专利名称：建立巴西橡胶树悬浮细胞系的方法
技术领域：
本发明属于植物细胞工程技术领域，更具体涉及一种建立巴西橡 胶树悬浮细胞系的方法。
背景技术：
天然橡胶为四大工业原料之一，也是极为重要的战略物资。目前，
在自然界大约2000余种产胶植物中，商品天然胶约99 %来源于巴西橡 胶树(Heveabrasiliensis)。巴西橡胶树属大戟科橡胶树属多年生乔木， 常规育种周期为20 30年，超长的育种周期使巴西橡胶树新品种选育 和更新受到了很大的P艮制。为了拓宽巴西橡胶树的育种途径和创新育 种方法，从上个世纪50年代以来，世界各国的育种工作者开始研究生 物技术在巴西橡胶树育种中的应用。花药和内珠被的体细胞胚胎发生 和胚胎植株再生的成功为巴西橡胶树创造了新型种植材料自根无性 系。巴西橡胶树存在两个生理状态幼态和老态，大田试验己经证明 幼态橡胶树较老态橡胶树可增产10 50%,而通过体细胞胚胎发生获 得的自根无性系可以使老态幼态化。自根无性系的大规模工厂化生产 和商业化应用，将带来巴西橡胶树种植材料的革新和种苗生产模式的 重大改变。
目前，巴西橡胶树自根无性系主要通过两种途径获得花药和内 珠被培养。其基本过程是1)剥取单核靠边期花药或幼嫩种子内珠
被进行愈伤组织诱导培养；2)将愈伤组织转入体胚发生培养基，进 行体细胞胚胎发生诱导；3)经体胚发生诱导后，部分愈伤上会出现 球形胚、子叶形胚等胚状体；4)将成熟的子叶形胚转入植株再生培 养基上进行植株再生。
迄今，巴西橡胶树自根无性系植株在多个国家已经进入大田生产 试验，与传统的芽接苗相比，自根无性系植株较芽接苗增产10 50%， 这使得自根无性系植株将成为未来橡胶树主要种植材料。然而，目前 巴西橡胶树自根无性系植株生产存在主要问题是花药和内珠被的获 得受季节的限制，无法廉价的、大量的、持续的、长期的获得胚性愈 伤组织，无法对胚性愈伤组织进行规模化的增殖，因而无法大量获得 自根无性系植株，进而无法满足大田生产对大量自根无性系植株的需 求。为此，建立能大量的、持续的、长期的和可快速扩繁的获得胚性 愈伤组织的技术体系，将为大量获得胚性愈伤组织和工厂化生产自根 无性系植株寻求解决问题的新技术。
发明内容
本发明的目的是提供一种建立巴西橡胶树悬浮细胞系的方法，它 利用传统方法获得花药胚性愈伤组织，并将其接种到液体培养基中进 行悬浮培养，最终获得悬浮细胞系。
本发明所设计的建立巴西橡胶树悬浮细胞系的方法包括外植体 的准备过程、胚性愈伤组织诱导过程、胚性愈伤组织继代过程、胚性 愈伤组织悬浮培养过程。
1、外植体的准备过程以巴西橡胶树花蕾为外植体，对花蕾进 行表面消毒。
2、 胚性愈伤组织诱导过程剥出消毒好的花蕾中的雄蕊，接种
到诱导愈伤的诱导培养基上进行暗培养；所述诱导培养基是以MS培 养基为基础培养基，将MS培养基中的磷酸二氢钾、无水氯化钙、四 水硫酸锰和七水硫酸镁的含量进行调整，并添加2，4-D、 KT、 NAA、 Phytagel、蔗糖、椰子水；
3、 胚性愈伤组织继代过程将胚性愈伤组织在诱导培养基上继 代培养；
4、 胚性愈伤组织悬浮培养过程将继代后的愈伤组织破碎成颗 粒，然后将愈伤组织颗粒接种到液体培养基中，置于摇床上进行暗培 养，然后再继代培养，将大块的愈伤组织去掉，将小的愈伤和细胞继 续继代培养，即获得悬浮细胞系；所述液体培养基是以MS培养基为 基础培养基，将MS培养基中的磷酸二氢钾、无水氯化钙、四水硫酸 锰和七水硫酸镁的含量进行调整，并添加2,4-D、 KT、 NAA、蔗糖、 椰子水。
本发明的有益效果
1、 可大量、快速、持续、低成本的获得胚性愈伤组织。本发明 是在常规方法基础上，利用少量花药愈伤组织，建立增殖快速、可长 期继代的悬浮细胞系，悬浮系建立后，将悬浮细胞或小的细胞团继续 诱导胚性愈伤组织，如此可长期提供胚性愈伤组织，克服了常规方法 的缺点。
2、 悬浮细胞系是诱导巴西橡胶树自根无性系极好材料，可以大 大提高巴西橡胶树自根无性系植株工厂化生产的效率和实现规模化 砧木选育种研究。悬浮细胞系可以长期的、持续的、大量的获得胚性 愈伤组织，可以实现胚性愈伤组织进行大量的扩繁，解决了传统方法 不断采集花蕾或果实、不断诱导胚性愈伤组织的重复、低效、繁重的 体力劳动，解决了大田生产对大量自根无性系植株的需求。
3、悬浮细胞系的建立拓展了巴西橡胶树选育和遗传改良的途径。 4、为巴西橡胶树生物反应器的研发奠定了基础。 在巴西橡胶树花药组培的基础上，本发明工艺流程简单，生产成 本低，悬浮系生长迅速、均一、分散性良好，应用领域非常广。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
本发明所设计的建立巴西橡胶树悬浮细胞系的方法包括外植体 的准备过程、胚性愈伤组织诱导过程、胚性愈伤组织继代过程、胚性
愈伤组织悬浮培养过程
1、 外植体的准备过程是以巴西橡胶树花蕾为外植体，用70-80 %酒精对花蕾进行表面消毒30~60秒后，再用0.1%氯化汞消毒10-15 分钟，最后用无菌水冲洗3 6次，每次3 5分钟；
2、 胚性愈伤组织诱导过程是剥出消毒好的花蕾中的雄蕊，接种 到诱导愈伤的诱导培养基上于25 28"C的温度进行暗培养，培养 40~60天；所述诱导培养基是以MS培养基为基础培养基，将MS培 养基中的磷酸二氢钾、无水氯化钙、四水硫酸锰和七水硫酸镁的含量 调整为磷酸二氢钾350-500 mg/L、无水氯化钙150-400 mg/L、四水
硫酸锰10-40 mg/L、七水硫酸镁400-600 mg/L，并添加2,4-D 0.5~3mg/L、 KT0.5~3mg/L、 NAA0.5~3mg/L、 Phytagel 2~3g/L、庶糖 50 90g/L、椰子水40-60ml/L;
3、胚性愈伤组织继代过程是将经过诱导的胚性愈伤组织在诱导 培养基上继代培养2~4次，每7 10天一次，暗培养，温度为25~28 °C;
4、胚性愈伤组织悬浮培养过程是将继代后的愈伤组织破碎成 0.2~0.5cm颗粒，然后将2~6g愈伤组织颗粒接种到含20~60ml液体培 养基的三角瓶中，置于90 110r/分钟的摇床上，在温度为25 28。C， 暗培养，每7 10天继代一次，继代3 8次后，将大块的愈伤组织去 掉，将小的愈伤和细胞继续继代培养，即获得悬浮细胞系；所述液体 培养基是以MS培养基为基础培养基，将MS培养基中的磷酸二氢钾、 无水氯化钙、四水硫酸锰和七水硫酸镁的含量调整为磷酸二氢钾 350-500 mg/L、无水氯化钙150-400 mg/L、四水硫酸锰10-40 mg/L、 七水硫酸镁400-600 mg/L，并添加2,4-D 0.5~3mg/L、 KT0.5~3mg/L、 NAA0.5~3mg/L、蔗糖50~90g/L、椰子水40-60ml/L。
实施例
一种建立巴西橡胶树悬浮细胞系的方法，具体步骤是
A、 以巴西橡胶树花蕾为外植体，将花蕾用75%酒精表面消毒60秒 后，再用O. 1%氯化汞消毒15分钟，最后用无菌水冲洗3次，每 次5分钟；
B、 将消毒好的花蕾中的雄蕊剥出，将其接种到诱导培养基上于28°C
的温度下进行暗培养50天；诱导培养基是以MS培养基为基础培 养基，将MS基本培养基中的磷酸二氢钾、无水氯化钙、四水硫酸 锰和七水硫酸镁的含量调整为磷酸二氢钾350mg/U无水氯化钙 200 mg/L、四水硫酸锰20 mg/L、七水硫酸镁400 mg/L，并添加 2， 4-D 2mg/L、 KT lmg/L、 NAA lmg/L、 Phytagel 2g/L、蔗糖70g/L、 椰子水50ml/L;
C、 将愈伤在诱导愈伤培养基上继代培养4次，每7天一次；
D、 继代后的愈伤组织破碎成0. 3cm颗粒，将3g愈伤接种到含50ml
液体培养基的三角瓶中，置于100r/分钟的摇床上，温度为28 'C，暗培养，每7天继代一次，继代5次后，将大块的愈伤去掉， 将小的愈伤和细胞继续继代培养，即获得悬浮细胞系。液体培养 基是以MS培养基为基础培养基，将MS基本培养基中的磷酸二氢 钾、无水氯化钙、四水硫酸锰和七水硫酸镁的含量调整为磷酸二 氢钾350 mg/L、无水氯化钙200 mg/L、四水硫酸锰20 mg/L、 七水硫酸镁400 mg/L，并添加2, 4-D 2mg/L、KT lmg/L、NAA lmg/L、 蔗糖70g/L、椰子水50ml/L。
权利要求
1、一种建立巴西橡胶树悬浮细胞系的方法，其特征在于包括外植体的准备过程、胚性愈伤组织诱导过程、胚性愈伤组织继代过程、胚性愈伤组织悬浮培养过程；1)、所述外植体的准备过程是以巴西橡胶树花蕾为外植体，用70-80％酒精对花蕾进行表面消毒30～60秒后，再用0.1％氯化汞消毒10～15分钟，最后用无菌水冲洗3～6次，每次3～5分钟；2)、所述胚性愈伤组织诱导过程是剥出消毒好的花蕾中的雄蕊，接种到诱导愈伤的诱导培养基上于25～28℃的温度进行暗培养，培养40～60天；所述诱导培养基是以MS培养基为基础培养基，将MS培养基中的磷酸二氢钾、无水氯化钙、四水硫酸锰和七水硫酸镁的含量调整为磷酸二氢钾350-500mg/L、无水氯化钙150-400mg/L、四水硫酸锰10-40mg/L、七水硫酸镁400-600mg/L，并添加2，4-D0.5～3mg/L、KT 0.5～3mg/L、NAA 0.5～3mg/L、Phytagel 2～3g/L、蔗糖50～90g/L、椰子水40-60ml/L；3)、所述胚性愈伤组织继代过程是将经过诱导的胚性愈伤组织在诱导培养基上继代培养2～4次，每7～10天一次，暗培养，温度为25～28℃；4)、所述胚性愈伤组织悬浮培养过程是将继代后的愈伤组织破碎成0.2～0.5cm颗粒，然后将2～6g愈伤组织颗粒接种到含20～60ml液体培养基的三角瓶中，置于90～110r/分钟的摇床上，在温度为25～28℃，暗培养，每7～10天继代一次，继代3～8次后，将大块的愈伤组织去掉，将小的愈伤和细胞继续继代培养，即获得悬浮细胞系；所述液体培养基是以MS培养基为基础培养基，将MS培养基中的磷酸二氢钾、无水氯化钙、四水硫酸锰和七水硫酸镁的含量调整为磷酸二氢钾350-500mg/L、无水氯化钙150-400mg/L、四水硫酸锰10-40mg/L、七水硫酸镁400-600mg/L，并添加2，4-D 0.5～3mg/L、KT0.5～3mg/L、NAA 0.5～3mg/L、蔗糖50～90g/L、椰子水40-60ml/L。
全文摘要
本发明公开了一种建立巴西橡胶树悬浮细胞系的方法，它包括外植体的准备过程、胚性愈伤组织诱导过程、胚性愈伤组织继代过程、胚性愈伤组织悬浮培养过程。本发明工艺流程简单，生产成本低，建立的悬浮细胞系增殖迅速、稳定、可以长期继代培养，解决了常规巴西橡胶树胚性愈伤组织获得受季节和气候等影响以及规模化增殖和花费大量人力和物力的问题，为巴西橡胶树自根无性系大规模商业化、工厂化生产和大规模大田种植提供了重要基础，为巴西橡胶树利用体细胞杂交、遗传转化和突变体诱导等生物技术方法创造新的优良的种质资源提供了新的途径和条件，为巴西橡胶树生物反应器的研发奠定了基础。
文档编号C12N5/02GK101173245SQ20071018489
公开日2008年5月7日 申请日期2007年10月25日 优先权日2007年10月25日
发明者华玉伟, 吴紫云, 霞 曾, 哲 李, 李维国, 胡彦师, 黄华孙, 黄天带 申请人:中国热带农业科学院橡胶研究所