专利名称：：一种s.角蛋白酶的诱导、制取及使用其整理羊毛的方法
技术领域：
：本发明属微生物驯化、酶的制取和羊毛整理方法的领域，特别是涉及一种s.角蛋白酶的诱导、制取及使用其整理羊毛的方法
背景技术：
羊毛及其织物可以通过整理改善其毡縮抗性，还可以提高和改善羊毛的光泽和白度、手感，减少对人体皮肤的刺痛感等。目前,羊毛的防毡縮大都采用氯化-树脂工艺,它能够有效提高羊毛的防毡縮性能及服用舒适性,是一种比较成熟的工艺，但值得注意的是它所产生的可吸附性卤化物AOX所具有的致癌性质、非生物降解性对环境危害非常大用氯化-树脂工艺处理lt羊毛就会产生350g的AOX。在全人类日益重视环境问题的今天，这种高污染的行业和工艺生存的空间越来越小，所以开发出一种绿色的防毡縮工艺势在必行。而酶作为蛋白质，可被天然降解；并且反应专一,副反应少,在理论上不产生污染,近年来在纺织工业上得到了广泛的应用,被认为是可能替代羊毛氯化防毡縮工艺的最具潜力的方法。但是，目前的此类研究或多或少的遇到了一些困难羊毛的鳞片层是羊毛织物产生毡縮的主要原因,其约占羊毛总量10%。羊毛的鳞片表层由类脂层和其下的蛋白层组成。类脂层有疏水作用，而其下的蛋白质层中胱氨酸含量较多，使其具有大量二硫交联和酰胺交联[12](参见NLRKingandJHBradbury.Aust丄Biol.ScL1968(21):375和CMCarr.IHLeaverandAEHughes.Test.Res丄.1986(56):457)。这使鳞片表层具有很强的耐化学性能，致使羊毛很难受到酶的直接作用[34](参见《纺织学报》2002.2:"蛋白酶对羊毛的作用机理研究"和JDLeeder.WoolSci.Rev.,1986(63):13)，所以直接用蛋白酶处理羊毛获得的防毡缩效果非常有限[5〗(参见MiddlbrookWR,PhillipsH."Theapplicationofenzymestotheproductionofshrinkage—resistantwoolandmixturefabrics"[J]丄S.D.C,1941,(57):137-144.)。有人认为，用蛋白酶处理羊毛进行改性，前处理(氧化或还原)是必须步骤，目前还未发现未经前处理即能对羊毛进行水解的蛋白酶[6](参见《江苏丝绸》2006.5:"蛋白酶在羊毛纤维改性方面的应用")。所以目前的酶对羊毛整理往往以化学前处理为前提，其主要通过氧化的方法(如H202)打破二硫键交联，使之形成吸电子磺酸基团。然后再使用生物酶处理之，以获得较好的抗毡縮性能。这样以来，使用生物酶的最初目的不仅未达到，与氯化-树脂法相比反而多了一个步骤，其工业生产的前景大打折扣。所以，此项研究成果具有一定的突破性意义。
发明内容本发明所要解决的技术问题是提供一种S.角蛋白酶的诱导、制取及使用其整理羊毛的方法，本方法可直接对羊毛直接进行处理，成本低，不污染环境。本发明的一种S.角蛋白酶的诱导、制取及使用其整理羊毛的方法，包括(1)S.角蛋白酶的制取以嗜麦芽糖寡养单胞菌(&e"o&印/wwo"a5'wa/topMZa)DHHJ为原始菌种(接种量3~5%)，使用羊毛l3g、0.2lg氯化钠、0.2lg磷酸氢二钠、0.01O.lg磷酸二氢钾、50200ml水，在pH二7.5，3050°C，恒温条件下培养2~4天作为一代，不断诱导、驯化。待获得高效、稳定菌种后，使用l3g鸡毛粉(或其他羽毛粉)、0.2lg氯化钠、0.2lg磷酸氢二钠、0.010.1g磷酸二氢钾、50200ml水，在pH二7.5，305(TC，恒温条件下培养24天，获得含酶培养液。该培养液经离心、盐析、静置、再离心、提纯后，制得S.角蛋白酶；(2)羊毛处理工艺将得到的S.角蛋白酶提纯、浓縮，在pH-7.8，2050°C，酶浓度为25%(owf)时对羊毛及其织物处理60120min，使用280nm紫外分光光度仪和显微镜进行检测，并对经过酶处理的羊毛纤维进行减量率、毡缩率、碱溶度、强度及白度的参数测定，证明宏观处理效果。步骤(1)所述的原始菌种是从腐烂的鸡毛中筛选的，具有降解羽毛角蛋白能力。步骤(1)优选的培养条件在pH二7.5，40°C，恒温培养3天。步骤(1)采用采用羊毛为诱导物进行驯化，并采用鸡毛为原料进行培养和制取。步骤(2)优选的处理条件为酶浓度3%(owf)，pH=7.8，40。C处理75min。步骤(2)测定的实验数据显示处理后羊毛的各项指标都优于未处理的羊毛，用于更为环保和高效的羊毛抗毡縮整理及仿羊绒制品的加工和生产中。采用鸡毛为原料筛选嗜麦芽糖寡养单胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)DHHJ的细菌菌株(发明名称一种产角蛋白酶的菌株及其应用，专利号2007101719394):将从市场收集的大量羽毛埋于室外较湿润的土壤中富集培养，直至羽毛有明显的降解，期间保持充足的水分。取上述腐烂鸡毛lg于富集培养基1(牛肉膏0.5g，蛋白胨lg，氯化钠0.5g，pH7.4—7.6，100mL)中，于28。C、120转/min恒温培养48h。再取其培养液2mL转入富集培养基2(可溶性淀粉2g，羽毛粉a2g，氯化钠0.5g,pH7.4—7.6，100mL)中，28°C，120r/min进一步富集培养48h。取终富集液100pL涂布于磷酸消解蛋白培养基(可溶性淀粉2g，磷酸消化蛋白2.5g，琼脂粉2g，氯化钠0.5g，pH7.4—7.6，100mL)平板，筛选出生长的单株菌，以牛肉膏蛋白胨培养基(完全培养基)作为对照。将初筛得到的菌种分别点接于磷酸消解蛋白培养基平板和羽毛粉平板培养基(可溶性淀粉2g，羽毛粉b2g，琼脂粉2g，氯化钠0.5g，pH7.4—7.6，100mL)平板，于33'C下恒温培养48h，对照观察两平板上的菌种生长，选定有效菌株。再将这些有效菌株涂布于磷酸消解蛋白培养基平板，重复几次做进一步的分离纯化。其中，羽毛粉的处理方法羽毛粉a用洗涤剂清洗鸡毛，清水洗净后，分别以0.05%氢氧化钠溶液和0.05%盐酸溶液煮沸30分钟，再以清水充分洗净，于8(TC烘干48h，用粉碎机将其分别粉碎后，过60目筛；羽毛粉b用洗涤剂清洗鸡毛，清水洗净后于灭菌锅内高压蒸煮lh，再以清水充分洗净，于80'C烘干48h，用粉碎机将其分别粉碎后，过IOO目筛。有益效果1、本发明制取的S.角蛋白酶可直接作用于羊毛，节省了化学试剂处理步骤，避免了污染环境；2、酶提取工艺采用鸡毛为主要原料，节约成本，高效可行，易于工业化推广；3、酶处理的羊毛的抗毡缩性、白度、机械强度均有提高；手感改善，对人体皮肤的刺激性下降，具有羊绒多方面的优点。图1为嗜麦芽糖寡养单胞菌产生的S.角蛋白酶对羊毛处理效果显微镜对比图(左图为未处理羊毛，右图为处理后的羊毛)；图2为嗜麦芽糖寡养单胞菌产生的S.角蛋白酶对羊毛处理效果显微镜对比图(左图为未处理羊毛，右图为处理后的羊毛)。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。实施例1以嗜麦芽糖寡养单胞菌(1^"o"o/7tomomwwa//o;/7///a)DHHJ为原始菌种，使用羊毛为诱导物，通过正交实验确定最佳培养条件，并对其诱导、驯化培养羊毛2g、氯化钠0.4g、磷酸氢二钠0.4g、磷酸二氢钾0.03g、水100ml，pH=7.5，40°C，恒温培养23天。经数次驯化后，得到高效、稳定的菌种，使用以下培养比例进行放大培养鸡毛2g、氯化钠0.4g、磷酸氢二钠0.4g、磷酸二氢钾0.03g、水100ml，pH=7.5，40°C，恒温培养72小时，得到含酶的培养液。实施例2将得到的得到含酶的培养液经离心、盐析、静置、再离心、提纯、浓缩后，对羊毛进行处理，使用280nm紫外分光光度仪和显微镜进行检测，得到最佳处理条件酶浓度3%(owf)，pH=7.8，40。C处理75min。测量减量率、毡縮率、碱溶度、强度、白度等参数值，证明其对羊毛的宏观处理效果。实施例3用S.角蛋白酶处理羊毛纤维后，分析减量率、毡縮率、碱溶度、强度及白度的变化。讨论S.角蛋白酶对羊毛的作用方式，对纤维损伤和织物强度的影响系数以及大规模应用的可行性探究。一、减量率测定织物减量率的测定将酶处理前后的试样在105T:烘箱中烘至恒重。<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>二、毡缩率测定毡縮率的测定皂片lg/L，浴比1:30，洗液温度3(TC，洗涤时间lh，烘干，待织物吸湿平衡后按下式计算毡縮率(％)=(l—洗后织物面积/洗前织物面积)xioo<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>三、碱溶度测定羊毛纤维的损伤采用碱溶度法测定-碱溶度(％)=(2.000X(1—G)W)/(2.000X(1—G))X100式中，G"含水率(％)，W—碱处理后残留试样重(g)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>强度测定织物强度测定在强力测试仪上按标准方法测定。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>五、白度测定白度的测定在智能式色度白度仪上按标准方法测定。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>从上述测定结果可以看出1、减量率与对照组相比明显，到一定程度呈现的稳定趋势表明酶对羊毛有其可处理部分且处理效果较好，通过酶的分解提高了溶液中水溶性蛋白质含量，才表现为减量率的增加。随时间增加减重率呈半n型曲线，与对照组相比是无酶促反应的50倍以上，有明显羊毛处理能力。2、与对照组相比，经过多次实验测试，酶处理后的羊毛毡縮率随反应时间延长而显著减少，平均减少6个百分点，有对实际处理的应用价值。3、由于羊毛本身拥有外层鳞片层而难溶于碱溶液，因此剥去表层鳞片层可提高羊毛的碱溶性，实验数据表明酶处理后的羊毛纤维更易溶于碱溶液，且溶解度随时间呈正相关，此数据同样说明羊毛已经过处理，达到了防毡縮、提高柔韧性的目的。4、通过拉伸试验测得的羊毛强度对比情况表明，羊毛有少许损伤，强度降低，但根据国内外专业文献记载的损伤程度，本实验羊毛的强度已达到优良水平，强度降低在优等范围内，且无明显损坏断裂现象。酶处理显示羊毛强度随处理时间呈半u型，其下降幅度极小。5、白度无明显下降，在可接受范围，且通常酶处理后会进行树脂漂白处理，对实验结论无任何影响。综上所述，S.角蛋白酶对羊毛有明显的处理能力，多项实验数据显示处理后羊毛的各项指标都优于未处理的羊毛，还可以提高和改善羊毛的光泽、柔韧感和手感，减少对人体皮肤的剌痛感，具有极大的应用前景，应将此技术尽快付诸于实际生产生活。权利要求1.一种S.角蛋白酶的诱导、制取及使用其整理羊毛的方法，包括(1)S.角蛋白酶的制取以嗜麦芽糖寡养单胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)DHHJ为原始菌种，接种量3～5％，使用羊毛1～3g、0.2～1g氯化钠、0.2～1g磷酸氢二钠、0.01～0.1g磷酸二氢钾、50～200ml水，在pH＝7.5，30～50℃，恒温条件下培养2～4天作为一代，不断诱导、驯化；待获得高效、稳定菌种后，使用1～3g鸡毛粉或其他羽毛粉、0.2～1g氯化钠、0.2～1g磷酸氢二钠、0.01～0.1g磷酸二氢钾、50～200ml水，在pH＝7.5，30～50℃，恒温条件下培养2～4天，获得含酶培养液；该培养液经离心、盐析、静置、再离心、提纯后，制得S.角蛋白酶；(2)羊毛处理工艺将得到的S.角蛋白酶提纯、浓缩，在pH＝7.8，20～50℃，酶浓度为2～5％(owf)时对羊毛及其织物处理60～120min，使用280nm紫外分光光度仪和显微镜进行检测，并对经过酶处理的羊毛纤维进行减量率、毡缩率、碱溶度、强度及白度的参数测定，证明宏观处理效果。2.根据权利要求1所述的S.角蛋白酶的诱导、制取及使用其整理羊毛的方法，其特征在于步骤(1)所述的原始菌种是从腐烂的鸡毛中筛选的，具有降解羽毛角蛋白能力。3.根据权利要求1所述的S.角蛋白酶的诱导、制取及使用其整理羊毛的方法，其特征在于步骤(1)所述的最优培养条件在pH二7.5，4(TC，恒温培养3天。4.根据权利要求1或3所述的S.角蛋白酶的诱导、制取及使用其整理羊毛的方法，其特征在于步骤(1)采用羊毛为诱导物进行驯化，并采用鸡毛为原料进行培养和制取。5.根据权利要求1所述的S.角蛋白酶的诱导、制取及使用其整理羊毛的方法，其特征在于步骤(2)所述的处理条件为酶浓度3。/。(owf)，pH=7.8，40。C处理75min。全文摘要本发明涉及一种S.角蛋白酶的诱导、制取及使用其整理羊毛的方法，包括(1)S.角蛋白酶的制取以嗜麦芽糖寡养单胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)DHHJ为原始菌种，使用羊毛1～3g、0.2～1g氯化钠、0.2～1g磷酸氢二钠、0.01～0.1g磷酸二氢钾、50～200ml水，在pH＝7.5，30～50℃，恒温条件下培养2～4天作为一代，不断诱导、驯化。待获得高效、稳定菌种后，使用1～3g鸡毛粉(或其他羽毛粉)、0.2～1g氯化钠、0.2～1g磷酸氢二钠、0.01～0.1g磷酸二氢钾、50～200ml水，在pH＝7.5，30～50℃，恒温条件下培养2～4天，获得含酶培养液。该培养液经离心、盐析、静置、再离心、提纯后，制得S.角蛋白酶；(2)羊毛处理工艺采用经提纯、浓缩后的S.角蛋白酶在pH＝7.8，20～50℃，酶浓度为2～5％(owf)时对羊毛及其织物处理60～120min。本发明可以直接作用于羊毛，免去了化学试剂处理，可用于更为环保和高效的进行羊毛抗毡缩整理；经酶处理的羊毛已具有羊绒的多方面特点，也可用于仿羊绒制品的加工和生产。文档编号C12R1/01GK101265470SQ200810037259公开日2008年9月17日申请日期2008年5月9日优先权日2008年5月9日发明者周美华,张兴群,曹张军,蔡少博,黄铮华申请人:东华大学