专利名称：：海参胶原蛋白活性肽的制备方法和应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种海参加工技术，尤其是涉及一种海参胶原蛋白活性肽的制备方法和在制备美容功能食品、美容饮料或化妆品中的应用。
背景技术：
：水产动物胶原蛋白的丌发和应用已引起了广泛重视，从鱼皮、鱼鳞中制备胶原蛋白及其制品已申请了多项发明专利(CN1749296A;CN1629192A;CN1749275A;CN1814782A;CN1629191A;CN1560270A;CN1582771A;CN101061827A)。另外，中国发明专利CN1740199A和CN101003827A还公开了利用海星壳和鱿鱼皮制备胶原蛋白肽的方法。通过蛋白酶定向水解得到的胶原蛋白活性肽，具有特殊的生理功效，主要体现在免疫调节、抗氧化、降血压、降血脂、抑制肿瘤、促进皮肤代谢和胶原蛋白合成等方面。海参是重要的海洋食物和药物资源。全世界有1000多种海参，其中40多种可供食用。近年来，我国海参养殖业发展极快，海参年产量已超过6万吨。因此，亟待进一步开发海参的高值化加工技术。海参体壁含有结构独特的活性物质如海参胶原蛋白、海参多糖、海参皂苷等。药理实验证明，海参具有抗肿瘤、提高免疫功能、降血脂、抗凝血、抗动脉粥样硬化等多种生理活性。目前，国内外对海参活性成分的研究和开发主要集中在海参多糖和海参皂苷等方面。海参胶原蛋白含量占海参体壁粗蛋白的60%以上，有关海参胶原蛋白类型和理化性质的研究已有报道(CompBiochemPhysiol,1995,112A:463—478;FoodChemistryandToxicology,2002,67(4):1319-132:水产学报，2006,4:549—553),中国发明专利CN101215315A也公开了一种在低温下(0-25'C)利用胃蛋白酶促溶提取海参胶原蛋白的方法。与胶原蛋，相比，胶原蛋白肽具有更易吸收和高生理活性等特点。有关海参多肽的研究已有报道，目前已公开的发明专利有CN1858222A和CN101191139A。这些研究中所述的海参多肽是一种至少包括海参皂苷、蛋白多肽和胶原多肽等活性物质的混合物。有关海参胶原蛋白活性肽尚未见报道。
发明内容本发明的目的在于提供一种海参胶原蛋白活性肽的制备方法及其在制备美容功能食品、美容饮料或化妆品中的应用，以填补已有海参加工技术的上述不足。一种海参胶原蛋白活性肽的制备方法，其特征在于将海参去除内脏和内壁肌肉层，洗净，粉碎；在室温下，加入体积百分数为40-80%酒精水溶液浸提3-7d;离心，所得沉淀物用清水反复洗涤；加入0.05-0.3MNaOH水溶液浸泡10-48h;离心，所得沉淀物用清水反复洗涤至pH中性；向沉淀物中加入去离子水，在搅拌下，加入复合风味蛋白酶酶解2-6h,酶解温度为45-55。C，pH为7-8;然后，在90-IOO'C下灭酶4-10min;酶解液经过离心后，上清液采用超滤膜分离；收集分子量《6KDa的组分进行脱色，脱盐，真空浓縮，冷冻干燥，得到海参胶原蛋白活性肽粉末。上述的海参胶原蛋白活性肽在制备美容功能食品、美容饮料或化妆品中的应用。本发明的海参胶原蛋白活性肽制备方法的优点在于利用乙醇和强碱溶液处理海参，有效地去除了海参脂质和杂蛋白，制得的海参胶原蛋白活性肽纯度高；采用兼具内切酶和外切酶作用特点的复合风味蛋白酶酶解海参体壁，操作简单，制得的海参胶原蛋白活性肽中3-15肽为90-98%(重量百分数)，具有显著的抗氧化性，且可溶性好，吸收性高，无异味和苦味。另外，本发明还提供了一种可供综合提取海参生物活性物质的途径海参的酒精浸提液可用于制备海参皂苷；利用超滤膜得到的分子量大于6kDa的酶解液可用于制备海参多糖。同时，提取完生物活性物质后的海参也可用于制备海参胶原蛋白活性肽，可使海参得到充分的高值化加工利用。附图1为本发明制得的海参胶原蛋白活性肽分子量分布的HPLC图谱。附图2为光老化模型对照小鼠皮肤的组织学结构图。附图3为使用本发明制得的海参胶原蛋白活性肽的光老化模型小鼠皮肤的组织学结构图。具体实施例方式将lKg新鲜海参除去内脏和内壁肌肉层，并洗净泥沙，粉碎。在室温条件下，加入5L80M(体积百分数，下同)的酒精水溶液浸泡5d，浸泡期间每天换液l次，以除去包括海参皂苷在内的脂质成分。5000转/min离心30min，除去上清液，将所得沉淀物用清水反复洗涤。加入6倍体积的0.1MNaOH水溶液搅拌24h，以除去杂蛋白。5000转/min离心30min，除去上清液,将所得沉淀物用清水反复洗涤至pU中性。向沉淀物中加入20倍体积的去离子水，并预热至5(TC，在恒温搅拌下，加入10g复合风味蛋白酶酶解4h。然后，加热反应体系，在95°C下灭酶5min。将酶解液冷却至室温，8000转/min离心30min，收集上清液。将上清液通过截留分子量为6KDa的超滤膜超滤，收集分子量《6KDa的组分进行脱色、脱盐、真空浓縮、冷冻干燥，得到16.6g海参胶原蛋白活性肽粉末。经分析，本海参胶原蛋白活性肽的分子量为200-1700Da(见附图l)，氨基酸组成中疏水性氨基酸总量占总氨基酸量的56%。本实施例中，所述的新鲜海参可改为干海参、提取完生物活性物质后的海参，均能得到类似的效果。通过本发明制备的海参胶原蛋白活性肽得率为1-25%，分子量为200-1800Da，氨基酸组成中疏水性氨基酸含量为55-70%(重量百分数)。本发明中所述的80%的酒精水溶液浸泡5d可改用40-80%的酒精水溶液浸泡3-7d;所述加入6倍体积的0.1MNa0H水溶液搅拌24h,可改用加入5-40倍0.05-0.3MNa0H水溶液或0.05-0.3MK0H水溶液搅拌10-48h;所述向沉淀物中加入20倍体积的去离子水，可改为加入6-30倍体积的去离子水；所述的复合风味蛋白酶用量为海参重量的1-5%，酶解时间为2-6h，酶解温度均为45—50。C，pH为7.0_8.0，在90-10(TC下灭酶4-10rain;所述的离心速度为5000_10000转/min,离心时间为20-60min。本发明制得的海参胶原蛋白活性肽可作为美容活性成份，与其他辅料制成美容功能食品、美容饮料或化妆品。一.海参胶原蛋白活性肽的美容和护肤作用皮肤衰老是由内源性和外源性等多种因素引起的复杂过程。其中紫外线的作用是最主要和最突出的，称为光老化。紫外线辐照可在皮肤内产生多种自由基，自由基攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸引发脂质过氧化作用，并形成脂质过氧化物。脂质过氧化物使胶原蛋白多肽链间共价交联程度增加，透明质酸解聚，导致胶原蛋白溶解度降低，胶原蛋白含量减少，皮肤出现松弛、皱缩、粗糙、无光泽衰老现象。因此，减少自由基的生成能延缓皮肤衰老，起到美容护肤作用。黑色素在防御紫外线对皮肤损伤的过程中起了重要作用。但细胞中黑色素生成过度或大量累积，将引起皮肤出现雀斑、老年斑和其他色素沉着。黑色素的生成过程与自由基途径相偶联。因此，清除自由基可下调紫外线对黑色素生成的诱导作用，起到美白作用。1.海参胶原蛋白活性肽对光老化模型小鼠皮肤的保护作用将昆明小鼠颈背部脱毛处理后，随机分为4组，第1一2组分别为正常和模型对照组，给予生理盐水；第3-4组为本发明制得的海参胶原蛋白活性肽组，灌胃作为美容功能食品使用的海参胶原蛋白活性肽、淀粉和水的混合液(重量比为l:1:10)，其中含有的海参胶原蛋白活性肽的剂量分别为25和100mg/kg体重。1天灌胃1次，连续8周。同时，第2-4组小鼠照射紫外光(UVA+UVB)，每周隔R照射3次，共8周。UVA总剂量为ll.7J/cm2，UVB总剂量为156mJ/cm2。于末次灌胃或涂抹后24h，脱颈椎处死小鼠，取背部皮肤，制备皮肤匀浆。分别测定皮肤过氧化物歧化酶(S0D)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)活性及丙二醛(MDA)和羟脯氨酸含量。另取第2、4组小鼠背部皮肤0.5cm2,经过4%中性甲醛固定、冰冻切片、苏木精-伊红染色，显微镜下观察皮肤的组织结构。结果表明，本海参胶原蛋白活性肽能显著降低光老化小鼠皮肤MDA含量，提高抗氧化酶SOD、GSH-PX、CAT活性，提高羟脯氨酸含量(见表l)。皮肤组织学观察结果表明，模型对照组小鼠皮肤的表皮层增厚，并伴有角质化过度，真皮层因纤维发生变性或破坏，纤维排列紊乱，分布不均(见附图2)。使用本海参胶原蛋白活性肽能显著改善紫外线导致的小鼠皮肤结构的紊乱现象(见附图3)。以上结果说明本海参胶原蛋白活性肽具有显著的延缓皮肤衰老、促进真皮内胶原蛋白合成的作用，起到了美容和护肤效果。_表l海参胶原蛋白活性肽对光老化模型小鼠的保护作用_组另Uii^i55gsh-px羟脯氨酸mg/kgnmol/mg.prot.U/mg.prot,U/mg.protU/mg.prot.ug/mg.prot正常对照:=6.07±0.65252.02±37.2823.44±1.0211.38±0.7413.46±1.42模型对照—1U9士0.79加145.03士24.05胖9.10士1.00'"7.92±0.66*#10.38±0.75*海参胶原259.25±1.13166.10±36.40*11.06±1,3010.09±0.83**11.71±1.26蛋白活性1005.92±1.79**180.81±36.19**12.93土1.09"13.09±0.38**14.03±2.00*"尸<0.05，，<0.01与正常对照组比较；><0.05，，<0.01与模型对照组比较本实施例中，所述的灌胃作为美容功能食品使用的海参胶原蛋白活性肽、淀粉和水的混合液可改为作为美容饮料使用的海参胶原蛋白活性肽和水的混合液(重量比为l:10)，或者涂抹作为化妆品使用的海参胶原蛋白活性肽和水的混合液(重量比分别为l:10和1:5)，均能得到类似的效果。将上述的美容功能食品、美容饮料或化妆品应用到人体，也能得到类似效果。2.海参胶原蛋白活性肽抑制细胞黑色素合成的作用小鼠B16黑色素瘤细胞己成为定量评价黑色素合成的模型系统。取对数生长期的B16细胞，经0.25%(重量百分数)胰酶消化，以RPMI-1640完全培养基配成密度为5X105/mL细胞悬液，接种于细胞培养板，置于37°C、5%(体积百分数)c02的培养箱内培养。贴壁24h后，弃培养液，分别加入含不同浓度海参胶原蛋白活性肽的完全培养液，对照组加入等体积的完全培养基，继续培养48h。分别测定细胞内黑色素含量、酪氨酸酶活性和还原型谷胱甘肽含量。结果表明，不同浓度海参胶原蛋白活性肽均能显著降低B16细胞黑色素含量，抑制酪氨酸酶活性，提高还原型谷胱甘肽含量，且剂量-效应关系明显(见表2)。酪氨酸酶是调控黑色素合成的关键限速酶，还原型谷胱甘肽是生物体内重要的抗氧化剂，在抑制黑色素合成过程中起了重要作用，它主要通过巯基和酪氨酸酶的作用位点结合而抑制酪氨酸酶的活性。以上分析说明，海参胶原蛋白活性肽具有显著抑制细胞黑色素合成的作用。将本海参胶原蛋白活性肽制备成作为美容功能食品使用的海参胶原蛋白活性肽和淀粉混合物(重量比为l:1)、作为美容饮料使用的海参胶原蛋白活性肽和水的混合液(重量比为l:IO)或作为化妆品使用的海参胶原蛋白活性肽和水的混合液(重量比分别为1:5)应用于人体，均能得到类似效果。说明本海参胶原蛋白活性肽具有美白作用。表2海参胶原蛋白活性肽对B16细胞黑色素合成的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>*尸<0.05，**尸<0.01与对照组比较二.海参胶原蛋白活性肽的安全性实验ICR小鼠一次性灌服不同剂量的海参胶原蛋白活性肽水溶液(O.464、1.00、2.15、4.64g/kg体重)，14d后，各剂量组动物均无死亡，且无任何行为异常，体重无明显增长，血常规、肝、肾功各项检査无明显差别，动物脏器的病理组织学检査无异常，表明本海参胶原蛋白活性肽无毒副作用和无累积毒性。三.海参胶原蛋白活性肽的稳定性本发明制得的海参胶原蛋白活性肽在常温下保存6-8个月或在-20'C保存12-24个月，其生物活性无明显降低。权利要求1.一种海参胶原蛋白活性肽的制备方法，其特征在于将海参去除内脏和内壁肌肉层，洗净，粉碎；在室温下，加入体积百分数为40-80％酒精水溶液浸提3-7d；离心，所得沉淀物用清水反复洗涤；加入0.05-0.3MNaOH水溶液浸泡10-48h；离心，所得沉淀物用清水反复洗涤至pH中性；向沉淀物中加入去离子水，在搅拌下，加入复合风味蛋白酶酶解2-6h，酶解温度为45-55℃，pH为7-8；然后，在90-100℃下灭酶4-10min；酶解液经过离心后，上清液采用超滤膜分离；收集分子量≤6KDa的组分进行脱色，脱盐，真空浓缩，冷冻干燥，得到海参胶原蛋白活性肽粉末。2.按权利要求1所述海参胶原蛋白活性肽的制备方法，其特征在于所述的海参为鲜海参或干海参。3.按权利要求1所述海参胶原蛋白活性肽的制备方法，其特征在于所述海参胶原蛋白活性肽的分子量范围为200-1800Da。4.权利要求1所述的海参胶原蛋白活性肽在制备美容功能食品、美容饮料或化妆品中的应用。全文摘要一种海参胶原蛋白活性肽的制备方法，其特征在于将海参去除内脏和内壁肌肉层，洗净，粉碎；加入40-80％酒精水溶液浸提3-7d；离心，所得沉淀物用清水反复洗涤；加入0.05-0.3MNaOH水溶液浸泡10-48h；离心，所得沉淀物用清水反复洗涤至pH中性；向沉淀物中加入去离子水，在搅拌下，加入复合风味蛋白酶酶解2-6h，酶解温度为45-55℃，pH为7-8，然后灭酶；酶解液经过离心后，上清液采用超滤膜分离；收集分子量≤6KDa的组分进行脱色，脱盐，真空浓缩，冷冻干燥。本发明的工艺步骤简单，所述海参胶原蛋白活性肽具有强抗氧化活性，可用于制备美容功能食品、美容饮料或化妆品。文档编号A23L2/66GK101343653SQ200810139279公开日2009年1月14日申请日期2008年8月22日优先权日2008年8月22日发明者李兆杰,奕王,王玉明,王静凤,勇薛,薛长湖申请人:中国海洋大学