一种基因组dna的提取方法

专利名称：一种基因组dna的提取方法
技术领域：
本发明涉及分子遗传学和分子生物学，特别涉及DNA分离提取和纯化方法。
背景技术：
分子生物学在近几十年的发展非常迅猛，对基因的研究己经遍及医学、 农业、环境保护及生物各学科领域。基因组DNA的提取是分子生物学最常用 的实验技术之一，在上述各领域中都有使用。20世纪后期，提取基因组DNA 常用的方法是细胞破膜后利用有机溶剂(苯酚、氯仿、异戊醇等)使蛋白质 变性达到与DNA分离的目的。这些有机溶剂对人体皮肤、呼吸道粘膜、眼睛 等有较大的伤害，而且试剂残留对环境污染较大；后来又出现了利用DNA吸 附材料来达到蛋白质与DNA分离的目的，这种方法解决了毒性和污染问题， 但这种材料成本相对较高，操作比较繁琐，针对的生物样品局限性较大。

发明内容
为了克服上述问题，本发明提供了一种提取并纯化基因组DNA的方法， 该方法可以针对绝大多数生物样品，操作简单、经济、无毒无污染，高质高 效。
本发明的提取基因组DNA的方法包括步骤(l)裂解样本细胞按300ul 人全血样本或10~40mg动植物组织样本计算，在样本中加入300ul细胞裂解 液(5 50 mmol/L Tris.Cl(pH8.0)， 0.2 20mmol/L EDTA (pH8.0)， 0.1 10%SDS)，裂解样本细胞，用移液器来回吹打混匀；(2) RNase消化加入 4 10mg/ml的RNase溶液并混匀，37。C消化15 60分钟；(3)蛋白沉淀 将样品放置冰上使其快速冷却，向冷却后的样品中加入ioow蛋白沉淀液(1 10mol/L(NH4)2SO4或1 1Omol/LNH4Ac)，震荡充分混匀，13， OOOrpm离心 2分钟；(4) DNA沉淀将离心后的上清液转移到100%异丙醇中，来回颠 倒充分混合，13， 000rpm离心2分钟，倒去上清，将离心管倒置于滤纸上除 去残液，然后加入0.5 lml70X乙醇，并来回颠倒离心管十数次，洗涤DNA 沉淀，13， 000rpm离心1分钟，倒去上清液，将离心管倒置于滤纸上空气干 燥10分钟或者真空抽干3 5分钟；(5) DNA的溶解加入50 100pl TE或者灭菌双蒸水，敲打混匀，65"C水浴15分钟或37。C溶解过夜。产物置于4°C 保存，如需要长时间保存，也可置于-20'C或-8(TC下。
本发明的提取样本对象可以是全血、骨髓、培养细胞、动物组织、植物 组织、革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌以及酵母菌。但针对不同的样本，裂解 处理的步骤有所不同。
对于培养细胞，收集l 3X10e个细胞后加入30(Hd细胞裂解液，用移液 器来回吹打混匀。
对于人类及动物组织标本，先用研磨，剪碎等方法处理样本，每10 20mg 组织中加入300^il细胞裂解液，用移液器来回吹打混匀。人类及动物组织标本 中因蛋白含量非常高，需在细胞裂解液消化后加入1 5^1蛋白酶K溶液 (5~40pg^l) 55t:消化过夜，直到无肉眼可见的组织团块。
对于血液和骨髓标本，每30(^1样品中需先加入900^1红细胞裂解液(10 50Ommol/LNH4Cl, 0.1 1Ommol/LEDTA， l~100mmol/L KHC03)，室温放置 5分钟，并不时来回颠倒混匀，直至溶液变得清亮。此步目的是裂解红细胞， 外周血和骨髓中的红细胞是无细胞核结构，细胞中不含有基因组DNA，所以 需要和白细胞分离去除。将裂解后的溶液13， OOOrpm离心l分钟，离心管底 可见白色的白细胞沉淀，红细胞已裂解并分散到上清液中。小心去除上清， 最后保留约20 30pl的上清液，并用其将白细胞沉淀重悬。往重悬的白细胞 中加入30(Hil细胞裂解液，用移液器来回吹打混匀。
对于植物组织样本，先在液氮中用研磨棒将样本磨碎。每20 40mg样品 中加入30(Hd细胞裂解液，来回颠倒混匀后，置于65t:消化60分钟。
对于革兰氏阴性细菌，先用1.5ml离心管收集lml左右细菌悬液(约0.5 2X1()9个细胞)，13， OOOrpm离心15秒收集菌体。加入300^1细胞裂解液， 用移液器来回吹打混匀后，置于8(TC消化5分钟。
对于革兰氏阳性细菌及酵母菌，用1.5ml离心管收集lml左右细菌悬液(约 1 3X1()8个细胞)，13， 000 rpm离心15秒收集菌体。加入30(HU细胞悬浮 液(0.1 1Ommol/L Nacl， 0.2 50mmol/L Tris.Cl(pH8.0)， 0.1 20mmol/L EDTA (pH8.0)),用移液器来回吹打混匀。加入1^1溶菌酶(20mg/ml)置于37°C 消化30钟。由于革兰氏阳性细菌和酵母菌细胞壁非常坚实，加入溶菌酶消化 有利于细胞壁的裂解。消化产物于13， OOOrpm离心1分钟收集沉淀。向沉淀 中加入300W细胞裂解液，用移液器来回吹打混匀后，置于80。C消化5分钟。
本方法中，用阴离子去构剂SDS裂解细胞，同时SDS还可以抑制细胞中或环境里的DNase的活性，提供DNA稳定的环境。RNA可以用RNA酶消化
除去。去除蛋白质时，使用高浓度的(NH4)2S04溶液代替了传统的有机溶液。
最后，基因组DNA用乙醇沉淀回收并溶解在含有DNA稳定剂的缓冲液中。 与现有技术相比，本方法能够快速得到高纯度高质量的基因组DNA，整个过 程可快至30分钟，得到的DNA片段约为50 500Kb，可用于Southern, PCR， RFLP， DNA文库构建等各种分子生物学实验。并且，本方法操作简单、无需 复杂设备、花费低廉，更重要的是清洁无毒，对使用者和环境均无害。
具体实施例方式
以下用具体实施方式
对本发明进行具体阐述，下列所有实施例中所述的 操作步骤皆为以在1.5ml离心管中操作为例。如需大规模提取，按比例放大试 剂与样品量即可。
所用的缓冲液和试剂
细胞裂解液5 50mmol/LTris.Cl(pH8.0)， 0.2 20mmol/LEDTA(pH8.0)， 0,1 腦SDS;
红细胞裂解液10 500mmol/L NH4Cl， 0.1 10mmol/L EDTA ， l~100mmol/LKHCO3;
细胞悬浮液0.1 10mmol/LNacl， 0.2 50mmol/LTris.Cl(pH8.0)， 0.1 20mmol/LEDTA(pH8.0);
蛋白沉淀液1 1 Omol/L (NH4)2S04或1 1 Omol/L NH4Ac;
蛋白酶K溶液(5~40|ig4il);
RNase (4 10mg/ml);
溶菌酶(20mg/ml);
异丙醇(100%);
乙醇(70%)。
实施例l:培养细胞基因组DNA的提取
1) 收集3X1()S个培养细胞，加入300^il细胞裂解液，用移液器来回吹 打混匀；
2) 加入1.0^1 8 mg/ml的RNase溶液并混匀；
3) 37'C消化30分钟；
4) 将样品放置冰上l分钟，使其快速冷却；
5) 向冷却的样品中加入10(^1蛋白沉淀液，震荡充分混匀；
6) 13， 000rpm离心2分钟；7) 准备一个新的1.5ml离心管，加入400^1 100%异丙醇；
8) 用移液器小心将离心后的上清液转移到异丙醇中并来回颠倒充分 混合；
9) 13, 000rpm离心2分钟。此时管底可见白色团块；
10) 倒去上清，将离心管倒置于滤纸上吸去残液，然后加入50(^1 70% 乙醇，并来回颠倒离心管十数次，洗涤DNA沉淀；
11) 13， OOOrpm离心1分钟，小心倒去上清液，将离心管倒置于滤纸上， 空气干燥10分钟；
12) 加入100WTE，用移液器吹打混匀；
13) 65'C水浴15分钟溶解DNA;
14) 将DNA样品保存于-20'C保存。
用该方法可从l-3Xl(^个培养细胞中提取10 30吗的基因组DNA。 实施例2:人外周血基因组DNA的提取
1) 往300ixl抗凝的人外周血样品中加入900^il红细胞裂解液，室温放 置5分钟，并不时来回颠倒混匀，直至溶液变得清亮；
2) 将清亮后的溶液13, OOOrpm离心1分钟，离心管底可见白色沉淀; 用200|_d移液器小心吸去上清并废弃，最后保留约20 30pl的上清 液，并用其将沉淀重悬；
3) 往重悬的白细胞中加入300^1细胞裂解液，用移液器来回吹打混匀；
4) 其余步骤同实施例1中步骤2) ~步骤14)。 用该方法可从300^1全血中提取5 15吗的基因组DNA。
实施例3:人类组织标本基因组DNA的提取
1) 取人类组织标本，先用研磨，剪碎等方法处理样本；
2) 每10 20mg组织中加入300jxl细胞裂解液，用移液器来回吹打混匀;
3) 在细胞裂解液消化后加入1 5^1蛋白酶K溶液，55'C消化过夜， 直到无肉眼可见的组织团块；
4) 其余步骤同实施例1中步骤2) ~步骤14)。 用该方法可从10~20mg组织中提取10 30pg的基因组DNA。
实施例4:植物组织样本基因组DNA的提取1) 对于植物组织样本，先在液氮中用研磨将样本磨碎；
2) 每20 40mg样品中加入30(^1细胞裂解液，来回颠倒混匀后，置 于65"C消化60分钟
3) 其余步骤同实施例1中步骤2) ~步骤14)。 用该方法可从20 40mg植物组织中提取5 20pg的基因组DNA。
实施例5:革兰氏阴性菌基因组DNA的提取
1) 先用1.5ml离心管收集lml左右革兰氏阴性菌悬液(约0.5 2X109 个细胞)，13， OOOrpm离心15秒收集菌体；
2) 加入30(Hd细胞裂解液，用移液器来回吹打混匀后，置于8(TC消化 5分钟；
3) 其余步骤同实施例1中步骤2) ~步骤14)。 用该办法可从lml革兰氏阴性菌悬液中提取20吗的基因组DNA。
实施例6:革兰氏阳性菌基因组DNA的提取
1) 用1.5ml离心管收集lml左右细菌悬液(约1 3X1()S个细胞)，13， 000 rpm离心15秒收集菌体；
2) 加入300^1细胞悬浮液，用移液器来回吹打混匀；
3) 加入1^1溶菌酶置于37X:消化30钟。由于革兰氏阳性细菌及酵母 菌细胞壁非常坚实，加入溶菌酶消化有利于细胞壁的裂解；
4) 消化产物于13， OOOrpm离心l分钟，收集沉淀；
5) 向沉淀中加入300^1细胞裂解液，用移液器来回吹打混匀后，置于 8(TC消化5分钟；
6) 其余步骤同实施例1中步骤2) ~步骤14)。 用该办法可从lml革兰氏阳性菌悬液中提取6~12吗的基因组DNA。
权利要求
1. 一种基因组DNA的提取方法，其特征在于包括步骤(1)裂解样本细胞在样本中加入细胞裂解液，用移液器来回吹打混匀；所述细胞裂解液成分为5～50mmol/L Tris.Cl(pH8.0)，0.2～20mmol/L EDTA(pH8.0)，0.1～10％SDS；(2)RNase消化加入4～10mg/mL的RNase溶液并混匀，37℃消化15～60分钟；(3)蛋白沉淀将样品快速冷却，加入蛋白沉淀液，充分混匀，13,000rpm离心2分钟；所述蛋白沉淀液成分为1～10mol/L(NH4)2SO4或1～10mol/LNH4Ac；(4)DNA沉淀将离心后的上清液转移到100％异丙醇中，来回颠倒充分混合，13,000rpm离心2分钟，倒去上清，将离心管倒置于滤纸上除去残液，然后加入70％乙醇，并来回颠倒离心管十数次，洗涤DNA沉淀，13，000rpm离心1分钟，倒去上清液，将离心管倒置于滤纸上空气干燥10分钟或者真空抽干3～5分钟。
2. 如权利要求1所述的基因组DNA的提取方法，其特征在于所述样本为 培养细胞；所述裂解液的加入量为每1~3乂106个培养细胞中加入30(^1 细胞裂解液。
3. 如权利要求1所述的基因组DNA的提取方法，其特征在于所述样本为 人类及动物组织；所述裂解步骤(l)为先研磨、剪碎样本，每10~20mg 组织中加入300^1细胞裂解液，用移液器来回吹打混匀；细胞裂解液消化 后再加入l 5pl蛋白酶K溶液，55'C消化过夜。
4. 如权利要求1所述的基因组DNA的提取方法，其特征在于所述样本为 血液或骨髓；所述裂解步骤(l)为按每300(^1样品加入90(Hd红细胞裂解 液室温放置5分钟，并不时来回颠倒混匀，直至溶液变得清亮，所述红 细胞裂解液组成为10 500mmol/L NH4Cl， 0.1 10mmol/L EDTA， l~100mmol/LKHCO3;将裂解后的溶液13， OOOrpm离心1分钟，去除上 清，保留白细胞沉淀，向白细胞沉淀中加入30(Hd细胞裂解液，用移液器 来回吹打混匀。
5. 如权利要求1所述的基因组DNA的提取方法，其特征在于所述样本为植物组织；所述裂解步骤(l)为先在液氮中用研磨棒将样本磨碎，按每 20 40mg样品加入30(^1细胞裂解液，来回颠倒混匀后，置于65'C消化 60分钟。
6. 如权利要求1所述的基因组DNA的提取方法，其特征在于所述样本为 革兰氏阴性细菌；所述裂解步骤(l)为按0.5 2乂109个菌体细胞加入 300)!l细胞裂解液，用移液器来回吹打混匀后，置于8(TC消化5分钟。
7. 如权利要求1所述的基因组DNA的提取方法，其特征在于所述样本为 革兰氏阳性细菌或酵母菌；所述裂解步骤(l)为按每1 3乂108个菌体细 胞加入30(HU细胞悬浮液，所述细胞悬浮液成分为0.1 10mmol/LNad， 0.2 50mmol/LTris.Cl(pH8.0)， 0.1 20mmol/L EDTA (pH8.0);用移液器 来回吹打混匀后加入1^1浓度为20mg/ml的溶菌酶，置于37'C消化30 钟；消化产物于13， OOOrpm离心1分钟，收集沉淀；向沉淀中加入300(al 细胞裂解液，用移液器来回吹打混匀后，置于8(TC消化5分钟。
全文摘要
本发明公开了一种基因组DNA的提取方法，在样本中加入细胞裂解液(5～50mmol/L Tris.Cl(pH8.0)，0.2～20mmol/L EDTA(pH8.0)，0.1～10％SDS)，裂解样本细胞；RNase消化；(3)将样品冷却，加入蛋白沉淀液(1～10mol/L(NH4)₂SO₄或1～10mol/L NH₄Ac)，离心沉淀去除蛋白；将离心后的上清液转移到100％异丙醇中，离心沉淀DNA。与现有技术相比，本方法能够快速得到高纯度高质量的基因组DNA，整个过程可快至30分钟，得到的DNA片段约为50～500Kb。并且，本方法操作简单、无需复杂设备、花费低廉，清洁无毒，对使用者和环境均无害。
文档编号C12P19/00GK101413018SQ20081014385
公开日2009年4月22日 申请日期2008年12月9日 优先权日2008年12月9日
发明者钢 周, 敏 朱, 胡维新 申请人:中南大学