结核分枝杆菌粘附素hbha在结核病诊断与治疗中的应用的制作方法

专利名称：：结核分枝杆菌粘附素hbha在结核病诊断与治疗中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明总体涉及结结核病的诊断、预防和治疗，特别的，本发明涉及结核分枝杆菌粘附素HBHA在诊断、预防和治疗结核病中的应用。
背景技术：
：结核病是由结核分枝杆菌侵入体，引起的慢性传染病。人体除了毛发，牙齿和指曱以外，其他任何部位都可以发生结核病，发生在不同器官的结核病就被称为这一器官的结核病，如结核病发生在骨骼，称为骨结核；发生有肺部，称为肺结核。结核病起病较隐匿，病情进展緩慢，病程比较长，是一种慢性消耗性疾病。患病器官的功能因存在结核病变而严重破坏。因而对人类的健康和生命危害极大。结核病实验室诊断目前有细菌学，免疫学，以及分子生物学方法。目前用于临床免疫学检测的有以ESAT6、PT63、MPT64、CFP10等为基础的方法。在结核病治疗方面，目前结核分枝杆菌的耐药性已成为结核病治疗的难点，新的抗结核药物会给结核病治疗带来新希望。因此，本领域需要用于预防、治疗和检测结核病的改进的疫苗和方法。
发明内容细菌粘附素是细菌在其表面表达的一种物质，具有凝集素样特性，能够凝集红细胞，并与宿主细胞表面表达的互补的糖缀生物结合，参与介导-宿主细胞间的相互作用，促进细菌自体凝集。细菌通过粘附素粘附到哺乳动物宿主组织，在介导微生物致病性方面是一种重要的毒力因素。HBHA是结核分枝杆菌分泌的一种粘附素，它是由致病性结核分枝杆菌产生的一种糖蛋白，能通过其赖氨酸丰富的碳末端功能区域非吞噬细胞(如上皮细胞等)上含硫酸乙酰肝素的受体结合，从而介导肺结核和肺外播散性结核的发生。但目前仍未有关于分枝杆菌粘附素HBHA在于预防治疗、诊断结核病中的应用方面的研究。3本发明的发明人发现，HBHA是结核分枝杆菌的细胞表面蛋白，在结核患者的血清中存在抗HBHA的抗体，因此可以通过使用预先制备好的HBHA蛋白对血清中是否存在抗HBHA的抗体进行检测，如果结果为阳性，则说明血清中存在抗HBHA的抗体，进而该患者患有结核病。另外，还可以通过对患者注射HBHA,使患者体内产生抗HBHA的抗体，进而治疗结核病，或者达到预防的目的。本发明的发明人进一步发现，HBHA的上述功能是通过其抗原决定簇发挥的。因此，本发明提供了一种多肽，其包含结核杆菌粘附素HBHA的抗原决定簇，其中所述结核杆菌粘附素HBHA的抗原决定簇序列包含Arg-Thr-Asp-Thr-Arg-Ser-Arg-Val-Glu(SEQIDNO:4)。除非明确说明外，这里所使用的术语"多肽"包括任何长度的氨基酸链，其中的氨基酸残基由共价键肽键连接。这样，所述多肽包含HBHA蛋白的抗原决定簇氨基酸序列，还可以包含附加序列。本领域4支术人员可以理解，所述的附加序列可以来自于天然结合分枝杆菌抗原，因此所述附加序列也可以是免疫原性的。所述"免疫原性"是指在患者(包括人)和/或生物样品中激发免疫反应(例如，细胞免疫)的能力。例如，所述多肽可以是全长蛋白质的HBHA蛋白。本发明的发明人发现，对HBHA的抗原决定簇进行保守取代仍可达到本发明的目的。所述的保守取代，是指在多肽中的氨基酸被其他氨基酸所取代后，免疫原性并没有实质性的改变。例如下表中第3列同一行中的氨基酸可以相互替换<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>需要说明的是，本领域技术人员可以理解，对于氨基酸名称的缩写有两种方式，分别使用三个字母与一个字母，这两种缩写是——对应的。例如，丙氨酸可以縮写为"Ala",也可以缩写为"A"。如在生物化学，王镜岩/朱圣庚/徐长法2006-10第三版中所描述的。在本发明的一个实施例中，根据本发明实施例中所提供的实验方法进行验证，与本发明的多肽或核酸高度同源的多肽或者核酸也可以用于实现本发明的目的。根据本发明，"同源蛋白质"可以被理解为包括蛋白质，该蛋白质含有至少70%氨基酸序列相应于本发明的氨基酸序列，或者该蛋白质由前面所述的多聚核苷酸序列编码，优选至少80%，更优选至少90%，最优选95%，其中相应被理解为是指相应的氨基酸相同的或者互补的同源氨基酸。同源性，通常可以用已知的软件或者电脑程序来分析，例如BestFit或者Gap配对比对软件(GCGWisconsinPackage,GeneticsComputerGroup,575ScienceDrive,Madison,Wisconsin53711)。另一方面，本发明还提供了核酸分子，其包含编码所述HBHA的抗原决定簇的核苷酸序列，以及包含所述核酸分子的表达载体。所述核酸分子和表达载体可以用于转化或者转染宿主细胞。因此，本发明还提供了一种宿主细胞，其中所述被核酸分子和表达载体所转化。本发明还提供了一种治疗结核病的药物组合物，其中所述组合物包含一种或者多种多肽和生理学上可以接受的载体，所述多肽的氨基酸序列中包含HBHA的抗原决定簇。另一方面，本发明还提供了一种治疗结核病的药物组合物，其中所述组合物包含核酸分子和生理学上可以接受的载体，其中所述核酸分子包含编码所述HBHA的抗原决定簇的核香酸序列。另一方面，本发明还提供了一种疫苗，所述疫苗包含多肽，所述多肽的氨基酸序列中包含HBHA的抗原决定簇。另外，在本发明的一个实施例中，所述疫苗还可以含有免疫反应增强剂，所述免疫反应增强剂包括但不限于CpG寡核苷酸。在本发明中所使用的术语"抗原决定簇"是抗原分子表面的特定化学基因，其决定抗原的特异性。因此，抗原决定簇是免疫应答和免疫反应具有特异性的物质基础。另一方面，在一个实施例中，还可以将编码外源性抗原的基因直接导入人或动物体内，让其在宿主细胞中表达抗原蛋白，诱导机体产生免疫应答。抗原基因在一定时限内的持续表达，不断刺激机体免疫系统，达到免疫的目的。因此，本发明还提供了一种疫苗，所述疫苗包含一种或者多种核酸分子，其中所述核酸分子包含编码所述HBHA的抗原决定簇的核普酸序列。另外，本发明还提供了一种诊断试剂盒，其中所述试剂盒多肽，所述多肽的氨基酸序列中包含HBHA的抗原决定簇。另一方面，本发明还提供了一种抗体，是通过使用氨基酸序列中包含HBHA的抗原决定簇的所述多肽对哺乳动物进行免疫而产生的。所述哺乳动物通常是人，但也可以是动物，典型的宿主是可以被分支杆菌天然或人工感染的。宿主可以是哺乳动物，例如灵长类动物、牛、绵羊、猪、獾和啮齿类动物如大鼠和小鼠。根据本发明的实施例，本发明可以用于治疗、诊断和预防的结核病包括但不限于原发性肺结核、血行播散性肺结核、继发性肺结核、结核性胸膜炎以及其他肺外结核。其中原发性肺结核为原发结核感染所致的临床病症，包括原发综合征及胸内淋巴结结核。血行播散性肺结核包括急性血行播散性肺结核(急性粟粒型肺结核)及亚急性、慢性血行播散性肺结核。继发性肺结核包括浸润性、纤维空洞及干酪性肺炎等。结核性胸膜炎包括结核性干性胸膜炎、结核性渗出性胸膜炎、结核性脓胸。其他肺外结核核包括骨关节结核、结核性脑膜炎、肾结核、肠结核等。根据本发明的实施例，可以在本发明中使用的药物上可以接受的载体是指药物上可以接受的材料、组合物、媒介物例如液体或固体填充物、稀释剂、赋形剂或溶剂封装材料，其参与将对象化合物从身体的一个器官或身体部分携带或转送到其他身体的器官或身体部分。载体是"可以接受的，，的意思是与制剂的其他成分兼容，并适合用于患者。能够作为药物上可以接受的载体的材料的例子包括但不限于(l)糖，诸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，诸如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素及其衍生物，诸如羧曱基纤维素钠、乙基纤维素和纤维素醋酸酯；(4)西黄蓍胶粉；(5)麦芽；(6)明胶；(7)滑石；(8)赋形6剂，诸如椰子油和栓剂蜡；(9)油，诸如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10)二醇，诸如丙二醇；(ll)多羟基化合物，如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；(12)酯，诸如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)緩冲剂，诸如氢氧化镁和氢氧化铝;(15)褐藻酸；(16)无热源水；(17)等渗盐水；(18)林格氏溶液(Ringer'ssolution);(19)乙醇；(20)pH缓冲液；(21)聚酯、聚碳酸酯和/或聚酸酐；和(22)在药物制剂中采用的其他无毒性的兼容材料。本发明的药物组合物，可以通过以可注射组合物的形式施用，但是也可以配制成众所周知的药物递送系统(例如口服、直肠、胃肠外(静脉内、肌肉内或者皮下)、池内、阴道内、腹膜内、局部(粉末、软膏或者滴剂)、或者作为口腔喷雾剂或者鼻腔喷雾剂)。需要说明的是，本发明中所使用的术语"治疗，，不必然意味着完全治愈。对不期望症状或者疾病病理影响的任何緩解到任何程度，或者疾病进展速度的降低都可以被认为是治疗。而且，治疗可以包括使患者的整体健康感觉或者外形变差的行为。例如，对癌症患者进行化学疗法，其可能使患者感觉"病情更严重"，但仍被认为是治疗。在本发明中所使用的术语"预防"是指降低生物体感染或发展出与结核病相关的疾病或症状的可能性。在某些情况中，应当将另一种治疗药剂与至少一种这里所述的提取物联合给药。仅仅作为例子，如果接受其中一种这里所述提取物治疗的患者同时患有高血压，那么应当与初始治疗剂联合给药抗高血压剂。本发明的上述和/或附加的方面和优点从下面结合附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中图1表示SDS-PAGE检测分离纯化天然与重组的HBHA蛋白。图2表示Western-blot检测分离纯化的天然与重组的HBHA蛋白。图3以散点图的形式表示ELISA方法检测各实验组血清HBHA抗体在OD450的吸光^f直分布。图4表示免疫预防组病理学结果(HE染色，400X)。7图5表示免疫预防组病理切片抗酸染色结果(抗酸染色，400X)。图6表示免疫治疗组病理学结果(HE染色，400X)。图7表示免疫治疗组病理切片抗酸染色结果(抗酸染色，400X)。下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能解释为对本发明的限制。具体实施例方式实施例1HBHA抗原决定簇的研究HBHA的基因全长序列为atggctgaaaactcgaacattgatgacatcaaggctccgttgcttgccgcgcttggagcggccgacctggccttggccactgtcaacgagttgatcacgaacctgcgtgagcgtgcggaggagactcgtacggacacccgcagccgggtcgaggagagccgtgctcgcctgaccaagctgcaggaagatctgcccgagcagctcaccgagctgcgtgagaagttcaccgccgaggagctgcgtaaggccgccgagggctacctcgaggccgcgactagccggtacaacgagctggtcgagcgcggtgaggccgctctagagcggctgcgcagccagcagagcttcgaggaagtgtcggcgcgcgccgaaggctacgtggaccaggcggtggagttgacccaggaggcgttgggtacggtcgcatcgcagacccgcgcggtcggtgagcgtgccgccaagctggtcggcatcgagctgcctaagaaggctgctccggccaagaaggccgctccggccaagaaggccgctccggccaagaaggcggcggccaagaaggcgcccgcgaagaaggcggcggccaagaaggtcacccagaagtag(SEQIDNO:1)。其氨基酸序列为MAENSNIDDIKAPLLAALGAADLALATVNELITNLRERAEETRTDTRSRQIDNO:2)申请人确定HBHA抗原决定簇的氨基酸序列为Arg43-Thr-Asp-Thr-Arg-Ser匿Arg-Val-Glu51。根据固相化学合成法方法，申请人合成了多肽A，经测序，其氨基酸序列为Arg-Thr-Asp-Thr-Arg-Ser-Arg-Val-Glu(SEQIDNO:4)。实施例2结核分枝杆菌粘附素HBHA的制备及其在诊断结核病中的应用2.1天然HBHA蛋白的制备(1)BCG菌抹的培养将在固体培养基上培养至对数期的BCG菌抹研磨成均匀菌悬液，适量接种于苏通培养基中，37。C培养至稳定期。(2)天然HBHA蛋白的分离纯化及其Western-Blot鉴定BCG在2L改良苏通培养基中37。C培养至稳定期。13000g离心20min,弃上清，沉淀用含有0.05%Tween80的PBS(PBS/TW)洗涤一次，离心弃上清用100mLPBS/TW重悬沉淀，8(TC加热1h,13OOOg离心20min,弃上清，应用PBS/TW洗涤一次，沉淀重悬于25mL含有lmmol/LPMSF的PBS/TW中，混匀置于冰上间歇超声25min后，13000g离心20min,收集上清，沉淀进行重复的超声，离心和收集上清。将收集的上清进行34000g离心3小时，弃去沉淀，取上清500ml通过特异性吸附HBHA的CL-6B层析柱，用100mlPBS緩冲液洗柱，应用含0~500mmol/L的NaCL的PBS洗脱液进行梯度洗脱，流速为1.5ml/min，在洗脱过程中，在波长280nm下监测吸光度，找出最大吸收峰，利用原核表达的HBHA蛋白免疫小白鼠制备的HBHA多抗血清作为一抗，HRP标记羊抗鼠IgG作为二抗，进行WestBlot鉴定分离纯化的蛋白。结果见图(1,2)。2.2.重组HBHA蛋白的制备(1)PCR扩增目的基因、连接至T载体、阳性克隆的鉴定及序列分析采用煮沸15mim裂解BCG菌液，取上清进行PCR，引物的设计借助DNAStar软件，在hbhA基因两端设计一对PCR引物，由上海生工生物技术有限服务公司合成。上游5'AACGAATTCATGGCTGAAAACTCGAACATT3':下为BamHI酶切位点，下游引物酶切位点为HindIII酶切位点。PCR反应体系为10xBuffer5iu1,DNA模板lpl,5，和3，端引物(10nM)各2p1,TaqDNAPolymerase0.5ju1(5u/ul),MgS04(50mmol/L)2p1，dNTP(2.5mmol/L)4加无菌水至终体积50|ul。退火温度为55。C。采用胶回收试剂盒回收的目的DNA片段。连接到pMD18-T载体。采用菌落PCR法鉴定阳性克隆后，再进一步双酶切法(BamHI/HindlII)进行鉴定。鉴定正确的阳性克隆各取两个送宝生物工程有限公司进行测序。鉴定克隆序列的正确性。测序结果为TTTCAGCC(SEQIDNO:3)。(2)PET-32a(+)表达质粒的构建及阳性菌的小量诱导表达HBHA蛋白质粒提取试剂盒提取装入T载体的HBHA阳性质粒，酶切后连接到PET-32a(+)表达载体上，然后将经过鉴定的表达载体转染至BL21大肠杆菌中。挑取单个菌落接种于含有抗生素的LB培养基中(羧苄青霉素100ng/ml)，37。C培养过夜；次日，按l:50扩大培养，37。C培养至菌密度为A600=0.6时，加入IPTG至终浓度为lmmol/L，继续培养4h。然后进行全菌蛋白的SDS-PAGE电泳分析。并且通过8mol/L尿素裂解菌体后，应用Nisapharose4B特异性吸附柱进行分离纯化。洗脱纯化产物依次用尿素进行梯度透析(6mol/L,4mol/L,2mol/L，0mol/L)和蛋白的复性。结果见图(1,2)2.3.HBHA检测结核病血清抗体水平应用50ul包被液包被天然和重组HBHA蛋白，包被蛋白量0.1jug,以辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG抗体为二抗，对各实验组血清进行ELISA检测。结果见图3，表l。表1HBHA抗原检测结核分枝杆菌敏感性和特异性血清来源份数敏感性(％)特异性(。/。)天然HBHA重组HBHA天然H朋A重组HBHA肺结核病人4741(87.2'/。)39(83.0%)肺外结核病人4744(93.6%)43(91.5%PPD(+)健康者4746(97.9%)45(95.7%)PPD(-)健康者4745(95.7%)44(93.6W图3散点图中显示(1)天然与重组两种HBHA蛋白在各组血清样本抗体检测中的OD450值分布相近，经统计学检验(t爿.069，PX).05)差异没有显著性。(2)PPD阳性和PPD阴性健康对照组之间血清抗体水平差异同样不具有显著性(t=1.238，P〉0.05)。(3)肺结核组与肺外结核组的血清抗体OD值分布在散点图中显示差异明显，肺结核OD450值分布集中分布在0.30-0.40之间，肺外结核OD450值分布在0.350-0.45之间。经统计学检验(t42.224,PO.05)结差异具有显著性。(4)结核组(肺结核，肺外结核)与对照组(PPD阴性，PPD阳性)OD450值分布具有显著不同。散点图中很直观的显示对照组全部小于0.3，结核组OD值则集中分布于0.30-0.45之间。结核组与健康组之间(t=25.909,P<0.05)血清抗体水平具有显著性差异。实施例3结核分枝杆菌粘附素hbha在预防中的作用3.1实^r动物分组将实验动物随机分为以下5组CpG免疫预防组，HBHA免疫预防组，CpG+HBHA免疫预防组，BCG免疫预防组和对照组。3.2给药方法CpG免疫预防组腹腔注射每只小鼠CpG30jug，HBHA免疫预防组腹腔注射每只小鼠HBHA5jug，CpG+HBHA免疫预防组腹腔注射CpG30mg和HBHA5jug，给药后14天攻毒，BCG免疫预防组尾静脉注射BCG1~=2x105CFU。对照组在攻毒前注射100ul生理盐水。2周后加强免疫1次。3.3结核病小鼠模型的建立取在改良罗氏培养基上生长良好的结核分枝杆菌H37Rv2周的培养物，用玛瑙乳钵磨成10mg/3ml的均勻菌悬液，用生理盐水稀释成lmg/3ml的菌悬液，从小鼠尾静脉注射0.3ml(相当于湿菌O.lmg)，含菌量约为106CFU。ii3.4结核分枝杆菌培养与病理检查攻毒后4周脱颈处死小鼠，其中每组2只小鼠作病理检查，2只小鼠进行结核分枝杆菌培养。电子天平称取结核分枝杆菌培养组小鼠体重，立刻无菌解咅'1,称取肺脏和脾脏重量，将肺脏和脾脏在组织研磨器中磨成均匀的细胞悬液，用生理盐水按l:10、1:100、1:1000、1:10000、1:100000稀释的组织匀浆液100ul，接种于罗氏培养基斜面。每个稀释度做2个复管。先倾斜10度放置1小时，37。C培养，28天后观察结果。病理检查组小鼠处死后，取肺脏和脾脏放入10。/。中性曱醛中固定，经脱水、透明、浸蜡、包埋和切片，分别做HE和抗酸染色。3.5实验结果小鼠肺脾湿重，结果见表2表2免疫预防组攻毒4周后各研究组小鼠体重与肺脾重量(g)组別体重肺脾CpG20.430.380.67HBHA22.060.360.59CpG+H朋A18.850.310.63BCG预防组16.830.270.23空白对照20.100.320.52本研究每组选择2只小鼠，称体重，处死后称肺脾湿重，取2只小鼠的均值。结果显示，BCG预防组在小鼠体重和肺脾湿重方面明显^f氐于其它各对照组。菌落计数结果，本研究每组选择2只小鼠，处死后取全肺和全脾，磨成匀浆后，以10倍级数稀释接种于罗氏培养基，4周后观察结果，以2只鼠的均值计数菌落数。研究发现HBHA免疫预防组菌落数明显低于对照组，但明显高于BCG免疫预防组。见表3。病理检验结果，从图4可以看出空白对照组病理损害相当严重，见实变坏死及肉芽胂形成。BCG组虽有局部弥散小病变，肺组织结构基本正常，间质轻度充血，病理损害较轻。其它各组病理损害介于对照组和BCG免疫预防组之间。抗酸染色结果，从图5可以看出空白对照组病理切片有大量的抗酸杆菌存在，其它各组也可见少量抗酸杆菌。提示其它各组都有一定的预防效果。实施例4结核分枝杆菌粘附素HBHA在治疗中的作用124.1实验动物分组将实验动物随机分为以下4组CpG免疫治疗组，HBHA免疫治疗组，CpG+HBHA免疫治疗组和对照组。4.2给药方法攻毒后14天给CpG免疫治疗组腹腔注射每只小鼠CpG30jag,HBHA免疫治疗组腹腔注射每只小鼠HBHA5mg，CpG+HBHA免疫治疗组腹腔注射CpG30mg和hbha5ng，对照组在攻毒后14天注射100ul生理盐水。2周后加强免疫1次。4.3结核病小鼠模型的建立与实施例3相同。4.4结核分枝杆菌培养与病理检查与实施例3相同。4.5实验结果小鼠肺脾湿重，结果见表4表4免疫治疗组治疗4周后各研究组小鼠体重与肺脾重量(g)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>研究发现HBHA免疫治疗组菌落计数结果优于空白对照组，其他组间差异不显著病理检验结果和抗酸染色结果，从病理组织学图谱可以明显地看出，HBHA免疫治疗组的组织损害程度明显低于空白对照组，和CpG组相当。对于病理切片抗酸染色可见空白对照组细菌数明显多于其它各组。见图6，7。从图6病理组织学图错可以明显地看出，HBHA免疫治疗组的组织损害程度明显低于空白对照组，和CpG组相当。对于病理切片抗酸染色可见空白对照组细菌数明显多于其它各组。从图可以看出，对照组小鼠肺组织有大片肉芽肿形成，病理损害相当严重。其它各组也可见广泛的肺部病变弥散分布，但病变程度明显轻于对照组。从图7可以看出空白对照组病理切片中有大量的抗酸杆菌存在，其它各组也可见少量抗酸杆菌。提示其它各组都有一定的治疗效果。另外，申请人使用多肽A重复了上述病理实验，发现多肽A在诊断、治疗以及预防方面具有与结核分枝杆菌粘附素HBHA相当的作用。从研究结果不难看出结含有SEQIDNO:4序列的多肽，如结核分枝杆菌粘附素HBHA在结核病，尤其是肺外结核病的辅助诊断中具有很好的敏感性与特异性。并且在结核病的治疗、预防研究中动物实验结果也显示比较明显的治疗效果。尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型。14序列表<110〉北京市结核病胸部肿瘤研究所〈120〉结核分枝杆菌粘附素HBHA在结核病诊断与治疗中的应用<130〉PIDC080022<160〉4<170〉Patentln3.3版<210><211><212〉<213〉1600DNA结核分枝杆菌<400〉13tggCtg3犯actcgaacattgatgacatcaaggctccgttgcttgccgcgcttggagcg60gCCg3CCtggccttggccactgtcaacgsgttg3tC3Cg3acctgcgtgagcgtgcggag120gagactcgtacggacacccgC3gCCgggtCgaggagagccgtgctcgcctgaccaagctg180caggaagatctgCCCg3gC3gctcaccgagctgcgtgagaagttcaccgccgaggagctg240cgtaaggccgccgsgggctacctcgaggccgcgactagccggtacaacgagctggtcgag300cgcggtgsggCCgCtCt3g3gcggctgcgcagccagcagsgcttcgaggaagtgtcggcg360cgcgccg犯ggCt3Cgtggaccaggcggtggagttgaccc3gg3ggCgUgggtacggtc420gcatcgcagacccgcgcggtcggtgsgcgtgccgccaagctggtcggcatcgagctgcct480aag犯ggctgctccggccaagaaggccgctccggccaagaaggccgctccggcca柳ag540gcggcggcca3g犯ggCgCCcgcgaagaaggcggcggccsagaaggtcacccagaagtag600<210>2〈211>199<212>PRT<213>结核分枝杆菌〈400〉2MetAlaGluAsnSerAsnlieAspAsplieLysAlaProLeuLeuAla151015AlaLeuGlyAlaAlaAspLeuAlaLeuAla丁hrValAsnGluLeulie202530ThrAsnLeuArgGluArgAlaGluGluThrArgThrAspThrArgSer354045ArgValGluGluSerArgAlaArgLeuThrLysLeuGinGluAspLeu505560ProGluGinLeuThrGluLeuArgGluLysPheThrAlaGluGluLeu65707580ArgLysAlaAlaGluGlyTvrLeuGluAlaAlaThrSerArgTyrAsn85909^GluLeuValGluArgGlyGluAlaAlaLeuGluArgLeuArgSerGin100105110GinSerPheGluGluValSerAlaArgAlaGluGlyTyrValAspGin115120125AaValGluLeuThrGinGluAlaLeuGlyThrValAlaSerGinThr130135140ArgAlaVal.GlyGluArgAlaAlaLysLeuValGlylieGluLeuPro145150155160LysLysAlaAlaProAlaLysLysAlaAlaProAlaLysLysAlaAla165170175ProAlaLysLysAlaAlaAlaLysLysAlaProAlaLysLysAlaAla180185lbOAlaLvsLysValThrGinLys<210〉3<2U〉598<212〉DNA〈213>人工序列<400〉3ctacttctgggtgaccttcttggccgccgccttcttcgcgggcgccttcttggccgccgc60cttcttggccggagcggccttcUggccggagcggccttcUggccggagcagccttctt120aggcagctcgatgccgeccagcttggcggcacgctcaccgaccgcgcgggtctgcgatgc180g3ccgtacccaacgcctcctgggtcaactccaccgcctggtccacgtagccttcggcgcg240cgccgacacttcctcgaagctctgctggctgcgcsgccgctctageigcggcctcaccgcg300ctcgaccagctcgttgtaccggctagtcgcggcctcgaggtagccctcggcggccttacg360csgctcctcggcggtgaacttctcacgcagctcggtgagctgctcgggcagatcttcctg420cagct.t.ggtcaggcgagcacggctctcctcgacccggctgcgggtgtccgtacgagtctc480ctccgcacgctC3CgC3ggttCgtg3tC33ctcgttgacagtggccaaggccaggtcggc540cgctccaagcgCggC33gC3acggagccttg3tgtcatca3tgttCg3gttttcagcc598〈210>4〈211〉9〈212>PRT〈213〉人丁序列<400>4ArgThrAspThrArgSerArgValGlu1权利要求1.一种多肽，其包含结核杆菌粘附素HBHA抗原决定簇，其中所述结核杆菌粘附素HBHA抗原决定簇的序列包含SEQIDNO4所示的氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的多肽，其序列为SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。3.—种核酸，其包含编码根据权利要求1所述的多肽的核苷酸序列。4.根据权利要求3所述的核酸，其序列为SEQIDNO:l所示的核苷酸序列。5.—种表达载体，该载体包含根据权利要求3或4所述的核酸。6.—种治疗结核病的药物组合物，其中所述组合物包含权利要求1或2所述的多肽。7.—种疫苗，所述疫苗包含权利要求1或2所述的多肽。8.—种诊断试剂盒，其中所述试剂盒包含权利要求1或2所述的多肽。9.一种抗体，是通过使用权利要求1或2所述的多肽，或者权利要求3或4所述的核酸对哺乳动物进行免疫而产生的。10.—种基因疫苗，所述疫苗包含权利要求3或4所述的核酸。全文摘要本发明公开了一种多肽，其包含结核分枝杆菌肝素结合血凝素(heparin-bindinghaemagglutinin，HBHA)抗原决定簇，其中所述结核分枝杆菌粘附素HBHA抗原决定簇的序列包含Arg-Thr-Asp-Thr-Arg-Ser-Arg-Val-Glu；还公开了一种包含编码所述多肽的核苷酸序列的DNA分子，以及含有所述核酸分子的载体，使用载体转化的宿主细胞。另外，本发明还公开了用于诊断、治疗和预防结核病的药物组合物、疫苗和诊断试剂盒。另外，本发明还公开了使用所述多肽对哺乳动物进行免疫而产生的抗体。从研究结果不难看出结核分枝杆菌粘附素HBHA在结核病，尤其是肺外结核病的辅助诊断中具有很好的敏感性与特异性。并且在结核病的治疗、预防研究中动物实验结果也显示比较明显的治疗效果。文档编号C12N15/31GK101580542SQ20081009731公开日2009年11月18日申请日期2008年5月12日优先权日2008年5月12日发明者张旭霞,李传友申请人:北京市结核病胸部肿瘤研究所