专利名称：一种微生物油脂的制备方法
技术领域：
本发明涉及生物转化法制备油脂，具体地说是一种利用微生物转化N-乙酰葡 糖胺和减葡糖胺制备油脂的方法。
背景技术：
长链脂肪酸甘油酯(油脂)是重要的食用品和化工原料。作为化工原料，油 脂可用于生产可生物降解的润滑油、溶剂油、油漆和油墨溶剂、表面活性剂、粘 接剂等产品。近年来，油脂还广泛应用于生产可再生能源产品生物柴油。因此， 油脂资源的需求量显著增加。通常油脂来源于油料植物的种子禾棵实以及动物脂 肪组织，其中油料植物是提取油脂的主要原料。种植油料植物和油料作物需要占 用耕地，生产受到季节和自然条件的制约，不利于油脂原料稳定和连续供应。
许多微生物，如酵母、霉菌和藻类等在一定条件下，可以碳水化合物、碳氢 化合物等为碳源，在体内合成并IG存大量脂肪酸甘油酯，这种油脂称为微生物油 脂。微生物发酵底物范围较广，包括可直接利用的葡萄糖、果糖、蔗糖、糖蜜、 乳清以及淀粉和纤维素水解产物等(Ratledge C, Wynn J. The Biochemistiy and Molecular Biology of Lipid Accumulation in Oleaginous Microorganisms. Adv Appl Microbiol, 2002,51:1-51)。据报道，部分微生物能在菌体内积累含量超过细胞干 重60%以上的油脂。部分微生物油脂和一般植物油具有相似的脂肪酸组成，仍以 (:16和<:18系脂肪酸为主。微生物油脂发酵不但可提供新的油脂生产方法，而且可合 理利用废弃生物质，降低油脂生产成本，保护环境。因此，微生物油脂是潜在的 动植物油脂替代资源，具有广阔的应用空间。
壳多糖(Chitin)又名甲壳质，几丁质，广泛存在于虾、蟹等甲壳类动物外 骨骼中，是自然界中含量仅次于纤维素的一种多糖，也是地球上数量最大的含氮 有机化合物(Austin P民Brine C J, Castl J E, et al. Chitin: flew facets of research. Science, 1981,212: 749-753)。壳多糖是一类由结构单颜-乙酰葡糖胺(2-乙醐安基 _2_脱氧^_!>葡萄糖)以"-l,4-糖苷键连接而形成的高聚物。壳多糖经过酸7K解或酶水解可以得到N-乙酰葡糖胺和葡糖胺，这两种单糖资源丰富，对工业微生物发酵 生产具有重要价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种成本低、工艺简便、方法易行的利用生物转化法 制备微生物油脂的方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为
一种微生物油脂的制备方法，其以N-乙酰葡糖胺和/或葡糖胺为主要原料进 行微生物发酵培养，获得微生物油脂。
是将N-乙酰葡糖胺和/或葡糖胺作为培养基碳源，其中可添加少量其它微生
物生长必需营养成份，灭菌后接入产油微生物种子液，于20。C 37。C通气培养， 发酵终止后分离收集菌体，提取获得微生物油脂。利用本发明菌体含油率15% 66% (w/w)。
具体为(1)将N-乙酰葡糖胺和减葡糖胺制成总浓度为20g/L 200g/L的水 溶液，添加0 3 g/L常规微生物生长所需营养成份，如酵母粉、蛋白胨、麦牙汁、 磷酸钾、硫酸镁、硫酸锌、硫酸亚铁、硫酸锰、氯化,丐等，调节pH5.5 7.5，所 得培养基灭菌后备用；
(2) 产油微生物在液体种子培养基(葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨IO g/L，余量为水，pH5.5 6.0)中，于30。C， 180 200转/分钟振荡培养20小时 36小时，得每毫升含105 108个活细胞的种子液；
(3) 向步骤(1)所述培养基中接入步骤(2)制备的产油微生物种子液，接种量 2% 20% (v/v)，在20 °C 37 °C下通气培养36小时 240小时，发酵液中总还 原糖浓度可降至1%以下；
(4) 终止发酵，固液分离收集菌体，经有机溶剂提取得到微生物油脂。
本发明可参照文献(李植峰，张玲，沈晓京，等四种真菌油脂提取方法的比 较研究.微生物学通报，2001,28(6):72 75)使用酸热法提取微生物油脂。按每克 菌体加入2 4mol/L盐酸5 10mL，于78 。C水浴处理1小时，冷却后加入甲醇 和氯仿萃取，收集氯仿层，7jC洗，以无7jC硫酸钠干燥，过滤，滤液绍鄉除去低
4沸点有机溶剂，并在105 "C干燥得到微生物油脂。以油脂质量除以提取时使用的
干菌体质量得到菌体油脂含量(w/w)。按文献方法(张峻,邢来君,王红梅.Y—亚
麻酸高产菌株的选育及发酵产物的分离提取.微生物学通报，1993, 20 (3):
140 143)进行气相色谱分析，构成本发明所得到微生物油脂的脂肪酸包括碳链
长度含有12 22个碳原子的脂肪酸。原料对菌体得率在15% 45% (w/w)，菌
体含油率为15% 66% (w/w)。
所述N-乙酰葡糖胺和减葡糖胺7jC溶液可以是含壳多糖原料的水解液；所述 含壳多糖原料的水溶液为蟹壳、虾壳和/或鱼鳞的酸水解液或者酶水解液。
本发明使用的产油微生物包括圆红冬孢酵母朋^/a^w诚wmton/"'tfey、弯曲 隐球酵母Q^ tococa^ wrra加、解脂亚罗酵母Farravi^ /z>o/,'ca、乳糖红酵母
橘林油脂酵母Z^ow_ycas 发酵性丝孢酵母7h'c/zos;7oro" yfe層e"tora、健强地霉Gfeo/r/c/z謂ro6慮騰禾口深黄被孢霉MoWere〃a ira6函'/7a。
本发明的有益效果是(1)与传统通过油料植物获取油脂的方法相比，本发明 技术简单有效，周期短，可连续操作，节约耕地，不受场地、季节、气候变化的 影响；(2)与生物转化其它淀粉质和纤维质糖源制备油脂的方法相比，本发明使用 的原料来源于壳多糖，资源丰富，成本低；(3)本发明可用于大量获取油脂，有利 于资源综合利用和环境保护，可获得显著的综合效益。
具体实施例方式
下面是本发明的具体实施例，其中使用到的产油微生物圆红冬孢酵母 i^ot/as/ on'^Mm torw/c^es AS 2.1389、解脂亚罗酵母！^rraw/" /z>o/,'mAS 2.1398、 小红酵母i /Kx/otorw/a附/ra^a AS 2.277、乳糖红酵母i /20abton^ /actoraAS 2.1514、 皮状丝孢酵母7h'c/KW/ oraM AS 2.571和深黄被孢霉MoWe //<3
AS 3.3410购自中国普通微生物菌种保藏管理中心；橘林油脂酵母丄^o^ycm CICC 1714、发酵性丝孢酵母7h'c/zo^ora"/em^wtom CICC 1368和健 强地霉Geofr7'c/2Mm ra6M似w CICC 1256购自中国工业微生物菌种保藏管理中心； 弯曲隐球酵母C，tococc^ cwrra加ATCC 20509购自美国普通微生物菌种保藏管 理中心。通过实施例可进一步了解不同微生物转化N-乙酰葡糖胺和/或葡糖胺生 产油脂的能力，但不以任何形式限制产油微生物的具体种属。实施例l:培养基组成(g/L): N-乙酰葡糖胺70， KH2PO40.7， MgS04'7H20 0.2，酵母粉0.1，调节pH5.5。 12rC灭菌15min后，以10。/。(v/v)接种量接入圆 红冬孢酵母AS 2.1389种子液，于30。C通气培养96小时，停止发酵，将发酵液 于6000转/分钟离心10分钟，收集菌体，得到干菌体93g/L。
按每克干菌体加入3mol/L盐酸8mL，于78 。C水浴处理1小时，冷却，加 入甲醇和氯仿萃取，收集氯仿层，7jC洗，以无7jC硫酸钠^B喿，过滤，滤液经浓縮 除去低沸点有机溶剂，并在105。C干燥得至微生物油脂产品2.6g/L，菌体油脂含 量28% (w/w)。
实施例2:培养基组成(g/L): N-乙酰葡糖胺20， KH2PO40.7， MgS04.7H20 0.2，酵母粉O.l，调节pH6.0。 121 。C灭菌15min后，以5% (v/v)接种量接入圆 红冬孢酵母AS 2.1389种子液，于30 °C通气培养36小时，按实施例1的方法后 处理，得到干菌体5.5g/L，菌体油脂含量23%。
实施例3:培养基组成(g/L): N-乙酰葡糖胺100， KH2PO41.0， MgS04'7H20 0.2，酵母粉O.l，调节pH7.0。 121 。C灭菌15min后，以15% (v/v)接禾中量接入圆 红冬孢酵母AS 2.1389种子液，于30 °C通气培养120小时，按实施例1的方法后 处理，得到干菌体25g/L，菌体油脂含量30%。
实施例4:培养基组成(g/L): N-乙酰葡糖胺200， KH2P04 1.7， MgS04.7H20 0.4，酵母粉0.5，调节pH6.5。 121 。C灭菌15min后，以20% (v/v)接种量接入圆 红冬孢酵母AS 2.1389种子液，于30。C通气培养168小时，按实施例1的方法后 处理，得到干菌体45g/L，菌体油脂含量32%。
实施例5:培养基组成(g/L): N-乙酰葡糖胺70， KH2P041.2， MgS04'7H20 0.4，酵母粉0.5，调节pH6.5。 121 。C灭菌15min后，以20%(v/v)接种量接入圆 红冬孢酵母AS 2.1389种子液，于37 °C通气培养96小时，按实施例1的方法后 处理，得到干菌体9.1g/L，菌体油脂含量21%。
实施例6:培养基组成(g/L):葡糖胺70， KH2P041.2， MgS04.7H20 0.4， 酵母粉0.5，调节pH7.0。 121 。C灭菌15min后，以20% (v/v)接种量接入圆红冬 孢酵母AS 2.1389种子液，于37 °C通气培养108小时，按实施例1的方法后处理， 得到干菌体10.3 g/L，菌体油脂含量18%。实施例7:培养基组成(g/L): N-乙酰葡糖胺70， KH2PO41.0， MgS04.7H20 0.2，酵母粉O.l，调节pH5.5。 121 。C灭菌15min后，以10%(v/v)接种量接入解 脂亚罗酵母AS 2.1398种子液，于30 。C通气培养108小时，按实施例1的方法后 处理，得到干菌体10.2g/L，菌体油脂含量35%。
实施例8:培养基组成(g/L): N-乙酰葡糖胺70， KH2P041.5， MgS04'7H20 0.2，酵母粉O.l，调节pH6.5。 121 。C灭菌15min后，以10%(v/v)接种量接入弯 曲隐球酵母ATCC 20509种子液，于30 °C通气培养120小时，按实施例1的方 法后处理，得到干菌体13.5 g/L，菌体油脂含量52%。
实施例9:培养基组成(g/L): N-乙酰葡糖胺70， KH2PO40.7， MgS04'7H20 0.2，酵母粉1.0， CaCl2 0.04， FeS04'7H20 0.005 ， ZnS04.7H20 0.001 ， MnS04 0.0007， 调节pH6.5。 121 。C灭菌15min后，以10%&/力接禾中量接入弯曲隐球酵母ATCC 20509种子液，于30。C通气培养168小时，按实施例1的方法后处理，得到干菌 体24.5g/L，菌体油脂含量65%。
实施例10:培养基组成(g/L):葡糖胺100， KH2PO40.7， MgSO(7H2O0.2， 酵母粉0.5，调节pH7.5。 121 r灭菌15min后，以10%(v/v)接种量接入弯曲隐 球酵母ATCC 20509种子液，于30 °C通气培养120小时，按实施例1的方法后 处理，得到干菌体17.5 g/L，菌体油脂含量25%。
实施例ll:培养基组成(g/L): N-乙酰葡糖胺70， KH2PO40.7， MgS04.7H20 0.2，调节pH 6.5。 121 。C灭菌15 min后，以10% (v/v)接禾中量接入小红酵母AS 2.277 种子液，于30 °C通气培养72小时，按实施例1的方法后处理，得到干菌体8.0 g/L， 菌体油脂含量20%。
实施例12:培养基组成(g/L): N-乙酰葡糖胺70， KH2PO40.7， MgS04.7H20 0.2，酵母粉O.l,调节pH6.5。 121 。C灭菌15min后，以10% (v/v)接种量接入乳 糖红酵母AS 2.1514种子液，于30 。C通气培养96小时，按实施例1的方法后处 理，得到干菌体15.0g/L，菌体油脂含量32%。
实施例13:培养基组成(g/L): N-乙酰葡糖胺70， KH2PO40.7， MgS04'7H20 0.2，酵母粉O.l，调节pH7.5。 121 。C灭菌15min后，以10。/。(v/v)接种量接入皮 状丝孢酵母AS 2.571种子液，于30 °C通气培养120小时，按实施例1的方法后处理，得到干菌体14.8 g/L，菌体油脂含量40%。
实施例14:培养基组成(gl):葡糖胺70， KH2PO40.7， MgSO4.7H2O0.2， 酵母粉O.l，调节pH7.5。 121 。C灭菌15min后，以10%(v/v)接种量接入皮状丝 孢酵母AS 2.571种子液，于30 °C通气培养120小时，按实施例1的方法后处理， 得到干菌体B.5 g/L，菌体油脂含量33%。
实施例15:培养基组成(g/L): N画乙酰葡糖胺70， KH2PO40.7， MgS04'7H20 0.2，酵母粉O.l，调节pH6.5。 121 。C灭菌15min后，以10%(v/v)接种量接入橘 林油脂酵母CICC 1714种子液，于30 °C通气培养168小时，按实施例1的方法 后处理，得到干菌体12.3 g/L，菌体油脂含量28%。
实施例16:培养基组成(g/L): N-乙酰葡糖胺70， KH2PO40.7， MgS04'7H20 0.2，酵母粉O.l，调节pH7.5。 121 。C灭菌15min后，以10%(v/v)接种量接入发 酵性丝孢酵母CICC 1368种子液，于30 °C通气培养144小时，按实施例1的方 法后处理，得到干菌体17.6g/L，菌体油脂含量45%。
实施例17:培养基组成(g/L): N画乙酰葡禾唐胺70， KH2PO40.7， MgS04'7H20 0.2，酵母粉O.l，调节pH6.5。 12rC灭菌15min后，以10%(v/v)接禾中量接入健 强地霉CICC 1256种子液，于30 °C通气培养132小时，按实施例1的方法后处 理，得到干菌体15.8g/L，菌体油脂含量33%。
实施例18:培养基组成(g/L): N-乙酰葡糖胺70， KH2PO40.7， MgS04'7H20 0.2，酵母粉O.l，调节pH6.0。 12rC灭菌15min后，以10% (v/v)接禾中量接入深 黄被孢霉AS 3.3410种子液，于20 °C通气培养240小时，按实施例1的方法后处 理，得到干菌体18.0g/L，菌体油脂含量37%。
实施例19:培养基组成(g/L): N-乙酰葡糖胺20，葡糖胺50， KH2PO40.7， MgSO4.7H2O0.2，酵母粉1.0，蛋白胨0.1，调节pH7.0。 121。C灭菌15min后， 以10% (v/v)接种量接入弯曲隐球酵母ATCC 20509种子液，于30 。C通气培养120 小时，按实施例l的方法后处理，得到干菌体14.5 g/L，菌体油脂含量37%。
实施例20:培养基组成(g/L): N-乙酰葡糖胺45，葡糖胺25， KH2PO40.7， MgSO4.7H2O0.2，酵母粉1.0，蛋白胨O.l，调节pH7.0。 121 。C灭菌15min后， 以10% (v/v)接种量接入弯曲隐球酵母ATCC 20509种子液，于30 。C通气培养120
8小时，按实施例l的方法后处理，得到干菌体20.5g/L，菌体油脂含量43%。
实施例21:以壳多糖(购自Sigma，货号C9213)为原料，参照文献方法 (Pichyangkura Kudan S， Kuttiyawong K， Sukwattanasinitt M, Aiba S, Quantitative production of 2隱acetamido-2-deoxy-d隱glucose from crystalline chitin by bacterial chitinase, Carbohydrate Research, 2002， 337， 557-559)进行酶水解处理，调整N-乙 酰葡糖胺浓度为20g/L，添加酵母粉1.0g/L， pH6.5，于121 。C灭菌15 min后， 以10% (v/v)接种量接入弯曲隐球酵母ATCC 20509种子液，于30 °C通气培养36 小时，按实施例l的方法后处理，得到干菌体6.5g/L，菌体油脂含量50%。
实施例22:以蟹壳为原料，参照文献方法(Muzzarelli，R.A.A.Chitin in nature and technology, Pleum Press, New Yorb 1986)进行酸7jC解处理，得到7夂解液，调 整总还原糖浓度为50g/L，其中N-乙酰葡糖胺35g/L，葡糖胺10g/L，添加酵母 粉0.6g/L， KH2P04 0.3 g/L， MgSOWKOO.l g/L， pH6.5，于121 。C灭菌15 min 后，以10%(v/v)接种量接入弯曲隐球酵母ATCC 20509种子液，于30。C通气培 养48小时，按实施例1的方法后处理，得到干菌体8,2g/L,菌体油脂含量45%。
实施例23:以虾壳为原料，参照文献方法(李南，李继绗.D-氨基葡萄糖盐酸 盐的制备研究.中国药科大学学报，1997, 28(1), 56-58)进行酸7夂解处理，得到水 解液，调整总还原糖浓度为55 g/L，其中N-乙酰葡糖胺5g/L，葡糖胺48g/L，添 加酵母粉1.0g/L，KH2PO40.7g/L，MgSO4'7H2O0.2g/L，pH6.2， 121 。C灭菌15min 后，以10% (v/v)接种量接入圆红冬孢酵母AS 2.1389种子液，于30。C通气培养 60小时，按实施例l的方法后处理，得到干菌体93^L，菌体油脂含量38%。
每100 gN-乙酰葡糖胺和减葡糖胺可获得含油率为15 66%的产油酵母干菌 体12.0 g 45.0 g。与传统通过油料植物获取油脂的方法相比，本发明技术简单有 效，周期短，可连续操作，节约耕地；与生物转化其它淀粉质和纤维质糖源制备 油脂的方法相比，本发明使用的原料来源于含壳多糖的生物原料，如蟹壳、虾壳 或鱼鳞等，具有资源丰富、价格低廉的特点，并且发酵获取油脂工艺简便、方法 易行，成本低，是一种利用可再生资源、几乎不额外占用耕地、可连续生产的微 生物油脂制备新途径，同时也为水产养殖业废弃物高值化禾佣开辟了新的方向。
9
权利要求
1. 一种微生物油脂的制备方法，其特征在于其以N-乙酰葡糖胺和/或葡糖胺为原料进行微生物发酵培养，获得微生物油脂。
2. 按照权利要求1所述微生物油脂的制备方法，其特征在于是将N-乙酰葡糖胺和减葡糖胺制成总浓度为20 200 g/L的7jC溶液，灭菌处理，接入产油微 生物种子液，通空气培养后分离菌体，提取获得微生物油脂。
3. 按照权利要求2所述微生物油脂的制备方法，其特征在于具体过程如下，(1) 所述N-乙酰葡糖胺和/或葡糖胺水溶液pH5.5 7.5，其中还可含有0 3.0 g/L常规微生物生长所需营养成份；(2) 所述产油微生物的培养条件为:接种量v/v为2 20%,MH20eC 37°C， 培养时间为36小时 240小时；(3) 所述产油微生物培养终止后经固液分离收集菌体，菌体破碎，按常规方法 提取，得到微生物油脂。
4. 按照权禾腰求3所述微生物油脂的制备方法，其特征在于所述常规微生 物生长所需营养成份为酵母粉、蛋白胨、麦牙汁、磷酸钾、硫酸镁、硫酸锌、硫 酸锰、氯化f丐和/或硫酸亚铁。
5. 按照权禾腰求2所述微生物油脂的制备方法，其特征还在于所述N-乙 酰葡糖胺和/或葡糖胺水溶液可以是含壳多糖原料的7jC解液。
6. 按照权利要求5所述微生物油脂的制备方法，其特征还在于所述含壳多 糖原料的水溶液为蟹壳、虾壳和/或鱼鳞的酸水解液或者酶7拙牟液。
7. 按照权利要求1或2所述微生物油脂的制备方法，其特征还在于所用产油微生物为圆红冬孢酵母朋ot/o^onVZ/ww tora/oWes、弯曲隐球酵母 Co^tococcMS cwrraft^、角牟月旨亚罗酵母rarraWa/^0/yft'ca、乳糖红酵母7 /zc^otorw/a /actora、小红酵母朋ocfotorw/a附/wwto、橘林油月旨酵母丄zjw附ycas fo"o"ewfe ae、皮 状丝孢酵母7h'c/z，o訓c齒"eww、发酵性丝 包酵母7Hc/zospo謂，膨"tora、健 强地霉Geo/n'c/zw附ra6us似附禾口/或深黄l皮f包霉Aforfere〃a is"&〃/wa。
全文摘要
本发明涉及一种微生物油脂的制备方法，首先将N-乙酰葡糖胺和/或葡糖胺制成总浓度为20～200g/L的水溶液，添加0～3g/L其它营养成份，灭菌后接入产油微生物种子液，接种量v/v为2％～20％，于20～37℃通气培养36～240小时，停止发酵，离心收集菌体，破碎菌体，经有机溶剂提取获得微生物油脂。每100gN-乙酰葡糖胺和/或葡糖胺可获得含油率为15～66％的产油酵母干菌体12.0g～45.0g。本方法使用的原料具有来源丰富、价格低廉的特点，并且发酵获取油脂工艺简便、方法易行，是一种利用可再生资源、几乎不额外占用耕地、可连续生产的微生物油脂制备新途径。
文档编号C12P7/64GK101497902SQ200810010348
公开日2009年8月5日 申请日期2008年2月3日 优先权日2008年2月3日
发明者吴思国, 赵宗保 申请人:中国科学院大连化学物理研究所