甲基苯甲腈(22.0g，0.064mol，收率44.0％，旋光纯度99.0％ee)，苯甲酸盐的甲苯层。
合并的甲苯层用水(500ml×3)在60℃下洗涤3次，得到含有(S)-4-[4二甲基氨基-1-(4′-氟苯基)-1-羟基丁基]-3-羟基甲基苯甲腈(21.0g，0.0614mol，提取收率96％)，苯甲酸盐的水层。
如下实施例18-28说明由反应混合物分离S-二醇。
实施例18在配备塞子的试管中加入4.3mg(0.0126mmol)(S)-4-[4-二甲基氨基-1-(4′-氟苯基)-1-羟基丁基]-3-羟基甲基苯甲腈(化合物A)、6.8mg(0.0165mmol)(R)-5-氰基-2-[4-二甲基氨基-1-(4′-氟苯基)-1-羟基丁基]-苄基丁酸酯(化合物B)、1ml甲苯、1ml水和0.291mmol各种酸(在二元酸的情况下，例如0.146mmol)，在40℃下搅拌1小时。由此得到的混合溶剂分离为水层和甲苯层，随手测定在各自层中化合物A和B的浓度。根据如下公式计算分配系数Ka或Kb，结果示于表11中。
Ka＝(在水层中化合物A的浓度)/(在甲苯层中化合物A的浓度)Kb＝(在水层中化合物B的浓度)/(在甲苯层中化合物B的浓度)
表11
实施例19(S)-4-[4-二甲基氨基-1-(4′-氟苯基)-1-羟基丁基]-3-羟基甲基-苯甲腈新戊酸盐由实施例1方法得到的酶反应混合物中过滤出酶，用甲苯洗涤两次。将由此得到的含有(S)-4-[4-二甲基氨基-1-(4′-氟苯基)-1-羟基丁基]-3-羟基甲基苯甲腈(44.8g，0.131mol)，新戊酸盐的1174.3g甲苯溶液加入600.3g水中，提取。再用359.7g水提取，得到1375.9g的(S)-4-[4-二甲基氨基-1-(4′-氟苯基)-1-羟基丁基]-3-羟基甲基苯甲腈，新戊酸盐水溶液。水溶液含有43.8g(0.128mol，收率97.8％)(S)-4-[4-二甲基氨基-1-(4′-氟苯基)-1-羟基丁基]-3-羟基甲基苯甲腈。旋光纯度98.4％ee，(R)-5-氰基-2-[二甲基氨基-(4′-氟苯基)-羟基丁基]苄基丁酸酯10.7面积。
实施例20(S)-4-[4-二甲基氨基-1-(4′-氟苯基)-1-羟基丁基]-3-羟基甲基-苯甲腈新戊酸盐向通过实施例19的方法分离得到的12.6g的(S)-4-[4-二甲基氨基-1-(4′-氟苯基)-1-羟基丁基]-3-羟基甲基苯甲腈新戊酸盐{(S)-4-[4-二甲基氨基-1-(4′-氟苯基)-1-羟基丁基]-3-羟基甲基苯甲腈含量0.4g，1.168mmol}水溶液中加入1.4g(0.018mol)乙酸铵。随后向其中加入1.0g甲苯，混合物搅拌10分钟。在静置30分钟后，通过分离混合物溶液弃去有机层，得到含有(S)-4-[4-二甲基氨基-1-(4′-氟苯基)-1-羟基丁基]-3-羟基甲基苯甲腈(0.389g，1.136mmol，收率97.3％)，新戊酸盐的水层。经HPLC分析发现，化学纯度为97.3面积％，含有(R)-5-氰基-2-[二甲基氨基-(4′-氟苯基)-羟基丁基]苄基丁酸酯1.5面积％。
实施例21(S)-4-[4-二甲基氨基-1-(4′-氟苯基)-1-羟基丁基]-3-羟基甲基-苯甲腈新戊酸盐向通过实施例19的方法分离得到的12.6g的(S)-4-[4-二甲基氨基-1-(4′-氟苯基)-1-羟基丁基]-3-羟基甲基苯甲腈新戊酸盐{(S)-4-[4-二甲基氨基-1-(4′-氟苯基)-1-羟基丁基]-3-羟基甲基苯甲腈含量0.4g，1.168mmol}水溶液中加入1.4g(0.013mol)硫酸锂。随后向其中加入1.0g甲苯，混合物搅拌10分钟。在静置30分钟后，通过分离混合物溶液弃去有机层，得到含有(S)-4-[4-二甲基氨基-1-(4′-氟苯基)-1-羟基丁基]-3-羟基甲基苯甲腈，新戊酸盐(0.394g，1.151mmol，收率98.5％)的水层。经HPLC分析发现，化学纯度为93.7面积％，含有(R)-5-氰基-2-[二甲基氨基-(4′-氟苯基)-羟基丁基]苄基丁酸酯5.5面积％。
实施例22(S)-4-[4-二甲基氨基-1-(4′-氟苯基)-1-羟基丁基]-3-羟基甲基-苯甲腈新戊酸盐向通过实施例19的方法分离得到的12.6g的(S)-4-[4-二甲基氨基-1-(4′-氟苯基)-1-羟基丁基]-3-羟基甲基苯甲腈新戊酸盐{(S)-4-[4-二甲基氨基-1-(4′-氟苯基)-1-羟基丁基]-3-羟基甲基苯甲腈含量0.4g，1.168mmol}水溶液中加入1.4g(0.011mol)硫酸铵。随后向其中加入1.0g甲苯，混合物搅拌10分钟。在静置30分钟后，通过分离混合物溶液弃去有机层，得到含有(S)-4-[4-二甲基氨基-1-(4′-氟苯基)-1-羟基丁基]-3-羟基甲基苯甲腈，新戊酸盐(0.397g，1.159mmol，收率99.3％)的水层。经HPLC分析发现，化学纯度为94.7面积％，含有(R)-5-氰基-2-[二甲基氨基-(4′-氟苯基)-羟基丁基]苄基丁酸酯4.5面积％。
实施例23(S)-4-[4-二甲基氨基-1-(4′-氟苯基)-1-羟基丁基]-3-羟基甲基-苯甲腈新戊酸盐向通过实施例19的方法分离得到的12.6g的(S)-4-[4-二甲基氨基-1-(4′-氟苯基)-1-羟基丁基]-3-羟基甲基苯甲腈新戊酸盐{(S)-4-[4-二甲基氨基-1-(4′-氟苯基)-1-羟基丁基]-3-羟基甲基苯甲腈含量0.4g，1.168mmol}水溶液中加入1.4g(0.0099mol)硫酸钠。随后向其中加入1.0g甲苯，混合物搅拌10分钟。在静置30分钟后，通过分离混合物溶液弃去有机层，得到含有(S)-4-[4-二甲基氨基-1-(4′-氟苯基)-1-羟基丁基]-3-羟基甲基苯甲腈新戊酸盐(0.391g，1.142mmol，收率97.8％)的水层。经HPLC分析发现，化学纯度为94.5面积％，含有(R)-5-氰基-2-[二甲基氨基-(4′-氟苯基)-羟基丁基]苄基丁酸酯4.7面积％。
实施例24(S)-4-[4-二甲基氨基-1-(4′-氟苯基)-1-羟基丁基]-3-羟基甲基-苯甲腈新戊酸盐向通过实施例19的方法分离得到的12.6g的(S)-4-[4-二甲基氨基-1-(4′-氟苯基)-1-羟基丁基]-3-羟基甲基苯甲腈新戊酸盐{(S)-4-[4-二甲基氨基-1-(4′-氟苯基)-1-羟基丁基]-3-羟基甲基苯甲腈含量0.4g，1.168mmol}水溶液中加入0.7g(0.012mol)氯化钠。随后向其中加入1.0g甲苯，混合物搅拌10分钟。在静置30分钟后，通过分离混合物溶液弃去有机层，得到含有(S)-4-[4-二甲基氨基-1-(4′-氟苯基)-1-羟基丁基]-3-羟基甲基苯甲腈新戊酸盐(0.397g，1.159mmol，收率99.3％)的水层。经HPLC分析发现，化学纯度为93.3面积％，含有(R)-5-氰基-2-[二甲基氨基-(4′-氟苯基)-羟基丁基]苄基丁酸酯5.8面积％。
如实施例19相比，实施例20-24显示通过加入盐的分离改善。
实施例25(S)-4-[4-二甲基氨基-1-(4′-氟苯基)-1-羟基丁基]-3-羟基甲基-苯甲腈新戊酸盐由实施例1方法得到的酶反应混合物中过滤出酶，用甲苯洗涤两次。由此得到的含有1.0g(2.92mmol)(S)-4-[4-二甲基氨基-1-(4′-氟苯基)-1-羟基丁基]-3-羟基甲基苯甲腈，新戊酸的19.4g甲苯溶液调节到40℃，向溶液中加入13mL水，提取。溶液再用7.5mL水提取两次，得到(S)-4-[4-二甲基氨基-1-(4′-氟苯基)-1-羟基丁基]-3-羟基甲基苯甲腈，新戊酸盐溶液。在上述水溶液中，含有0.886g(2.588mmol，收率88.6％)(S)-4-[4-二甲基氨基-1-(4′-氟苯基)-1-羟基丁基]-3-羟基甲基苯甲腈。
实施例26(S)-4-[4-二甲基氨基-1-(4′-氟苯基)-1-羟基丁基]-3-liydroxymethyl-苯甲腈新戊酸盐由实施例1方法得到的酶反应混合物中过滤出酶，用甲苯洗涤两次。由此得到的含有1.0g(2.92mmol)(S)-4-[4-二甲基氨基-1-(4′-氟苯基)-1-羟基丁基]-3-羟基甲基苯甲腈，新戊酸的19.4g甲苯溶液调节到40℃，向溶液中加入11.6mL水，提取。溶液再用5.8mL水提取三次，得到(S)-4-[4-二甲基氨基-1-(4′-氟苯基)-1-羟基丁基]-3-羟基甲基苯甲腈，新戊酸盐溶液。在上述水溶液中，含有0.879g(2.567mmol，收率87.9％)(S)-4-[4-二甲基氨基-1-(4′-氟苯基)-1-羟基丁基]-3-羟基甲基苯甲腈。
实施例27(S)-4-[4-二甲基氨基-1-(4′-氟苯基)-1-羟基丁基]-3-羟基甲基-苯甲腈新戊酸盐由实施例1方法得到的酶反应混合物中过滤出酶，用甲苯洗涤两次。由此得到的含有1.0g(2.92mmol)(S)-4-[4-二甲基氨基-1-(4′-氟苯基)-1-羟基丁基]-3-羟基甲基苯甲腈，新戊酸的10.4g甲苯溶液加入13.0mL水，提取。溶液再用7.5mL水提取两次，得到(S)-4-[4-二甲基氨基-1-(4′-氟苯基)-1-羟基丁基]-3-羟基甲基苯甲腈，新戊酸盐不溶液。在上述水溶液中，含有0.954g(2.786mmol，收率95.4％)(S)-4-[4-二甲基氨基-1-(4′-氟苯基)-1-羟基丁基]-3-羟基甲基苯甲腈。
实施例28(S)-4-[4-二甲基氨基-1-(4′-氟苯基)-1-羟基丁基]-3-羟基甲基-苯甲腈新戊酸盐由实施例1方法得到的酶反应混合物中过滤出酶，用甲苯洗涤两次。由此得到的含有1.0g(2.92mmol)(S)-4-[4-二甲基氨基-1-(4′-氟苯基)-1-羟基丁基]-3-羟基甲基苯甲腈，新戊酸的19.4g甲苯溶液加入0.43g(4.210mmol)新戊酸，混合物用13mL水提取。溶液再用7.5mL水提取两次，得到(S)-4-[4-二甲基氨基-1-(4′-氟苯基)-1-羟基丁基]-3-羟基甲基苯甲腈，新戊酸盐不溶液。在上述水溶液中，含有0.947g(2.766mmol，收率94.7％)(S)-4-[4-二甲基氨基-1-(4′-氟苯基)-1-羟基丁基]-3-羟基甲基苯甲腈。
比较实施例25、26、27和28显示通过加入新戊酸得到改善的分离，而更多次的洗涤和调节温度对分离没有重大影响。
实施例29
(S)-4-[4-二甲基氨基-1-(4′-氟苯基)-1-羟基丁基]-3-羟基甲基-苯甲腈向外消旋4-[4-二甲基氨基-1-(4-氟-苯基)-1-羟基-丁基]-3-羟基甲基-苯甲腈(0,29mmol，100mg)和乙烯基丁酸酯(3,9mmol，0,5ml)在无水1，4-二烷(2,5ml)中的搅拌溶液中加入脂蛋白脂肪酶假单胞菌属(160U，5mg)，反应加热到37℃，用HPLC跟踪。在162小时后(转化率33,9％)，过滤出酶，用少量1，4-二烷洗涤。合并的有机相真空蒸发，随后用超临界液相色谱分析得到72％ee的(R)-丁酸酯和28％ee的(S)-二醇。
实施例30(S)-4-[4-二甲基氨基-1-(4′-氟苯基)-1-羟基丁基]-3-羟基甲基-苯甲腈向外消旋4-[4-二甲基氨基-1-(4-氟-苯基)-1-羟基-丁基]-3-羟基甲基-苯甲腈(0,29mmol，100mg)和乙烯基丁酸酯(0,58mmol，73,6μl)在无水1，4-二烷(3,0ml)中的搅拌溶液中加入脂蛋白脂肪酶假单胞菌属(160U，4mg)，反应加热到37℃，用HPLC跟踪。在194小时后转化率为18,7％，过滤出酶，用少量1，4-二烷洗涤。合并的有机相真空蒸发，随后用超临界液相色谱分析得到92％ee的(R)-丁酸酯和14％ee的(S)-二醇。如表12中所示，反应还用1，4和8当量乙烯基丁酸酯监控。
表12(括号内的数值是没有酶的转化率)实施例31(S)-4-[4-二甲基氨基-1-(4′-氟苯基)-1-羟基丁基]-3-羟基甲基-苯甲腈向外消旋4-[4-二甲基氨基-1-(4-氟-苯基)-1-羟基-丁基]-3-羟基甲基-苯甲腈(0,29mmol，100mg)和乙烯基丁酸酯(0,59mmol，75μl)在无水1，4-二烷(2,925ml)中的搅拌溶液中加入脂蛋白脂肪酶假单胞菌属(160U，5mg)，反应加热到50℃，用HPLC跟踪。在165小时后转化率为30,4％，过滤出酶，用少量1，4-二烷洗涤。合并的有机相真空蒸发，随后用超临界液相色谱分析得到98,1％ee的(R)-丁酸酯和30,3％ee的(S)-二醇。如表13中所示，反应还在25、37和65℃下监控。
表13(括号内的数值是没有酶的转化率)实施例32(S)-4-[4-二甲基氨基-1-(4′-氟苯基)-1-羟基丁基]-3-羟基甲基-苯甲腈向外消旋4-[4-二甲基氨基-1-(4-氟-苯基)-1-羟基-丁基]-3-羟基甲基-苯甲腈(0,29mmol，100mg)和乙烯基丁酸酯(0,59mmol，75μl，2当量)在无水1，4-二烷(2,925ml)中的搅拌溶液中加入脂蛋白脂肪酶假单胞菌属(160U，4,5mg)，反应加热到50℃，用HPLC跟踪。在209小时后，过滤出酶，用少量1，4-二烷洗涤。合并的有机相真空蒸发，随后用超临界液相色谱分析得到(R)-丁酸酯和(S)-二醇。如表14中所示，反应还用200mg、500mg和1000mg二醇和分别150μl、375μl和750μl乙烯基丁酸酯和2,85ml、2,625ml和2,25ml1，4-二烷进行监控。
表14实施例33(S)-4-[4-二甲基氨基-1-(4′-氟苯基)-1-羟基丁基]-3-羟基甲基-苯甲腈向外消旋4-[4-二甲基氨基-1-(4-氟-苯基)-1-羟基-丁基]-3-羟基甲基-苯甲腈(0,29mmol，100mg)和乙烯基丁酸酯(0,59mmol，75μl)在无水1，4-二烷(2,925ml)中的搅拌溶液中加入脂蛋白脂肪酶假单胞菌属(160U，4mg)，反应加热到50℃，用HPLC跟踪。在473小时后转化率为30,4％，过滤出酶，用少量1，4-二烷洗涤。合并的有机相真空蒸发，随后用HPLC分析，结果示于表15中。
表15实施例34(S)-4-[4-二甲基氨基-1-(4′-氟苯基)-1-羟基丁基]-3-羟基甲基-苯甲腈向外消旋4-[4-二甲基氨基-1-(4-氟-苯基)-1-羟基-丁基]-3-羟基甲基-苯甲腈(2,9mmol，1000mg)和乙烯基丁酸酯(5,9mmol，750μl)在无水1，4-二烷(14,25ml)中的搅拌溶液中加入脂蛋白脂肪酶假单胞菌属(160U，20mg)，反应加热到50℃，用HPLC跟踪。在139小时后，加入附加的5mg脂肪酶，在155小时后，加入附加的15mg脂肪酶，在399小时后，转化率为55,7％，收集样品。过滤出酶，用少量1，4-二烷洗涤。合并的有机相真空蒸发，随后用超临界液相色谱分析。在560小时后，转化率为62,8％，反应停止。过滤出酶，用少量1，4-二烷洗涤。合并的有机相真空蒸发，随后用超临界液相色谱分析。得到的ee-值示于表16中。
表16实施例35(S)-西酞普兰二醇类似物向外消旋西酞普兰二醇类似物(0,29mmol，100mg)和乙烯基丁酸酯(0,29mmol，37μl)在无水1，4-二烷(2,925ml)中的搅拌溶液中加入4-10mg PspLL，反应加热到50℃，用HPLC跟踪。在反应停止后，过滤出酶，用少量1，4-二烷洗涤。合并的有机相真空蒸发，随后用超临界液相色谱分析，结果示于表17中。
表17(括号内的数值是没有酶的转化率)实施例36(S)-4-[4-二甲基氨基-1-(4′-氟苯基)-1-羟基丁基]-3-羟基甲基-苯甲腈向外消旋4-[4-二甲基氨基-1-(4-氟-苯基)-1-羟基-丁基]-3-羟基甲基-苯甲腈(29mmol，10g)和乙烯基丁酸酯(58mmol，7,5ml)在无水1，4-二烷(142,5ml)中的搅拌溶液中加入脂蛋白脂肪酶假单胞菌属(160U，250mg)，反应加热到50℃，用HPLC跟踪。在192小时后，转化率为，41％，加入附加的250mg脂肪酶。在504小时后，转化率为63％，反应停止。过滤出酶，用少量1，4-二烷洗涤。合并的有机相真空蒸发，随后用超临界液相色谱分析，得到的EE-值((S-二醇)＝95％(S-二醇/R-二醇＝40∶1)。
实施例37用快速色谱法分离(S)-4-[4-二甲基氨基-1-(4′-氟苯基)-1-羟基丁基]-3-羟基甲基-苯甲腈将372mg ee-值为94,5％的S-西酞普兰二醇和628mg ee-值为59,5％的R-西酞普兰二醇的混合物溶解在少量含有4％三乙胺的乙酸乙酯/庚烷4∶1中。用快速色谱法在含有4％三乙胺的乙酸乙酯/庚烷4∶1中分离S-西酞普兰二醇得到120mg S-西酞普兰二醇(ee-值94,5％)。
实施例38通过洗涤含有S-二醇碱的混合物分离(S)-4-[4-二甲基氨基-1-(4′-氟苯基)-1-羟基丁基]-3-羟基甲基-苯甲腈向S-西酞普兰二醇和R-西酞普兰二醇丁酸酯(各0,3g)的混合物中加入24ml庚烷和66ml水/甲醇(2∶1)。将透明溶液转化至分液漏斗，收集有机相。向水相中加入附加的10ml庚烷，充分混合。收集有机相，再重复提取4次。合并的庚烷相用20ml水/甲醇(2∶1)反提取，合并水相，蒸发至半体积，用10ml乙酸乙酯提取3次。合并的乙酸乙酯相用硫酸钠干燥，过滤和真空干燥得到0,15g S-西酞普兰二醇，含有2％的R-西酞普兰二醇丁酸酯。
实施例39使用Novozymes 435的(S)-西酞普兰二醇类似物向外消旋西酞普兰二醇类似物(0,29mmol，100mg)和乙烯基丁酸酯(0,29mmol，37μl)在无水1，4-二烷(2,925ml)中的搅拌溶液中加入0,2mg Novozymes 435和(0,32mmol，33mg)新戊酸，反应加热到40℃，用HPLC跟踪。在反应停止后，过滤出酶，用少量甲苯洗涤。合并的有机相真空蒸发，随后用超临界液相色谱分析，结果示于表18中。
表18实施例40
各种羧酸对使用Novozymes 435的酶酰化过程的影响向外消旋4-[4-二甲基氨基-1-(4-氟-苯基)-1-羟基-丁基]-3-羟基甲基-苯甲腈(0,29mmol，100mg)和乙烯基丁酸酯(0,29mmol，37μl)在无水甲苯(2,925ml)中的搅拌溶液中加入Novozymes 435，(0,2mg)和1，1eq羧酸。反应加热到40℃，用HPLC跟踪。过滤出酶，用少量甲苯洗涤。合并的有机相真空蒸发，随后用超临界液相色谱分析，结果示于表19中。
表19实施例41(R)-5-氰基-2-[二甲基氨基-(4′-氟苯基)-羟基丁基]苄基丁酸酯在配备搅拌器和温度计的4颈烧瓶中加入含有21.9g(0.064mol)(±)-4-[4-二甲基氨基-1-(4′-氟苯基)-1-羟基丁基]-3-羟基甲基苯甲腈在甲苯的溶液219g，随后在上述混合物中加入14.6g(0.128mol)乙烯基丁酸酯、5.07g(0.128mol)吡啶、7.89g(0.064mol)苯甲酸和2.19g固定的酶(Novozym 435)。反应混合物温热到60℃，在氮气的轻微气流下搅拌15小时，停止搅拌。用Kiriyama漏斗由反应混合物中过滤出酶，酶用50g甲苯洗涤。合并的甲苯用水(255ml，265ml)洗涤两次，浓缩得到14.9g(R)-5-氰基-2-[二甲基氨基-(4′-氟苯基)-羟基丁基]苄基丁酸酯苯甲酸盐。
向4.0g(R)-5-氰基-2-[二甲基氨基-(4′-氟苯基)-羟基丁基]苄基丁酸酯苯甲酸盐(7.48mmol)、40ml水和40ml甲苯的混合物中在搅拌下加入1.26g 30％氢氧化钠(9.45mol)，混合物保持搅拌30分钟。在搅拌下使混合物静置，分离甲苯层。甲苯层用40ml水洗涤，在40℃减压浓缩得到2.7g(R)-5-氰基-2-[二甲基氨基-(4′-氟苯基)-羟基丁基]苄基丁酸酯。
1H NMR(400MHz.CDCl3)a(ppm)7.69(1H，s)，7.68-7.56(2H，m)，7.36-7.23(2H，m)，7.02-6.90(2H，m)，5.41(1H，d，J14.9Hz)，4.99(1H，d，J14.6Hz)，2.59-2.42(1H，m)，2.40-2.30(3H，m)，2.26(2H，dt，J＝7.3Hz，1.5Hz)，2.18(6H，s)，1.68-1.57(2H，m)，1.67-1.46(2H，m)，0.93(3H，t，J＝7.6Hz)。
实施例42S西酞普兰草酸盐将经手性超临界液相色谱法测定的化学纯度为99％和ee值98.7％的(S)4-(4-二甲基氨基)-1-(4′-氟苯基)-1-羟基丁基)-3-羟基甲基苯甲腈(15.8g，46.2mmol)溶解在甲苯(100mL)中，加入三乙胺(13.0mL，93.2mmol)，然后缓慢加入甲苯磺酰氯(9.4g，49.4mmol)在甲苯(100mL)中的溶液。得到的溶液在室温下搅拌20分钟，随后加入水(50mL)和浓氨水(25mL)。混合物在45℃下搅拌2分钟，转移至分液漏斗中。分相，有机相用水(50mL)洗涤，用硫酸镁干燥，过滤和减压浓缩得到粗产物(14.2g)，收率95％。将粗产物溶解在乙醇(17mL)中，加入草酸(3.95g，43.9mmol)在乙醇(27mL)中的溶液。过滤收集沉淀得到S西酞普兰草酸盐(14.0g)，它由乙醇(85mL)重结晶得到最终产物(12.2g)。经HPLC测定纯度为99.65％，经手性超临界液相色谱测定ee为98.5％。
权利要求
1.由含有式(IV)化合物和式(II)二醇的混合物分离和纯化式(IV)化合物或其盐的方法 其中R是氰基或可转化为氰基的基团，虚线表示双键或单键，Hal是卤素，Z是基团-CH2-N(R′R″)，其中R′和R″是C1-6烷基或R′和R″互相连接以形成包括与它们连接的N-原子的环结构，或Z是可转化为二甲基氨基甲基的基团，W是O或S，R3是-Y-R1，其中Y是键、O、S或NH和R1是C1-10-烷基、C2-10-烯基或C2-10-炔基，它们均可任选被取代基取代一次或多次，取代基选自C1-10-烷氧基、C1-10-烷硫基、羟基、卤素、氨基、硝基、氰基、C1-10-烷基氨基、二(C1-10-烷基)氨基、芳基、芳氧基、芳硫基和杂芳基，或R1是芳基；其中任何芳基和杂芳基可任选被取代基取代一次或多次，取代基选自C1-10-烷基、C2-10-烯基、C2-10-炔基、C1-10-烷氧基、C1-10-烷硫基、羟基、卤素、氨基、硝基、氰基、C1-10-烷基氨基和二(C1-10-烷基)氨基，和/或下式的二醇或其盐 其中R、Z、Hal和虚线是如上定义的，所述方法包括a)在水和有机溶剂的混合物中在酸存在下处理含有式(IV)化合物和式(II)的二醇的所述混合物；b)由有机相分离含有作为所述酸的盐的式(II)二醇的水相，得到含有作为所述酸的盐的式(IV)化合物的有机相；任选作为碱或其盐分离式(II)化合物和任选作为碱或其盐的式(IV)化合物。
2.权利要求1的方法，其中式(II)的二醇的S-对映体与式(IV)酰基衍生物的R-对映体分离。
3.权利要求1的方法，其中式(IV)酰基衍生物的S-对映体与式(II)二醇的R-对映体分离。
4.权利要求1-3的方法，其中用于步骤a)的式(IV)酰基衍生物的R-或S-对映体和式(II)二醇的相反对映体的混合物根据制备下式二醇的S-或R-对映体或其盐的方法制备 其中R是氰基或可转化为氰基的基团，Z是基团-CH2-N(R′R″)，其中R′和R″是C1-6烷基或R′和R″互相连接以形成包括与它们连接的N-原子的环结构，或Z是可转化为二甲基氨基甲基的基团，虚线是双键或单键，Hal是卤素，和/或制备下式的酰化二醇的相反对映体或其盐的方法 其中R、Z、虚线和Hal是如上定义的，W是O或S，R3是-Y-R1，其中R1是C1-10-烷基、C2-10-烯基或C2-10-炔基，它们均可任选被取代基取代一次或多次，取代基选自C1-10-烷氧基、C1-10-烷硫基、羟基、卤素、氨基、硝基、氰基、C1-10-烷基氨基、二(C1-10-烷基)氨基、芳基、芳氧基、芳硫基和杂芳基，或R1是芳基；其中任何芳基和杂芳基可任选被取代基取代一次或多次，取代基选自C1-10-烷基、C2-10-烯基、C2-10-炔基、C1-10-烷氧基、C1-10-烷硫基、羟基、卤素、氨基、硝基、氰基、C1-10-烷基氨基和二(C1-10-烷基)氨基，和Y是键、O、S或NH，其包括a)使下式的外消旋化合物 其中R、Z、虚线和Hal是如上定义的，使用下式的酰化试剂 或式R1-N＝C＝O的异氰酸酯或式R1-N＝C＝S的硫代异氰酸酯进行选择性酶酰化其中X是O或S；W是O或S；U是O或S，V是卤素；R0是C1-10-烷基、C2-10-烯基或C2-10-炔基，它们均可任选被取代基取代一次或多次，取代基选自C1-10-烷氧基、C1-10-烷硫基、羟基、卤素、氨基、硝基、氰基、C1-10-烷基氨基、二(C1-10-烷基)氨基、芳基、芳氧基、芳硫基和杂芳基，或R0是芳基；其中任何芳基和杂芳基可任选被取代基取代一次或多次，取代基选自C1-10-烷基、C2-10-烯基、C2-10-炔基、C1-10-烷氧基、C1-10-烷硫基、羟基、卤素、氨基、硝基、氰基、C1-10-烷基氨基和二(C1-10-烷基)氨基；R1是如R0所定义的；R2是如R0所定义的，或R2是合适的离去基团；或R0和R1一起形成3-5个碳原子的链；其前提是，当X是S时W和U不是S；形成R-或S-形式的式(II)原料与下式化合物的相反对映体的混合物 其中R、W、Hal、R3、虚线和Z是如上定义的；或b)使下式的外消旋化合物 其中R、Z、W、Hal、虚线和R3是如上定义的；进行选择性酶脱酰化过程以形成R-或S-形式的下式脱酰化化合物 其中R、Hal、虚线和Z是如上定义的，和相反对映体形式的式(IV)酰化原料的混合物；随后任选，以任何顺序，分离式(II)化合物的S-或R-对映体和/或式(IV)化合物的相反对映体或其盐。
5.由含有式(IV)酰基衍生物和式(II)二醇的混合物分离和纯化式(IV)酰基衍生物或其盐的方法 其中R是氰基或可转化为氰基的基团，Hal是卤素，虚线表示双键或单键，Z是基团-CH2-N(R′ R″)，其中R′和R″是C1-6烷基或R′和R″互相连接以形成包括与它们连接的N-原子的环结构，或Z是可转化为二甲基氨基甲基的基团，W是O或S，R3是-Y-R1，其中Y是键、O、S或NH和R1是C1-10-烷基、C2-10-烯基或C2-10-炔基，它们均可任选被取代基取代一次或多次，取代基选自C1-10-烷氧基、C1-10-烷硫基、羟基、卤素、氨基、硝基、氰基、C1-10-烷基氨基、二(C1-10-烷基)氨基、芳基、芳氧基、芳硫基和杂芳基，或R1是芳基，其中任何芳基和杂芳基可任选被取代基取代一次或多次，取代基选自C1-10-烷基、C2-10-烯基、C2-10-炔基、C1-10-烷氧基、C1-10-烷硫基、羟基、卤素、氨基、硝基、氰基、C1-10-烷基氨基和二(C1-10-烷基)氨基，和/或下式的二醇或其盐 其中R、Hal、Z和虚线是如上定义的，所述方法包括a)在水、质子传递有机溶剂和非极性有机溶剂的混合物中处理含有式(IV)酰基衍生物和式(II)二醇的所述混合物；b)由有机相分离含有式(II)二醇的水相，得到含有式(IV)酰基衍生物的有机相；任选由水/有机相分离式(II)二醇和/或(IV)化合物，和任选转化式(II)和/或(IV)化合物为其盐。
6.权利要求5的方法，其中式(II)二醇的S-二醇与式(IV)酰基衍生物的R-对映体分离。
7.权利要求5的方法，其中式(IV)酰基衍生物的S-对映体与式(II)二醇的R-对映体分离。
8.权利要求5-7的方法，其中用于步骤a)的式(IV)化合物的R-或S-对映体和式(II)化合物的相反对映体的混合物根据制备下式二醇的S-或R-对映体或其盐的方法制备 其中R是氰基或可转化为氰基的基团，Z是基团-CH2-N(R′R″)，其中R′和R″是C1-6烷基或R′和R″互相连接以形成包括与它们连接的N-原子的环结构，或Z是可转化为二甲基氨基甲基的基团，虚线是双键或单键，Hal是卤素，和/或制备下式的酰化二醇的相反对映体或其盐的方法 其中R、Z、虚线和Hal是如上定义的，W是O或S，R3是-Y-R1，其中R1是C1-10-烷基、C2-10-烯基或C2-10-炔基，它们均可任选被取代基取代一次或多次，取代基选自C1-10-烷氧基、C1-10-烷硫基、羟基、卤素、氨基、硝基、氰基、C1-10-烷基氨基、二(C1-10-烷基)氨基、芳基、芳氧基、芳硫基和杂芳基，或R1是芳基；其中任何芳基和杂芳基可任选被取代基取代一次或多次，取代基选自C1-10-烷基、C2-10-烯基、C2-10-炔基、C1-10-烷氧基、C1-10-烷硫基、羟基、卤素、氨基、硝基、氰基、C1-10-烷基氨基和二(C1-10-烷基)氨基，和Y是键、O、S或NH，其包括a)使下式的外消旋化合物 其中R、Z、虚线和Hal是如上定义的，使用下式的酰化试剂 或式R1-N＝C＝O的异氰酸酯或式R1-N＝C＝S的硫代异氰酸酯进行选择性酶酰化其中X是O或S；W是O或S；U是O或S，V是卤素；R0是C1-10-烷基、C2-10-烯基或C2-10-炔基，它们均可任选被取代基取代一次或多次，取代基选自C1-10-烷氧基、C1-10-烷硫基、羟基、卤素、氨基、硝基、氰基、C1-10-烷基氨基、二(C1-10-烷基)氨基、芳基、芳氧基、芳硫基和杂芳基，或R0是芳基；其中任何芳基和杂芳基可任选被取代基取代一次或多次，取代基选自C1-10-烷基、C2-10-烯基、C2-10-炔基、C1-10-烷氧基、C1-10-烷硫基、羟基、卤素、氨基、硝基、氰基、C1-10-烷基氨基和二(C1-10-烷基)氨基；R1是如R0所定义的；R2是如R0所定义的，或R2是合适的离去基团；或R0和R1一起形成3-5个碳原子的链；其前提是，当X是S时W和U不是S；形成R-或S-形式的式(II)原料与下式化合物的相反对映体的混合物 其中R、W、Hal、R3、虚线和Z是如上定义的；或b)使下式的外消旋化合物 其中R、Z、W、Hal、虚线和R3是如上定义的；进行选择性酶脱酰化过程以形成R-或S-形式的下式脱酰化化合物 其中R、Hal、虚线和Z是如上定义的，和相反对映体形式的式(IV)酰化原料的混合物；随后任选，以任何顺序，分离式(II)化合物的S-或R-对映体和/或式(IV)化合物的相反对映体或其盐。
全文摘要
本发明涉及用于制备S西酞普兰的式(II)二醇中间体和/或式(IV)酰化二醇的相反对映体的新的制备方法，方法包含酶酰化或脱酰化过程。
文档编号C12P13/00GK101045664SQ20071010180
公开日2007年10月3日 申请日期2003年8月12日 优先权日2002年8月12日
发明者N·陶卡, T·卡托, S·亚马莫托, T·尤施达, T·塔克达, Y·厄达, H·彼得森, R·丹塞尔, H·阿马迪安, L·O·林索 申请人:H.隆德贝克有限公司