专利名称：荧光光素酶氧化还原酶体外发光体系的建立的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种荧光光素酶FMN-NADH氧化还原酶体外发光条件的确定，特别是涉及一种存在于海洋发光细菌胞内荧光光素酶和FMN-NADH氧化还原酶在细胞外的发光表达。
背景技术：
据本发明人通过査阅资料、文献检索所知，发光细菌是指在正常的生理条件下，在细菌生长过程中伴随有可见荧光发射的一类细菌，这种可见荧光波长在450-490nm之间，在黑暗处肉眼可见。
发光细菌的发光机理的研究表明，不同种类的发光细菌的发光机理是相同的，属酶促氧化反应。是由分子氧作用，胞内荧光酶(LE)催化，将还原态的黄素单核苷酸(FMNH2)及八碳以上的长链脂肪醛(RCHO)氧化为FMN及长链脂肪酸，同时释放出最大发光强度在波长为450 490nm的蓝绿光。
荧光光素酶和FMN-NADH氧化还原酶共同存在下的酶促氧化反应的原理如下
FMN:NADH氧化还原酶对FMN有特异性，在NADH存在的条件下，将FMN还原为FMNH2，为发光酶促反应提供底物。荧光光素酶催化FMNH2和RCHO发生氧化还原反应，同时发出蓝绿色荧光。目前国内尚未有荧光光素酶FMN-NADH氧化还原酶体外发光体系的建立。
发明内容
本发明的目的是建立一种荧光光素酶FMN-NADH氧化还原酶体外发光的体系，实现荧光光素酶在活体细胞外的表达，并实现其催化发光的酶活性。
本发明通过提取发光细菌胞内荧光光素酶和FMN-NADH氧化还原酶粗酶制剂，通过优化各种底物对酶促反应的影响，建立最佳的荧光光素酶FMN-NADH氧化还原酶体外发光体系。其特征是
(1) 最佳底物配比十二烷醛100nL (27mM)、 FMN-Na53nL (10mM)和NADH 200nL (0.14mM)，体系pH7.0。
(2) 发光检测在微弱发光仪中进行，检测条件是设置波长474nm， lmL酶液中，快速加入各底物，立刻进行定时跟踪测定，连续测定间隔时间为ls。
本发明实现了荧光光素酶FMN-NADH氧化还原酶在活体细胞外的表达，构建了荧光光素酶FMN-NADH氧化还原酶体外发光体系。该体系发光性能稳定，发光强度高，底物配比简便可行，并可实
现定量检测。
附图荧光光素酶单酶体外发光体系和荧光光素酶FMN-NADH氧化还原酶双酶体外发光体系发光性
能的比较。
具体实施方式
实施例1
将性状良好的发光细菌种子液按接种量5%接种到300mL富集液体培养基中，25°C 150r/min条件卩恒温培养。收集细胞悬浮液20mL， 4。C低温离心(5000rpm， 5min)，弃上清，加入一定量PBS (5mL)，磁力振荡器混匀，冰上超声破碎，每个样本超声时间15秒，间隔30秒，粉碎15次，功率300W。提取获得荧光光素酶粗酶液。
实施例2
lmL粗酶液中， 一次性快速加入底物12烷醛100nL (27mM)、 FMN-Na53pL (10mM)、 NADH 100nL(0.14mM)，进行发光检测。
3发光检测在微弱发光仪中进行，检测条件是设置波长474nm，加入溶液或试剂后，立刻进行定时跟踪测定，连续测定间隔时间为ls。当胞内提取的荧光光素酶和FMN-NADH氧化还原酶粗酶制剂加入酶反应底物时，荧光光素酶催化底物发光。
实施例3
各取lmL粗酶液，分别对荧光光素酶单酶体外发光体系和荧光光素酶FMN-NADH氧化还原酶双酶体外发光体系的发光性能进行比较。
(1) 荧光光素酶单酶体外发光体系
lmL粗酶液中，分别加入不同浓度的底物十二垸醛100nL(27mM)、FMN-Na53nL(10mM)和Na2S204100nL (34mM)，体系pH 7.0。发光检测在微弱发光仪中进行，检测条件是设置波长474nm，迅速加入各反应底物，立刻定时跟踪测定，连续测定间隔时间为ls。
(2) 荧光光素酶FMN-NADH氧化还原酶双酶体外发光体系,见实施例2
比较单、双酶的发光强度和稳定性，结果如图所示，荧光光素酶FMN-NADH氧化还原酶双酶体系比荧光光素酶单酶体系发光更稳定，高强度发光可持续的时间较长，发光减弱的程度要缓。且重复行好，更易操作。
权利要求
1 一种荧光光素酶FMN-NADH氧化还原酶体外发光体系的建立，其特征是(1)荧光光素酶和FMN-NADH氧化还原酶采用发光细菌胞内提取的粗酶液(2)采用的最佳底物为十二烷醛、FMN-Na和NADH(3)体系pH7. 0
2.本发明中利用超声破碎的方法提取荧光光素酶粗酶液。
3. 使用与权利要求1中类似性质的酶促发光底物
全文摘要
本发明涉及一种荧光光素酶FMN-NADH氧化还原酶体外发光条件的确定，特别是涉及一种存在于海洋发光细菌胞内荧光光素酶FMN-NADH氧化还原酶在细胞外的发光表达。本发明的目的是建立一种荧光光素酶FMN-NADH氧化还原酶体外发光的体系，实现荧光光素酶FMN-NADH氧化还原酶在活体细胞外的表达，并实现其催化发光的酶活性。本发明通过提取发光细菌胞内荧光光素酶和FMN-NADH氧化还原酶粗酶制剂，通过优化各种底物对酶促反应的影响，建立最佳的荧光光素酶体外发光体系。该体系发光性能稳定，发光强度高，底物配比简便可行，并可实现定量检测。
文档编号C12Q1/26GK101497918SQ20081014009
公开日2009年8月5日 申请日期2008年9月22日 优先权日2008年9月22日
发明者朱兰兰, 洪 林, 王静雪 申请人:中国海洋大学