专利名称：具有甲酰基-thf-合成酶和/或甘氨酸切割活性的棒状杆菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及产生L-甲硫氨酸的微生物和方法。具体而言，本发明涉及显示出甲酰 基-THF-合成酶活性和/或功能性甘氨酸切割系统的棒状杆菌。
背景技术：
当前，全世界甲硫氨酸的年产量是大约500，000吨。甲硫氨酸是禽类家畜饲养的 首要限制性氨基酸，且因此主要作为饲料补充物使用。与其他工业氨基酸不同的是，甲硫氨酸几乎完全以化学合成产生的D-和L-甲 硫氨酸的外消旋物而使用。由于动物能够代谢甲硫氨酸的两种立体异构体，因此直接饲 喂化学方法产生的外消旋混合物是可行的(D' Mello and Lewis, Effect of Nutrition Deficiencies in Animals :Amino Acids, Rechgigl(Ed. ), CRCHandbook Series in Nutrition and Food，441-490，1978)。不过，仍然需要以仅产生L_甲硫氨酸的生物技术方法来替代现有的化学生产方 法。这是因为低水平补充的L-甲硫氨酸相对于D-甲硫氨酸而言是更好的含硫氨基酸来源 (Katz and Baker (1975) Poult. Sci. 545 :1667-74)。此外，化学方法使用更加危险的化合物 且产生大量废液。而高效的生物技术方法可完全避免化学生产的这些缺点。现在，发酵生产精细化学品例如氨基酸、芳香族化合物、维生素和辅因子通常是在 微生物中进行，例如谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)、大肠杆菌(Escherichia coli)、酉良酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)、黑曲霉(Aspergillus niger)、枯 草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、棉阿舒囊霉(Ashbya gossypii)、乳酸克鲁维酵母 (Kluyveromyceslactis)、马克思克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)或氧化葡萄糖菌 (Gluconobacter oxydans)。因此采用发酵方法制备氨基酸例如谷氨酸。为此，已经证实某些微生物非常适合， 如大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌。通过发酵产生氨基酸还有一个特别的优势，即仅产生L-氨基 酸，并避免了使用化学合成法中常用的对环境不利的化合物如溶剂等。不过，通过微生物发 酵生产甲硫氨酸若要成为化学合成方法的替代方法，其必须满足能够以与化学方法生产相 当的成本实现商业规模生产甲硫氨酸的要求。为实现这一目标，现有技术中已经有了在微生物例如大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌中 通过例如提高相应的精细化学品的生物合成途径中涉及的基因的表达生产精细化学品例 如氨基酸、脂质、维生素或碳水化合物的尝试。W0 02/10209、W0 2006008097、W02005059093 或 Cremer et al. (Appl. Environ. Microbiol, (1991), 57 (6), 1746-1752)公开了试图通过上调产生赖氨酸的生物合成途径中 所涉及的基因的表达而提高例如赖氨酸的产生。不过，仍然亟需鉴定代谢途径中那些可对微生物例如谷氨酸棒杆菌内甲硫氨酸的产生具有有益影响的基因。发明目的和内容本发明的一个目的在于提供在微生物中产生L-甲硫氨酸的方法。本发明的另一个目的在于提供产生L-甲硫氨酸的微生物。根据随后的说明书的内容，本发明的这些以及其他的目的将是显而易见的，这些 以及其他的目的通过独立权利要求的技术方案而实现。本发明的其他实施方式由从属权利要求限定。根据本发明的一个方面，提供了优选地在微生物中产生L-甲硫氨酸的方法，其包 括培养微生物的步骤，所述微生物通过遗传学修饰而衍生自起始生物体，使得与所述起始 生物体相比，所述微生物产生更多的N5，N1Q-亚甲基-四氢叶酸(THF)。所述方法使用的微生物选自包括肠杆菌属、棒杆菌属、芽孢杆菌属和链霉菌属的 微生物的组。特别优选地使用谷氨酸棒杆菌。在本发明的一个优选实施方式中，所述方法包括培养微生物的步骤，所述微生物 通过遗传学修饰而衍生自起始生物体，使得与所述起始生物体相比，甲酰基-THF-合成酶 的量和/或活性是升高的。本发明的后一种实施方式的优选的方面涉及培养如下微生物，其中与所述起始生 物体相比，所述微生物中的甲酰基-THF-脱甲酰基酶的量和/或活性额外地是降低的，和 /或其中与所述起始生物体相比，所述微生物中的N5，N1(l-次甲基-THF-环化合成酶(N5， N10-methenyl-THF-cyclosynthetase)、N5，N10-次甲基 _THF_ 还原酶和 / 或 N5，N10-亚甲 基-THF-还原酶的量和/或活性是额外地升高的。本发明的其他优选的实施方式之一涉及如下方法，其中培养一种微生物，所述微 生物通过遗传学修饰而衍生自起始生物体，使得与所述起始生物体相比，甘氨酸切割系统 (GCS)的酶活性是升高的。为实现这一目的，可对起始生物体进行遗传学修饰，使得与所述起始生物体相比， PLP-依赖性甘氨酸脱羧酶(gcvP，P-蛋白)、含硫辛酰胺的氨基甲基转移酶(gcvH，H-蛋白) 和合成 N5，N1CI-亚甲基-THF 的酶(N5，N10-methylene-THF-synthesizing enzyme) (gcvT, T_蛋白)的量和/或活性是升高的。这些遗传学修饰保证累积的甘氨酸被转化为NH4+、C02 和N5，N1(l-亚甲基-THF。在本发明这一方面的更加具体的实施方式中，在存在硫辛酸和/或 硫辛酰胺的情况下培养所述微生物。可选地或额外地，微生物可被进一步遗传学修饰，使得它们表现为硫辛酸合酶 (lipA)、硫辛酰转移酶(lipB)、和/或硫辛酸合成酶(lplA)的量和/或生物学活性升高。培养的微生物可额外地或可选地被遗传学修饰以表现为NAD+-依赖性的需FAD的 硫辛酰胺脱氢酶(lpd)的量和/或活性升高。在本发明的优选的实施方式中，所述方法允许通过培养微生物而产生L-甲硫氨 酸，所述微生物已经被遗传学修饰，使得甲酰基-THF-合成酶的量和/或生物学活性升高， 且因此建立了功能性甘氨酸切割系统。此类微生物将典型地表现为甲酰基-THF-合成酶、 gCVH、gCVP和gCVT(gCVHPT)的量和/或生物学活性升高。在本发明的一个方面，将在存在 硫辛酸和/或硫辛酰胺的情况下培养这些微生物。可选地或额外地，微生物可被进一步遗 传学修饰以表现为lipA、lipB和/或lplA的量和/或活性升高。微生物也可表现为lpd
6的量和/或生物学活性升高。 优选地，通过培养谷氨酸棒杆菌微生物而实施本发明的方法的上述实施方式。可 将上述遗传学修饰引入谷氨酸棒杆菌野生菌株。在优选的实施方式中，将这些遗传学改造 引入已经被认为是产生甲硫氨酸的菌株的谷氨酸棒杆菌菌株。上述甲酰基-THF-合成酶、gcvP、gcvT、gcvH、lplA、IipA和IipB的编码序列优选 地来自杰氏棒杆菌(Corynebacterium jeikeium)或大肠杆菌。如果是通过培养谷氨酸棒 杆菌菌株进行所述方法，则特别要考虑杰氏棒杆菌的序列。在另一方面，本发明涉及微生物，所述微生物通过遗传学修饰而衍生自起始微生 物，以便与所述起始生物体相比产生更多的N5，Nltl-亚甲基-THF。所述微生物同样可选自包 括肠杆菌属、棒状杆菌、芽孢杆菌属和链霉菌属的组，其中棒状杆菌且特别是谷氨酸棒杆菌 是优选的。在本发明的这一方面的一个实施方式中，所述微生物通过遗传学修饰而衍生自起 始生物体，使得与所述起始生物体相比，甲酰基-THF-合成酶的量和/或活性是升高的。本 发明这一方面的更加具体的实施方式包含如下微生物，其甲酰基-THF-脱甲酰基酶量和/ 或活性降低和/或N5，N10-次甲基-THF-环化合成酶、N5, N10-次甲基-THF-还原酶和/或 N5, Nlt1-亚甲基-THF-还原酶的活性升高。本发明的另一实施方式涉及如下微生物，所述微生物通过遗传学修饰而衍生自起 始生物体，使得与所述起始生物体相比，所述生物体的甘氨酸切割系统的酶活性是升高的。为此，可对所述微生物进行遗传学改造以使之表现为gCVP、gCVT和gcvH的量和/ 或活性升高。此外，所述微生物可被进一步遗传学修饰，以使之表现为对外部提供的硫辛酸 和/或硫辛酰胺的摄取能力提高和/或内源性合成硫辛酸的能力提高。为此，可提高所述 微生物中的IplAUipA和/或IipB的量和/或活性。与所述起始生物体相比，Ipd的量和 /或活性也可升高。所述微生物优选地衍生自谷氨酸棒杆菌。可将遗传学改造引入谷氨酸棒杆菌的野 生菌株或引入已经被认为是产生甲硫氨酸的菌株的菌株。本发明的优选的方面涉及如下微生物，其与所述起始生物体相比，甲酰 基-THF-合成酶、gCVP、gCVT和gcvH的量和/或生物学活性是升高的。在本发明这一方面 的更加具体的实施方式中，与所述起始生物体相比，可升高lplA、IipA和/或IipB的量和 /或活性。可选地和/或额外地，可升高Ipd的量和/或活性。所述优选地衍生自谷氨酸棒杆菌。可将遗传学改造引入谷氨酸棒杆菌的野生菌株 或引入已经被认为是产生甲硫氨酸的菌株的菌株。
图1显示了杰氏棒杆菌与谷氨酸棒杆菌的Ipd氨基酸序列的序列比对。发明详述本发明涉及生产L-甲硫氨酸的方法，其步骤包括培养遗传学修饰的微生物和任 选地分离甲硫氨酸。本发明还涉及遗传学修饰的微生物，其能够产生L-甲硫氨酸。本发明基于如下发现，S卩如果一种生物体是通过遗传学修饰而来自起始生物体， 且与所述起始生物体相比，所得微生物产生更多的N5，N10-亚甲基-四氢叶酸(THF)，则可在此类微生物中高效产生L-甲硫氨酸(也称作甲硫氨酸)。在详细描述本发明的示例性实施方式之前，先给出以下定义。
本文中的基因名称或蛋白质名称，例如但不限于甲酰基-THF-合成酶、gcvPTH、 lipA、lipB、lplA、Ipd和任何其他基因或蛋白质名称，根据该名称所使用的语境，可指基因 和/或该基因编码的蛋白质或酶之一或两者。术语“大约”在本文中表示精确性的区间，本领域人员能够理解该精确性的区间对 于所讨论的特征而言是常规的。该术语典型地表示与所指定的数值的差异为+/-10%，优选 地为+/-5%。术语“微生物”在本发明中指的是原核生物和低等真核生物。本发明的生物体因此包括微生物，因为本领域已知它们可用于生产例如氨基 酸、维生素、酶辅因子等精细化学品。它们可选自棒杆菌属特别是谷氨酸棒杆菌、肠杆 菌属特别是大肠杆菌、芽孢杆菌属特别是枯草芽孢杆菌、放线菌属、蓝细属菌、蛋白菌属 (proteobacteria)、嗜盐菌属、甲烷球菌属、分枝杆菌属、沙门氏菌属、志贺氏菌属和链霉菌 属。术语“微生物”也包括酵母例如粟酒裂殖酵母、酿酒酵母、乳酸克鲁维酵母、马克思克鲁 维酵母、棉阿舒囊霉和巴斯德毕赤氏酵母。如下文所详述，本发明主要涉及经遗传学修饰而表现为特定的酶的量和/或活性 升高的微生物。在本发明中，术语"遗传学修饰"和"遗传学改造"及其各种语法上的变体指的 是微生物已经通过基因技术的手段而被修饰，以使之表达改变量的在相应的微生物中能够 天然产生的一或多种蛋白质，或表达在相应的微生物中不天然产生的一或多种蛋白质，或 与相应的未修饰微生物的蛋白质相比表达活性改变的一或多种蛋白质。未修饰的微生物被 认为是"起始生物体"，对其进行遗传学改造产生了本发明的微生物。术语"起始生物体"因此指的是生物体的野生型。对于谷氨酸棒杆菌，可以是例 如ATCC13032。不过，在本发明中，术语〃起始生物体〃也可以指这样的生物体，其与相应物 种的野生型生物体相比已经已经携带遗传学改造，但随后被进一步遗传学修饰以便产生本 发明的生物体。对于谷氨酸棒杆菌，起始生物体因此可以是野生型谷氨酸棒杆菌菌株，例如 ATCC13032。不过，起始生物体优选地也可以是例如已经被遗传工程化用于产生甲硫氨酸的 谷氨酸棒杆菌菌株。此类产生甲硫氨酸的起始生物体例如可以衍生自野生型棒状杆菌，且优选地衍生 自野生型谷氨酸棒杆菌，该细菌在至少一种如下基因中含有遗传学改造askfto、Komfbr和 metH，其中所述遗传学改造导致这些基因过表达，由此导致与缺乏所述遗传学改造的情况 下产生的甲硫氨酸相比，甲硫氨酸的产生增加。在优选的实施方式中，该产生甲硫氨酸的起 始生物体在aSkfto、homfto和metH中将同时含有遗传学改造，由此导致与缺乏所述遗传学改 造的情况下产生的甲硫氨酸相比，甲硫氨酸的产生增加。在这些起始生物体中，ask和hom的内源性拷贝典型地被改造为反馈抗性等位基 因，它们不再受到赖氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸或这些氨基酸的组合的反馈抑制。可通过突变 或筛选实现这一目的，或是通过以编码反馈抑制被降低或消除的蛋白质的突变的等位基因 对这些基因进行确定的基因置换。包括这些遗传学改造的谷氨酸棒杆菌菌株例如为谷氨酸棒杆菌DSM17322。本领域人员知晓也可以采用下述用来产生谷氨酸棒杆菌DSM17322的遗 传学改造的替代性遗传学改造来实现askfto、homfbr和metH的过表达。 就本发明的目的而言，askfto代表反馈抗性天冬氨酸激酶。Homfto代表反馈抗性高 丝氨酸脱氢酶。MetH代表维生素B12-依赖性甲硫氨酸合酶。在另一优选的实施方式中，产生甲硫氨酸的起始生物体可以衍生自野生型棒状杆 菌，且优选地衍生自野生型谷氨酸棒杆菌，该细菌在至少一种如下基因中含有遗传学改造 Bskfbr, homfto、metH、metA(也称为 metX)、metY(也称为 metZ)、和 hskmutated，其中所述遗传 学改造导致这些基因过表达，由此导致与缺乏所述遗传学改造的情况下产生的甲硫氨酸相 比，甲硫氨酸的产生增加。在优选的实施方式中，该产生甲硫氨酸的起始生物体在ask*、 1ιοπΛ、πιθ Η、πιθ Α(也称为metX)、metY(也称为metZ)、和hskmutated中将同时含有遗传学改 造，由此导致与缺乏所述遗传学改造的情况下产生的甲硫氨酸相比，甲硫氨酸的产生增加。在这些起始生物体中，aSk、hom和hsk的内源性拷贝典型地如上述ask "和Iiomfto 那样被Mkfta^homfto和hskmutatral置换。包括这些遗传学改造的谷氨酸棒杆菌菌株例如为谷 氨酸棒杆菌M2014。本领域人员知晓也可以采用下述用来产生谷氨酸棒杆菌M2014的遗传 学改造的替代性遗传学改造来实现askfto、homfbr, metH、metA (也称为metX)、metY (也称为 metZ)、和 hskmutated 的过表达。 就本发明的目的而言，metA代表高丝氨酸琥珀酰转移酶，其例如来自大肠杆菌。 MetY代表0-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶。Hskmutated代表经突变而表现出降低的酶活性的高 丝氨酸激酶。可通过在相应于谷氨酸棒杆菌ATCC13032的hsk (Genbank登录号Cgl 1184) 的T190的位置以丝氨酸或丙氨酸替换苏氨酸而实现这一目的。可选地或额外地，可将ATG 起始密码子替换为TTG起始密码子。此类突变导致所得到的hsk蛋白与未突变的hsk基因 相比具有降低的酶活性。在另一优选的实施方式中，产生甲硫氨酸的起始生物体例如可以衍生自野生型棒 状杆菌，且优选地衍生自野生型谷氨酸棒杆菌，该细菌在至少一种如下基因中含有遗传学 改造askfto、homfto、metH、metA(也称为 metX)、metY(也称为 metZ) ^hskmutated 和 metF，其中 所述遗传学改造导致这些基因过表达，且上述遗传学改造与如下基因之一的遗传学改造相 组合serA，其中serA的遗传学改造降低该基因的表达，其中所述组合导致与缺乏所述组 合的情况下产生的甲硫氨酸相比，所述微生物的甲硫氨酸的产生增加。在这些起始生物体中，ask、hom、hsk的内源性拷贝如上述那样被置换，而serA的 内源性拷贝典型地被功能性破坏。包括这些遗传学改造的谷氨酸棒杆菌菌株例如是谷氨酸 棒杆菌0M264C。本领域人员知晓也可以采用下述具体用来产生谷氨酸棒杆菌0M264C的遗 传学改造的替代性遗传学改造来实现askfto、homfbr, metH、metA (也称为metX)、metY (也称 为metZ)、hskmutated和metF的过表达以及降低serA的表达。就本发明的目的而言，serA代表3_磷酸甘油酸脱氢酶(见表1)。在另一优选的实施方式中，产生甲硫氨酸的起始生物体例如可以衍生自野生型棒 状杆菌，且优选地衍生自野生型谷氨酸棒杆菌，该细菌在至少一种如下基因中含有遗传学 改造askfto、homfto、metH、metA(也称为 metX)、metY(也称为 metZ) ^hskmutated 和 metF，其中 所述遗传学改造导致这些基因过表达，且上述遗传学改造与至少一种如下基因的遗传学改 造相组合mcbR和metQ，其中mcbR和metQ的遗传学改造降低这些基因的表达，其中所述组合导致与缺乏所述组合的情况下产生的甲硫氨酸相比，所述微生物的甲硫氨酸的产生增 力口。在优选的实施方式中，该产生甲硫氨酸的起始生物体在aSkfto、h0mfto、metH、metA(也称 为metX)、metY(也称为metZ)、hskmutated和metF中将同时含有遗传学改造，其中所述遗传 学改造导致这些基因过表达，且上述遗传学改造与mcbR和metQ的遗传学改造相组合，其中mcbR和metQ的遗传学改造降低这些基因的表达，其中所述组合导致与缺乏所述组合的情 况下产生的甲硫氨酸相比，所述微生物的甲硫氨酸的产生增加。在这些起始生物体中，ask、hom和hsk的内源性拷贝典型地如上述那样被置换， 而mcbR和metQ的内源性拷贝典型地被功能性破坏。包括这些遗传学改造的谷氨酸棒杆 菌菌株例如是谷氨酸棒杆菌0M469。本领域人员知晓也可以采用下述具体用来产生谷氨酸 棒杆菌0M469的遗传学改造的替代性遗传学改造来实现ask "、hom^, metH、metA(也称为 metX)、metY(也称为metZ)、hskmutated和metF的过表达以及降低mcbR和metQ的表达。就本发明的目的而言，metF代表N5，10_亚甲基-四氢叶酸还原酶(EC1. 5. 1.20)。 McbR代表硫代谢的TetR-型转录调节物(Genbank登录号AAP45010)。MetQ代表D-甲硫 氨酸结合脂蛋白，其在甲硫氨酸输入中起作用。在另一优选的实施方式中，产生甲硫氨酸的起始生物体例如可以衍生自野生型棒 状杆菌，且优选地衍生自野生型谷氨酸棒杆菌，该细菌在至少一种如下基因中含有遗传学 改造askfbr、homfbr、metH、metA(也称为 metX)、metY(也称为 metZ)、hskmutated、metF、tkt、 tal、zwf和6pgl，其中所述遗传学改造导致这些基因过表达，且上述遗传学改造与至少一 种如下基因的遗传学改造相组合mCbR、metQ和sda，其中mCbR、metQ和sda的遗传学改造 降低这些基因的表达，其中所述组合导致与缺乏所述组合的情况下产生的甲硫氨酸相比， 所述微生物的甲硫氨酸的产生增加。在优选的实施方式中，该产生甲硫氨酸的起始生物体 在 askfbr、homfbr、metH、metA(也称为 metX)、metY(也称为 metZ)、hskmutated、metF、tkt、tal、 zwf和6pgl中将同时含有遗传学改造，其中所述遗传学改造导致这些基因过表达，且上述 遗传学改造与mcbR、metQ和sda的遗传学改造相组合，其中mcbR、metQ和sda的遗传学 改造降低这些基因的表达，其中所述组合导致与缺乏所述组合的情况下产生的甲硫氨酸相 比，所述微生物的甲硫氨酸的产生增加。包括这些遗传学改造的谷氨酸棒杆菌菌株例如是谷氨酸棒杆菌GK1259。本领域人 员知晓也可以采用下述具体用来产生谷氨酸棒杆菌GK1259的遗传学改造的替代性遗传学 改造来实现 askfbr、homfbr、metH、metA (也称为 metX)、metY (也称为 metZ)、hskmutated、metF、 tkt、tal、zwf和6pgl的过表达以及降低mcbR、metQ和sda的表达。就本发明的目的而言，tkt代表转酮醇酶，tal代表转醛醇酶，zwf代表葡萄 糖-6-磷酸脱氢酶，6pgl代表6-磷酸葡糖酸内酯酶，而sda代表丝氨酸脱氨酶(见表1)。 本领域人员明白，为了提高zwf的量和/或活性，也可升高opca的量和/或活性，opca充 当了 zwf的结构支架蛋白。在GK1259中，可通过使用同时增加包含tkt、tal、zwf和6pgl 的磷酸戊糖操纵子的转录的PSOD启动子。如上所述，本发明的遗传学修饰的微生物的特征在于N5，Nltl-亚甲基-THF的量是 升高的。典型地，本发明的微生物与相应的起始生物体相比，N5，N10-亚甲基-THF的量将升 高至少大约2%、至少大约5%、至少大约10%、或至少大约20%。在其他优选的实施方式中，N5, Nlt1-亚甲基-THF的量将升高至少大约30%、至少大约50%或至少大约75%。更加 优选的实施方式涉及的微生物中的N5，Nltl-亚甲基-THF的量升高至少大约2倍、至少大约 5倍或至少大约10倍。与培养未经过下文所述的遗传学修饰的相应起始生物体相比，本发明的方法和微 生物可用于产生更多的甲硫氨酸。本发明的微生物个方法还可用于提高甲硫氨酸合成的效 率。术语"甲硫氨酸合成效率"描述的是甲硫氨酸的碳产率(carbon yield ofmethionine)。这种效率以碳底物形式进入系统的能量输入的百分比进行计算。在本发 明中，该值以百分数表示((甲硫氨酸摩尔数)(碳底物摩尔数)-、100)。术语"甲硫氨酸 合成效率升高"因此涉及起始生物体与实际的棒状杆菌之间的比较，其中实际的棒状杆菌 中至少一种下文所述的酶的量和/或活性已经被升高。本发明的优选的碳源是糖，例如单糖、二糖或多糖。例如，选自如下一组的糖可作 为特别优选的碳源葡萄糖、果糖、hanose、半乳糖、核糖、山梨糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、棉子 糖、淀粉或纤维素。与所述起始生物体相比，本发明的方法和棒状杆菌还可用于产生更多的甲硫氨酸。与所述起始生物体相比，本发明的方法和棒状杆菌还可用于以更高的速率产生甲 硫氨酸。例如，如果以典型的生产周期为参考，所述方法和棒状杆菌将允许以更快的速率产 生甲硫氨酸，即与所述起始生物体相比，将在更早的时间点产生相同量的甲硫氨酸。这特别 适用于对数生长期。如果菌株在摇瓶中培养，本发明的方法和棒状杆菌允许产生至少大约3g甲硫氨 酸/L培养体积。如果菌株在摇瓶中培养，滴度优选地为至少大约4g甲硫氨酸/L培养体积、 至少大约5g甲硫氨酸/L培养体积或至少大约7g甲硫氨酸/L培养体积。如果菌株在摇瓶 中培养，更加优选的值达到至少大约IOg甲硫氨酸/L培养体积，且更加优选地达到至少大 约20g甲硫氨酸/L细胞群(cell mass)。如果在采用搅动和补料碳源的发酵罐的发酵实验中培养菌株，本发明的方法和棒 状杆菌允许产生至少大约25g甲硫氨酸/L培养体积。如果在采用搅动和补料碳源的发酵 罐的发酵实验中培养菌株，滴度优选地为至少大约30g甲硫氨酸/L培养体积、至少大约35g 甲硫氨酸/L培养体积或至少大约40g甲硫氨酸/L培养体积。如果在采用搅动和补料碳源 的发酵罐的发酵实验中培养菌株，更加优选的值达到至少大约50g甲硫氨酸/L培养体积， 且更加优选地达到至少大约60g甲硫氨酸/L细胞量。在优选的实施方式中，与起始生物体相比，本发明的方法和微生物允许甲硫氨酸 合成的效率和/或甲硫氨酸的量和/或甲硫氨酸合成的滴度和/或速率升高至少大约2%、 至少大约5%、至少大约10%或至少大约20%。在优选的实施方式中，与起始生物体相比， 甲硫氨酸合成的效率和/或甲硫氨酸的量和/或滴度和/或速率升高至少大约30%、至少 大约40%、或至少大约50%。更加优选地，升高至少大约2倍、至少大约3倍、至少大约5 倍和至少大约10倍。术语"代谢物"指的是在生物体代谢途径中用作前体、中间物和/或终产物的化 合物。此类代谢物不仅可作为化学构建单元，还可对酶或其代谢活性发挥调节活性。从文献可知，此类代谢物可抑制或剌激酶的活性(Stryer，Biochemistry (2002)W. H. Freeman & Company, New York，New York)0术语"标准条件"指的是在不富含特定化合物的标准培养基中培养微生物。培养 的温度、PH和时间可以变化，详情见下文。各种微生物的标准培养条件可参考文献，包括教科书，例如“Sambr00k& Russell, Molecular Cloning-Α Laboratory Manual“ ， Cold Spring HarborLaboratory Press,3rd edition(2001)。
“基本培养基"是仅含有供野生型细胞或突变细胞生长的基本必需品的培养基， 如无机盐、碳源和水。对于突变细胞，基本培养基可含有一或多种基本上纯的化合物添加 物，以允许不能产生此类化合物的突变细胞能够生长。与之不同的是，“富集培养基"用于满足特定生物体的所有生长需求，即除了基 本培养基的内容以外，还含有例如氨基酸、生长因子、酶辅因子等等。在本发明中，与起始生物体相比，术语"升高(至少一种蛋白质(例如甲酰 基-THF-合成酶))的量"指的是起始微生物被遗传学修饰以表达更高量的例如上述酶之 一。应该理解，升高例如一种酶的量指的是功能性酶的量被升高的情况。在本发明中，如果 一种酶，例如甲酰基-THF-合成酶，能够催化相应的反应，则认为它是有功能的。本领域人员知晓有多种不同方式可以升高微生物例如棒状杆菌内的蛋白质的量。 这些方式包括增加编码相应蛋白质的核酸序列的拷贝数，增加此类核酸序列的转录和/或 翻译或它们的组合。下文将详细讨论这些不同方式。术语"升高(至少一种蛋白质)的活性"指的是在该蛋白质的相应的野生型序列 中引入至少一种突变，与表达相同量的野生型蛋白质的情况相比，所述突变导致产生更多 的甲硫氨酸。可利用携带特定突变的酶来实现这一目的，其中所述突变使得所述酶的活性 升高。此类突变可以，例如，灭活酶中负责反馈抑制的那部分。通过例如在这些酶中引入非 保守性点突变，酶不再受到反馈调节，且因此在产生较多产物分子的时候酶的活性仍不被 下调。此外，可通过引入增加酶的催化周转的突变而升高酶的活性。可以将突变引入编码相 应的酶的内源性基因拷贝中，或可以从编码所述酶的外源性核酸序列过量表达相应的突变 体。此类突变可包括点突变、缺失或插入。点突变可以是保守性的(一种氨基酸被具有类 似生物化学和物理化学性质的另一种氨基酸置换)或非保守性的(一种氨基酸被生物化学 和物理化学性质不相似的另一种氨基酸置换)。此外，缺失部分可包括仅仅两或三个氨基酸 直至相应蛋白质的完整结构域。例如，对于谷氨酸棒杆菌ATCC13032的转酮醇酶(Genbank 登录号Cgl 1574)，相应于A293位置处的丙氨酸被替换为R和/或相应于A327位置处的丙 氨酸被替换为T的突变产生了酶活性提高的酶。基于本发明的教导，本领域人员能够开发 出其他的或替代性的突变。因此，术语"升高(至少一种酶)的活性"指的是将突变引入相应的野生型序列 以降低负调控机制例如反馈抑制和/或提高酶的催化周转。因此，可通过不同的途径来增加蛋白质例如酶的量和/或活性，例如通过关闭转 录、翻译或蛋白水平的抑制调节机制，和/或通过使得编码所述蛋白质的核酸的基因表达 比起始生物体增加，例如通过诱导内源性基因或者通过引入编码所述蛋白质的核酸序列。当然，可组合使用升高蛋白质例如酶的量和/或活性的方法。因此，例如，可以使用突变体替换棒状杆菌的内源性酶，该突变体编码该酶的反馈不敏感形式。如果该突变拷 贝的转录置于强启动子的控制之下，则相应的酶的量和活性可升高。可以理解，在这种情况 中，该酶必须仍然能够催化其通常所参与的反应。
编码蛋白质例如酶的核酸序列可以是内源性的或外源性的。因此，例如，通过升高 相应的起始微生物内天然存在的核酸序列的表达(例如通过染色体整合额外的核酸序列) 或通过在该内源性基因前面使用强启动子，可增加蛋白质例如酶的量。可选地或额外地，也 可通过表达编码来自另一种生物体的该酶的同源物的核酸序列而增加蛋白质例如酶的量。 后一种情况的实例将在下文给出。因此，例如，可通过过表达来自自主复制型载体或额外插入的染色体拷贝(见下) 的相应的谷氨酸棒杆菌序列而增加谷氨酸棒杆菌内Ipd的量，或可使用来自例如枯草芽孢 杆菌或大肠杆菌的相应的酶并例如使用自主复制型载体过表达所述酶。在某些情况中，使用内源性酶是优选的，因为例如谷氨酸棒杆菌的内源性编码序 列就其密码子使用而言对于在谷氨酸棒杆菌内进行表达是优化的。在下文中，如果提及蛋白质例如特定的酶的量和/或活性与起始生物体相比应该 是降低的，则上述定义经必要的修改后也是适用的。要降低蛋白质例如酶的量和/或活性，可使编码相应的蛋白质的核酸序列部分或 完全缺失，抑制转录(例如通过引入弱启动子)，可通过相应地修改密码子的使用而抑制翻 译，可在编码相应蛋白质的核酸序列引入造成蛋白质无功能的突变，和/或它们的组合。在下文中将提到术语"功能性同源物"。术语"功能性同源物"在本发明中指的 是这样一种情况，即特定的酶活性不仅可由具有确定氨基酸序列的特定蛋白质来提供，也 可由具有来自其他有关或无关的生物体的类似序列的蛋白质来提供。例如，可通过表达编码杰氏棒杆菌甲酰基-THF-合成酶的核酸序列(SEQID NO=I 核酸序列，SEQ ID NO: 2 氨基酸序列，Genbank登录号(NP_939608))或其功能性同源物而 在谷氨酸棒杆菌中建立甲酰基-THF-合成酶的活性。本领域人员可通过同源性分析而容易地鉴定来自其他生物体的蛋白质同源物。为 此可确定推定的同源物的氨基酸或核酸序列与所述基因的序列(例如，甲酰基-THF-合成 _、gCVH、gCVP、gCVT、lpd、lplA、lipA、lipA的核酸序列)或所述基因编码的蛋白质的序列 之间的相似性，即百分比相同性。例如，可通过观察或通过使用基于算法的同源性分析而确定百分比相同性。例如，为了确定两个氨基酸序列的百分比相同性，算法将以最佳比较为目的将序 列对齐(例如，为了与一种蛋白质的氨基酸序列进行最佳比对，可在另一蛋白质的氨基酸 序列内引入缺口)。然后比较相应氨基酸位置处的氨基酸残基。如果一条序列的一个位置 与另一序列的相应位置均被同一种氨基酸残基占据，则两种分子在该位置处是相同的。两 个序列之间的百分比相同性是序列之间共有的相同位置的数量的函数(即，相同性％=相 同位置的数量/位置的总数量xlOO)。用于此类目的的各种计算机程序是已知的。例如，可使用Devereux et al. (1984) Nucl. Acids. Res. , 12 :387 所描述的且可自 University of WisconsinGenetics Computer Group(UffGCG)获得的GAP计算机程序通过比较序列信息而确定两个核酸序列或氨基酸序 列的百分比相同性。也可使用Basic LocalAlignment Search Tool (BLAST )程序(参见Tatusova et al. (1999)FEMSMicrobiol. Lett.，174 :247)通过比对两个核酸序列或氨基酸 序列而确定百分比相同性。在本申请的申请日，提供BLAST程序的标准软件包可从NCBI的BLAST网页 (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/)获得。例如，使用上述任一 SEQ ID 号，本领域人 员可进行基于核酸序列或基于氨基酸序列的BLAST搜索以及相应的酶在例如大肠杆菌、酿 酒酵母、枯草芽孢杆菌等中的密切相关的同源物的相同性。例如，对于使用BLAST 程序的 核酸序列比对，默认设置为匹配得分为2，错配罚分为-2，开放缺口和延伸缺口分别罚分5 和 2，gap. times, dropoff 为 50，预期为 10，word size 为 11，filter 为 OFF。
可在 EMBL 数据库(http //www, embl. orR)或 Expasy 主页(http //www, expasy. org/)进行类似的序列搜索和分析。所以上述序列搜索均可典型地使用本申请申请日前的 数据库提供者预设的默认参数进行。也可常规使用软件程序例如DNA Star, Inc. ,Madison, ffinconsin, USA的激光基因软件进行同源性搜索，后者使用CLUSTAL方法(Higgins et al. (1989)，Comput. Appl. Biosci.，5 (2) 151)。本领域人员理解，如果两种蛋白质具有如上所述的一定程度的相同性，则它们很 可能具有相同的功能(例如提供相同的酶活性)。氨基酸水平的典型的下限典型地是至少 大约25%的相同性。对于核酸水平，下限典型地为至少50%。两种类型的序列的优选的相同性等级为至少大约50%、至少大约60%或至少大 约70%。更优选的相同性水平为至少大约80%、至少大约90%或至少大约95%。这些相 同性水平被认为是显著的。在本发明中，术语“同源性”和“同源”不限于指具有理论上的共同遗传学祖先的蛋 白质，也包括遗传学上不相关但演化为行使相似的功能和/或具有相似的结构的蛋白质。 同源物应该是有功能的这一要求是指本发明的同源物包括与参照蛋白质具有基本上相同 的活性的蛋白质，对于具有功能同源性的蛋白质，不必要求它们具有氨基酸序列的显著相 同性，而是指这些具有功能同源性是蛋白质由相似或相同的活性例如酶活性所定义。优选地，如果来自不同于宿主细胞如棒状杆菌的另一种生物体的酶与其在棒状杆 菌中的对应物至少显示出显著的相似性，即氨基酸水平大约50%的序列相同性，并催化相 同的反应，则认为该酶是功能性同源物。如果功能性同源物提供相同的酶活性并在氨基酸 水平具有更高程度的相同性，例如至少大约60%、至少大约70%、至少大约80%或至少大 约90%的序列相同性，便是更加优选的功能性同源物。本领域人员知晓也可以使用来自棒状杆菌的上述酶的片段或突变形式以及所述 酶在其他生物体中的功能性同源物的片段或突变形式，条件是这些片段或突变形式展现出 相同类型的功能活性。典型的具有功能活性的片段将表现为N-末端和/或C-末端缺失， 而突变形式典型地包含缺失、插入或点突变。例如，如果大肠杆菌的序列在氨基酸水平与SEQ ID NO 2展现出上述相同性水平 并表现出与杰氏棒杆菌甲酰基-THF-合成酶相同的酶活性，则认为该序列编码杰氏棒杆菌 甲酰基-THF-合成酶的功能性同源物。实例可取自表1。也可以使用这些序列的片段或例 如点突变体，条件是所产生的蛋白质仍与全长的酶催化同样类型的反应。下文将以甲酰基-THF-合成酶、gcvTHP、lplA、IipA和IipB为例给出升高酶的量 的实例。还将以丝氨酸脱氨酶为例给出降低酶的量的实例。
升高微牛物内的甲酉feS-THF-合成_的量禾Π /或活十牛
本发明的一个优选的方面涉及一种微生物，其中对起始生物体尽兴遗传学操作， 使得与所述起始生物体相比，所得到的微生物中甲酰基-THF-合成酶的量和/或活性是升 高的。本发明还涉及在微生物中产生甲硫氨酸的方法，其包括培养上述微生物的步骤。在微生物例如大肠杆菌和杰氏棒杆菌中，甲酰基-THF-合成酶的序列是已知的。 在此类微生物中，升高甲酰基-THF-合成酶的量和/或活性需要将该酶的量和/或活性升 高至相应的起始生物体的水平以上，例如通过过表达编码酶活性的核酸序列。在本发明的优选的宿主生物体谷氨酸棒杆菌中，甲酰基-THF-合成酶是未知的。 下文描述了如何在谷氨酸棒杆菌中建立甲酰基-THF-合成酶活性。不过，本领域人员知晓 如何在其他微生物例如杰氏棒杆菌和大肠杆菌中升高甲酰基-THF-合成酶的量和/或活 性。本发明还涉及谷氨酸棒杆菌微生物，其中甲酰基-THF-合成酶的量和/或活性是 升高的，并涉及该微生物在生产甲硫氨酸中的用途。可通过例如增加编码甲酰基-THF-合 成酶的核酸序列的拷贝数、提高的编码甲酰基-THF-合成酶的序列的转录和/或翻译或其 组合而实现这一目的。就本发明的目的而言，可使用来自杰氏棒杆菌的甲酰基-THF-合成酶。该甲酰 基-THF-合成酶的核酸序列为SEQ ID NO :1，其氨基酸序列为SEQ IDNO :2。Genbank登录号 为ΥΡ_250663. 1。该序列来源于杰氏棒杆菌NCTCK11915，后者也称为Κ411。甲酰基-THF-合 成酶也可获自菌株DSMZ7171，其中核酸序列为SEQ ID NO 51，氨基酸序列为SEQ ID NO :52。当然也可以使用SEQ ID NO :1和2所示的甲酰基-THF-合成酶的功能性片段或其 功能性同源物。表1给出了可通过标准的同源性搜索而鉴定的一些同源物。可通过例如从自主复制型质粒表达所述序列，或将额外拷贝的相应核酸序列整合 至微生物的基因组且优选地为谷氨酸棒杆菌的基因组内，由此增加微生物内且优选地谷氨 酸棒杆菌内的编码甲酰基-THF-合成酶的核酸序列的拷贝数。对于自主复制型载体，他们可稳定保留在棒状杆菌内。用于在谷氨酸棒杆菌中 表达多肽和酶例如甲酰基-THF-合成酶的典型的载体包括pCliK、pB和ρΕΚΟ，参见Bott， Μ. and Eggeling,L. ,eds. Handbook of Corynebacteriumglutamicum. CRC Press LLC,Boca Raton,FL ；Deb,J.K.et al. (FEMS Microbiol. Lett. (1999)，175 (1)，11-20)、Kirchner 0. et al. (J. Biotechnol. (2003)，104(1-3)，287-299)、W02006069711 和 W02007012078。在增加棒状杆菌中编码多肽的核酸序列的拷贝数的另一方法中，可将额外拷贝的 编码此类多肽的核酸序列整合到谷氨酸棒杆菌的染色体内。染色体整合例如可发生在相应 多肽的内源性拷贝所位于的基因座。额外地和/或可选地，编码多肽的核酸序列的染色体 重复可发生在棒状杆菌基因组内的其他基因座上。对于谷氨酸棒杆菌，本领域人员已知有各种方法通过染色体整合来增加基因拷 贝数。此类方法之一借助于载体PK19 sacB，详情见Schafer A，et al. JBacteriol. 1994 176(23) :7309-7319。用于染色体整合编码多肽的核酸序列的其他载体包括pCLIK int sacB，详情见 W02005059093 和 W02007011845。升高微生物且特别是谷氨酸棒杆菌内的甲酰基-THF-合成酶的量和/或活性的另 一优选的方法是使用强启动子来增加编码序列的转录。
如果使用强启动子升高内源性甲酰基-THF-合成酶的活性，则术语"强启动子" 指的是由新引入的启动子引起的转录强于天然存在的内源性启动子。不过，如果是在其中该类型的酶是未知的谷氨酸棒杆菌内表达甲酰基-THF-合成酶，则可使用已知可引起谷氨酸棒杆菌的内源性基因强表达的启动子。这种情况下优选的启动子是启动子Psqd(SEQ ID N0:3), PgroES(SEQ IDNO 4)、 Peftu(SEQ ID NO :5)、噬菌体 SPOl 启动子 P15 (SEQ ID NO 42)、禾口 APe(SEQ ID N0:6)，后者 有时称为lambdaPK。在谷氨酸棒杆菌中，λ Pk启动子可强于Psrai启动子。Psffll启动子可强于 Pgr0ES启动子，而PgraES启动子可弱于Peftu启动子或P15启动子。Peftu启动子可强于Psrai启动 子。不过，启动子在任何生物体内的强度不一定是启动子的固有属性，这是因为根据启动子 通过遗传工程化而被放置的位置，启动子的强度可以有很大的变化。微生物且特别是谷氨酸棒杆菌的甲酰基-THF-合成酶的量和/或活性升高将允 许所述微生物生长在含有甲酸盐作为碳源的培养基中。此外，甲酸盐还在多种生物合成途 径中作为代谢物，因此利用甲酸盐也将允许升高N5，Nltl-亚甲基-THF的产量。N5，Nltl-亚甲 基-THF的水平升高将导致甲基-THF的产生增加和甲硫氨酸的产生增加。因此本发明还涉及一种方法，其包括培养上述微生物和任选地分量甲硫氨酸。在本发明的升高微生物且优选地谷氨酸棒杆菌内的甲酰基-THF-合成酶的量和/ 或活性的上述实施方式的更加具体的情况中，可通过降低甲酰基-THF-脱甲酰基酶的量和 /或活性而进一步增加N5，Niq-亚甲基-THF的量。甲酰基-THF-脱甲酰基酶的核酸序列为 SEQ ID NO :7，氨基酸序列为SEQ IDNO :8。表1给出该酶活性的Genbank登录号。可选地或额外地，与所述起始生物体相比，N5, N10-次甲基-THF-环化合成酶、N5, N10-次甲基-THF-还原酶和/或N5，N10-亚甲基-THF-还原酶的量和/或活性是升高的。在 优选的实施方式中，与所述起始生物体相比，甲酰基-THF-合成酶的量和/或活性是升高 的，甲酰基-THF-脱甲酰基酶的量和/或活性是降低的，且N5，N10-次甲基-THF-环化合成 酶、N5，N10-次甲基-THF-还原酶和N5，N10-次甲基-还原酶的量和/或活性是升高的。由 于所有这些上述酶活性在微生物以及谷氨酸棒杆菌中均存在(甲酰基-THF-合成酶除外)， 因此优选地可使用内源性核酸序列来升高和/或降低本发明的微生物内且优选地谷氨酸 棒杆菌内的相应的酶活性的量和/或活性。下文将详述升高蛋白质的量和/或活性的方法。这些方法当然也适用于甲酰 基-THF-合成酶。下文将详述降低微生物内的蛋白质的量和/或活性的方法。这些方法当 然也适用于下调甲酰基-THF-脱甲酰基酶。当然，也可以使用杰氏棒杆菌的甲酰基-THF-合成酶的功能性同源物或其他上述 酶的功能性同源物。这些功能性同源物将展现出与SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2具有上述 相同性程度，并提供相同类型的酶活性。表1给出了来自不同于杰氏棒杆菌的其他生物体 的甲酰基-THF-合成酶的登录号。优选的实施方式涉及表达甲酰基THF-合成酶的谷氨酸棒杆菌微生物。本发明优 选地还涉及这些谷氨酸棒杆菌生物体在生产甲硫氨酸中的用途。这些菌株可额外地显示出 针对以下酶所讨论过的上述遗传学改造甲酰基-THF-脱甲酰基酶、N5，N1Q-次甲基-THF-环 化合成酶、N5, N10-次甲基-THF-还原酶和/或N5，Nlt1-亚甲基-THF-还原酶。可用作起始生物体的典型的谷氨酸棒杆菌菌株可以是野生菌株例如ATCC13032。不过，优选地可使用已经被遗传学修饰过以保证甲硫氨酸产生增加的起始生物体。所述生 物体可展现出DSM17323的特征，因此表现为Mkfb^homfto和metH的量和/或活性升高。优 选的起始菌株也可具有M2014的特征，并表现为ask^^homf^met^metAietY、和hskmutated 的量和/或活性升高。其他优选的起始生物体可具有0M469的特征，并表现为ask^^hom*、 metH、metA、metY、hskmutated和metF的量和/或活性升高和mcbR和metQ的量和/或活性降 低。再其他优选的起始生物体可具有GK1259的特征，并表现为ask*、hon^、metH、metA、 metY、hskmutated、tkt (和任选地g6pdh、zwfa和6pgl)和metF的量和/或活性升高和mcbR、 metQ和sda的量和/或活性降低，或可具有M2616的特征，并表现为ask "、homfbr, metH、 metA、metY、hskmutated、tkt (和任选地g6pdh、zwfa和6pgl)和metF的量和/或活性升高和 mcbR、metQ和serA的量和/或活性降低。
本发明人还发现，如果将表现为甲酰基-THF-合成酶的量和/或活性升高的上述 微生物培养在含有升高量的甲酸盐的培养基中，可进一步刺激甲硫氨酸的产生。在本发明的方法的这一实施方式中甲酸盐是有意添加至培养基至的，这一实施方 式特别优选地使用如下所述的谷氨酸棒杆菌菌株进行，所述菌株已经经遗传学修饰以表现 出甲酰基-THF-合成酶的上述活性以及其他遗传学改造。同样，优选地通过在谷氨酸棒杆 菌中表达杰氏棒杆菌的相应序列或其功能性同源物和片段来增加甲酰基-THF-合成酶的 活性。甘氨酸切割系统的量和/或活件升高的微牛物本发明在一个方面涉及微生物且优选地为谷氨酸棒杆菌，其表现出甘氨酸切割系 统的酶活性升高。本发明还涉及利用这些微生物通过培养所述微生物和任选地分离甲硫氨 酸来生产甲硫氨酸的方法。在一些工业用途中，微生物例如大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌可产生作为副产品的甘 氨酸。本发明通过提供表现出甘氨酸切割系统活性升高的微生物而利用所述副产品。微生物的甘氨酸切割系统典型地包含4至5个亚基。第一亚基是PLP-依赖性甘氨酸脱羧酶(GcvP，也简称为P-蛋白)。第二亚基是含 硫辛酰胺的氨基甲基转移酶(GcvH，也称为H-蛋白)。第三亚基是合成N5，Niq-亚甲基-THF 的酶(GcvT)。这三个因子有时被称为gcvPTH。第四亚基是NAD+-依赖性的、需FAD的硫辛 酰胺脱氢酶(lpd，也简称为L-蛋白)。相应的基因名称分别为gCVP、gCVT、gCVH和lpd。在 大肠杆菌和杰氏棒杆菌中发现了此类GCS的实例。通常，至少两种其他的多亚基酶也具有 Ipd亚基，这两种酶是丙酮酸脱氢酶和α-酮戊二酸脱氢酶。如果GCS系统的酶活性升高，超过细胞群所需的过量甘氨酸将优选地被代谢为 ΝΗ4+、CO2和N5，Nltl-亚甲基-THF，后者可用于例如增加甲硫氨酸合成。不过，某些微生物例 如谷氨酸棒杆菌缺乏天然的GCS系统。不过，此类生物体通常具有Ipd基因，其编码用于上 述两种酶系统的亚基。如下文所述，谷氨酸棒杆菌的天然Lpd蛋白能够与非天然共同起作用GCS，这样仅 需添加并表达gcvP、gcvT和gcvH基因即可在谷氨酸棒杆菌中获得活性GCS功能。然而优 选地，非天然Ipd基因也要过表达，引物该基因更能够特异性地和高效地与gcvP、gcvT和 gcvH相互作用。此外，应该注意到某些生物体的甘氨酸切割系统由5个亚基组成。例如，在枯草芽孢杆菌中，ρ-亚基例如被分为两个多肽，有时称为Pl和P2，它们被两种基因编码，有时称为 gcvPl 禾口 gcvP2。如上所述，在优选的实施方式中，本发明涉及已经被遗传学修饰而表现为甘氨酸 切割系统活性升高的微生物。可通过升高由gcvP、gCvH和gcvT编码的酶活性的量和/或活 性而获得所述升高的甘氨酸切割系统活性。下文将提及如何在谷氨酸棒杆菌中建立升高的 甘氨酸切割系统活性，而这是本发明的一个优选的实施方式。不过，本领域人员会清楚地认 识到如何在其他生物体例如大肠杆菌或杰氏棒杆菌中也获得升高的甘氨酸切割系统活性。本发明的一个方面涉及微生物，且特别是谷氨酸棒杆菌，其中与所述起始生物体 相比，通过遗传学改造而提高由gcvP、gcvH和gcvT (统称gcvPHT)编码的酶活性的量和/ 或活性。
可通过升高杰氏棒杆菌的相应的酶的量和/或活性而实现这一目的。gcvP的核酸 序列为SEQ ID NO :9，氨基酸序列为SEQ ID NO :10。Genbank登录号是CAI36361. 1。杰氏棒杆菌gcvH的核酸序列为SEQ ID NO :11，氨基酸序列为SEQ IDNO :12。 Genbank 登录号是 CAI36363. 1。杰氏棒杆菌gcvT的核酸序列为SEQ ID NO 13，氨基酸序列为SEQ IDNO :14。 Genbank 登录号是 CAI36362. 1。就本发明的目的而言，优选地可使用来自杰氏棒杆菌的上述序列。可通过单独或组合表达、特别是过表达上述序列而升高微生物特别是谷氨酸棒杆 菌内的甘氨酸切割系统的活性，其中组合是本发明的特别优选的实施方式。因此，本发明特 别涉及其中gcvPHT酶活性同时升高的谷氨酸棒杆菌微生物。可通过过表达如SEQ ID NO 9-14所示的gCVP、gCVH和gcvT的序列或其功能性片段或其功能性同源物而实现这一目的。 通过在相关数据库中进行序列同源性搜索即可容易地鉴定到gcvP、gcvH和gcvT的上述序 列的功能性同源物，并可得到其他生物体例如大肠杆菌的序列。表1给出了来自其他生物 体的这些酶的登录号。优选地使用杰氏棒杆菌的gcvP、gcvH和gcvT序列，特别是在谷氨 酸棒杆菌中使用，因为这些基因集中在一个操纵子内(Tauch et al. (2005) J. Bacteriol., 187,4671-4682)。此外，杰氏棒杆菌和谷氨酸棒杆菌的Ipd基因显示出高度的序列相同性 (见图1)。有理由认为gcvP、gcvH和gcvT因子顺利地且高效地与谷氨酸棒杆菌的Ipd相 互作用。可通过在讨论甲酰基-THF-合成酶时所提及的方法来升高微生物特别是谷氨酸棒 杆菌中的gcvP、gcvH和gcvT的量和/或活性。因此，可构建例如包含gcvP、gcvH和gcvT 的编码序列的功能单元，并通过使用例如可整合至微生物的基因组中、特别是谷氨酸棒杆 菌的基因组中的自主复制型质粒或质粒而增加包含这种单元的核酸序列的拷贝数。可选地或额外地，可以在该操纵子前面添加保证gCVP、gCVH和gcvT的编码序列进 行强转录的启动子。所述启动子可优选地选自PEFTu、PgroES> Psod> P15和λ ΡΕ启动子。原则上，不必升高Ipd因子的量和/或活性。在经遗传学操纵以升高gcvP、gcvH 和gcvT的量和/或活性的宿主微生物中，通常存在足够丰富量的该因子。不过，在本发明 的某些实施方式中，优选地也升高Ipd的量和/或活性。为此，可通过任何上述方法过表达 Ipd的内源性序列，下文将对这些方法加以详述。根据起始生物体的Ipd与从中获得gcvP、 gcvH和gcvT因子的生物体内的Ipd之间的相似性，优选地可通过增加内源性或外源性Ipd 的表达来升高Ipd的量和/或活性。为此，可优选地选择从中获得甘氨酸切割系统的其他因子的生物体内的Ipd。
因此，本发明的一个实施方式涉及微生物，所述微生物衍生自起始生物体，使得所 得到的微生物表现出gcvP、gcvH和gcvT因子的量和/或活性升高。本发明还涉及使用这 些微生物通过培养所述微生物和任选地分离甲硫氨酸而产生甲硫氨酸的方法。优选的实施方式涉及谷氨酸棒杆菌微生物，其表达如SEQ ID NO :9_14所示的杰氏 棒杆菌的gCVP、gCVH和gcvT因子或其功能性同源物和功能性片段。优选地，本发明还涉及 这些谷氨酸棒杆菌生物体在生产甲硫氨酸中的用途。可用作起始生物体的典型的谷氨酸棒杆菌菌株可以是野生菌株例如ATCC13032。 不过，优选地可使用已经被遗传学修饰过以保证甲硫氨酸产生增加的起始生物体。所述生 物体可展现出DSM17323的特征，因此表现为Mkfb^homfto和metH的量和/或活性升高。优 选的起始菌株也可具有M2014的特征，并表现为ask^^homf^met^metAietY、和hskmutatea 的量和/或活性升高。其他优选的起始生物体可具有0M469的特征，并表现为ask^^hom*、 metH、metA、metY、hskmutated和metF的量和/或活性升高和mcbR和metQ的量和/或活性降 低。本领域人员还可清楚地认识到，在涉及增加甘氨酸切割系统的所有上述实施方式 中，起始微生物，优选地上述谷氨酸棒杆菌菌株之一，进一步展现出与参与丝氨酸生物合成 途径的酶有关的遗传学修饰。术语"丝氨酸生物合成途径"是本领域所熟知的，其描述的是发生在野生型生物 体中并导致丝氨酸生物合成的一系列反应。该途径在不同生物体之间可有变化。有关生物 体特异性途径的详情可参考教科书和以下网页所列科技文献:http://www. Renome. ip。丝氨酸是从糖酵解的中间体3-磷酸甘油酯合成而来的，后者首先被3-磷酸甘油 酸脱氢酶(SerA)的作用氧化为磷酸羟基丙酮酸。在第二个步骤中，磷酸丝氨酸氨基转移酶 (SerC)催化磷酸羟基丙酮酸发生转氨基作用，导致形成磷酸丝氨酸，后者随后被磷酸丝氨 酸磷酸酶(SerB)脱磷酸，产生L-丝氨酸。L-丝氨酸可被丝氨酸脱水酶(sdaA)转化为丙酮 酸以及被丝氨酸羟甲基转移酶(SHMT或glyA)转化为甘氨酸和亚甲基四氢叶酸。就本发明的目的而言，起始生物体除了目的在于引入改善的甘氨酸切割系统并保 证硫辛酸和/或硫辛酰胺的利用得以改善的上述遗传学修饰之外，其选自如下一组的酶的 量和/或活性是升高的D-3-磷酸甘油酸脱氢酶(SerA)、磷酸丝氨酸磷酸酶(SerB)、磷酸 丝氨酸氨基转移酶(SerC)和丝氨酸羟甲基转移酶(SHMT)。可选地或额外地，丝氨酸脱氨 酶(SdaA)的量和/或活性可以是降低的。表1给出了丝氨酸生物合成途径的上述酶的序 列的实例。因此，优选的起始菌株例如可具有0M264C的特征，并表现为ask "、homfbr, metH、 metA、metY、和hskmutated的量和/或活性升高和serA的量和/或活性降低。另一种用于产 生甲硫氨酸的优选的起始菌株可具有GK1259的特征，并表现为ask*、hom^, metH、metA、 metY、hskmutated、metF、tkt、tal、zwf 和 6pgl 的量和 / 或活性升高和 mcbR、metQ 和 sda 的量 和/或活性降低。当然，这些微生物可特别优选地用于本发明的方法中，以生产甲硫氨酸。本发明人还发现，可在表现为甘氨酸切割系统活性升高的上述微生物中增加N5， Niq-亚甲基-THF和甲硫氨酸的生产，条件是所述微生物(i)被提供了外来的硫辛酸和/或硫辛酰胺和/或(ii)进一步被遗传学修饰使得与起始生物体相比产生更多的硫辛酸和/ 或硫辛酰胺。因此，本发明的一个方面涉及如下方法，该方法利用上述微生物，所述微生物表现 为甘氨酸切割系统的gcvP、gCvH和gcvT因子(和任选地Ipd因子)的量和/或活性升高， 并被培养在含有增加量的硫辛酸和/或硫辛酰胺的培养基中。为实现本发明的这一方面的 目的，添加至培养基中的硫辛酸和/或硫辛酰胺的终浓度可达到至少大约0. lmg/L,至少大 约lmg/ml，和优选地至少大约10mg/L。
本领域人员已知，在某些生物体中，硫辛酰胺，有时称为硫辛酰胺(lipoic acid amide)，可替代硫辛酸用于酶的硫辛酰化(Reed, L. J. et al. (1958) J. Biol. Chem. 232， 143-158)。因此，在本发明中，可采用硫辛酰胺补料来替代在此所述的硫辛酸补料。换言 之，可从硫辛酸的提供商处购得各种形式的硫辛酰胺(例如，Sigma-Aldrich产品目录号T 5875、T 5625、T 1395、T8260)，它们也可用于本发明的方法的生物体中以刺激或增加甘氨 酸切割活性。可以使用这两类化合物的氧化形式和还原形式及其各种盐和酯。因此，硫辛 酰基可有不同来源。本发明的方法的这一实施方式有意地在培养基中添加硫辛酸和/或硫辛酰胺，特 别优选地使用经遗传学修饰后展现出甘氨酸切割系统的gcvP、gcvH和gcvT因子活性的谷 氨酸棒杆菌菌株进行这一实施方式。同样，优选地通过在谷氨酸棒杆菌中表达杰氏棒杆菌 的相应的序列或其功能性同源物和片段而升高甘氨酸切割系统的活性。在本发明这一方面 的进一步具体情况中，可通过使用内源性谷氨酸棒杆菌序列或外源性序列(见表1)来升高 Ipd因子的量和/或活性。同样，在谷氨酸棒杆菌中，培养基中的硫辛酸和/或硫辛酰胺的终浓度为至少大 约0. lmg/L，至少大约lmg/L，和优选地至少大约10mg/L。本发明的微生物因gcvP、gcvH和gcvT因子的量和/或活性升高而表现出甘氨酸 切割系统的活性升高，可进一步对所述微生物进行遗传学修饰以升高其内部合成的硫辛酸 和/或硫辛酰胺的量。有两种不同途径来利用硫辛酸并将其连接于靶蛋白。在大肠杆菌中，这两种途径 被称为 IplA 依赖性途径和 IipB 依赖性途径(Morris et al. (1995) J. Bacteriol.，177， 1-10)。IplA基因编码硫辛酰合成酶(LplA蛋白)。该酶利用ATP活化硫辛酸，随后将硫 辛酰-AMP附着于gcvH。IipB 依赖性途径包含两种酶(Morris et al. (1995) J. Bacteriol.，177，1-10)。 LipA编码硫辛酸合酶(LipA蛋白)。IipB基因编码硫辛酰转移酶(LipB蛋白)。LipA将辛 酰-ACP转化为硫辛酰-ACP。第二步，IipB将硫辛酰部分附着于gcvH和其他硫辛酰化蛋白 质的硫辛酰结构域。因此，IplA的量和/或活性升高允许外源添加的硫辛酸更好地掺入，而IipA和/ 或IipB的量、类型和/或活性增加可升高转移至GcvH的内部合成的硫辛酸的量。大肠杆菌的IplA的核酸序列为SEQ ID NO 15，氨基酸序列为SEQ IDNO :16， Genbank 登录号是 EGl 1796。杰氏棒杆菌的IipA的编码序列为SEQ ID NO :17，氨基酸序列为SEQ IDNO :18，Genbank 登录号是 GeneID :3433570。杰氏棒杆菌的IipB的核酸序列为SEQ ID NO :19，氨基酸序列为SEQ IDNO :20， Genbank 登录号是 GeneID :3433571。就本发明的目的而言，优选地使用来自杰氏棒杆菌的上述序列。
因此，可通过升高IplA的量和/或活性，使得表现为甘氨酸切割系统因子gcvP、 gcvH和gcvT的量和/或活性升高的本发明的微生物在N5，Niq-亚甲基-THF和甲硫氨酸合 成方面被进一步优化。为此，可通过利用SEQ IDNO 15或其功能性同源物和片段而增加IplA的表达。所述微生物将显示出外部 添加的硫辛酸和/或硫辛酰胺被更好地掺入，因此特别适合于本发明的那些将所述微生物 培养在补充了硫辛酸和/或硫辛酰胺的培养基中的方法。在另一优选的实施方式中，本发明涉及如下微生物，所述微生物除了甘氨酸切割 系统因子gcvP、gcvH和gcvT的量和/或活性升高之外，还表现出1 ipA、1 ipB或1 ipA和1 ipB 的量和/或活性升高。除了 gCVP、gCVH和gcvT的量和/或活性升高之外还表现出IipA和 IipB的量和/或活性升高的微生物是特别优选的。这些微生物可更好地形成和适应内源性 合成的硫辛酸和/或硫辛酰胺，因此有助于产生N5，Nltl-亚甲基-THF和甲硫氨酸。当然，这些微生物也可用于本发明的方法，所述方法涉及在补充了硫辛酸和/或 硫辛酰胺的培养基中培养具有升高的甘氨酸切割系统活性的遗传学修饰的生物体。在这一 方面的进一步的情况中，可产生和使用如下微生物，所述微生物除了 gcvP、gcvH和gcvT的 量和/或活性升高之外还显示出lplA、IipA和IipB的量和/或活性升高。本发明的一个特别优选的实施方式同样也涉及谷氨酸棒杆菌微生物，其中通过对 起始谷氨酸棒杆菌生物体进行遗传学修饰，该微生物通过被遗传学修饰以便表现出lplA、 IipA和/或IipB的量和/或活性升高而表现出甘氨酸切割系统因子gcvP、gcvH和gcvT 的量和/或活性升高，并表现出对外部提供的硫辛酸和/或硫辛酰胺的改善的适应性，和/ 或表现出对内部产生的硫辛酸和/或硫辛酰胺的改善的形成和适应性。因此，本发明的优 选的实施方式涉及谷氨酸棒杆菌微生物，其与所述起始生物体相比，gcvP、gcvH和gcvT和 IplA的量和/或活性是升高的。在另一个同样优选的实施方式中，所述谷氨酸棒杆菌微生 物表现为gcvP、gcvH和gcvT和IipA或IipB的量和/或活性升高。更加优选的谷氨酸棒 杆菌微生物表现为gcvP、gcvH和gcvT、IipA和IipB的量和/或活性升高。特别优选的谷 氨酸棒杆菌微生物表现为gcvP、gcvH和gcvT、lpl、IipA和IipB的量和/或活性升高。本领域人员理解用于引入上述遗传学修饰的谷氨酸棒杆菌起始生物体可以是野 生菌株例如ATCC13032。不过，优选地可使用已经被遗传学修饰以保证起始甲硫氨酸产生增 加的生物体。该生物体可表现出DSM17323的特征，因此表现为ask·、homfbr和metH的量 和/或活性升高。优选的起始菌株还可表现出M2014的特征，并表现为ask^^hon/^metH、 metA、metY、和hskmutated的量和/或活性升高。其他优选的起始生物体可表现出0M469的特 征，并表现为 askfto、homfto、metH、metA、metY、hskmutated 和 metF 的量和 / 或活性升高和 mcbR 和metQ的量和/或活性降低。本领域人员还清楚地知晓，在涉及甘氨酸切割系统增强和硫辛酸和/或硫辛酰胺 的摄取、形成和适应性得以改善的所有上述实施方式中，起始微生物，其优选地是上述谷氨 酸棒杆菌菌株，具有对参与上述丝氨酸生物合成途径的酶的进一步遗传学修饰。
因此，优选的起始菌株可具有0M264C的特征，并表现为ask^^homf^metlmetA、 metY、和hsk—d的量和/或活性升高和serA的量和/或活性降低。另一种优选的起始 菌株可具有 GK1259 的特征，并表现为 askfbr、homfto、metH、metA、metY、hskmutated、metF、tkt、 tal、zwf和6pgl的量和/或活性升高和mcbR、metQ和sda的量和/或活性降低。
-THF-/ 細牛本发明的另一优选的实施方式涉及如下微生物，其组合了上述生物体的特征，即 升高的甲酰基-THF-合成酶的量和/或活性和升高的甘氨酸切割系统活性。应该理解，上 述特别优选的实施方式也被组合用于本发明的这一方面。因此，本发明的微生物将被遗传学修饰，使得其表现为甲酰基-THF-合成酶、 gcvP、gcvH和gcvT的量和/或活性升高。在另一优选的实施方式中，微生物将被进一步遗传学修饰以表现为IplA的量和/ 或活性升高。本发明优选的实施方式还涉及表现为甲酰基-THF-合成酶、gCVP、gCVH和gcvT和 IipA或IipB的活性升高的微生物。更加优选的是表现为甲酰基-THF-合成酶、gCVP、gCVH 和gcvT、IipA和IipB的量和/或活性升高的微生物。另一优选的实施方式涉及表现为甲酰基-THF-合成酶、gCVP、gCVH和gcvT、lplA、 IipA和IipB的量和/或活性升高的微生物。所述微生物当然还可以表现为Ipd的量和/或活性升高。可以理解上述实施方式优先在谷氨酸棒杆菌微生物上实现。该谷氨酸棒杆菌菌株 可以是野生菌株例如ATCC13032。不过，优选地可使用已经被遗传学修饰过以保证甲硫氨酸 产生增加的起始生物体。所述生物体可展现出DSM17323的特征，因此表现为ask*、Komfbr 和metH的量和/或活性升高。优选的起始菌株也可具有M2014的特征，并表现为ask*、 hon^、metH、metA、metY、和hskmutated的量和/或活性升高。其他优选的起始生物体可具有 0M469 的特征，并表现为 ask^^hom^^metHietA，、metY、hskmutated 和 metF 的量和 / 或活性 升高和mcbR和metQ的量和/或活性降低，或所述起始生物体可具有M2616的特征，并表现 为 askfbr、homftr、metH、metA、metY、hskmutated、tkt (和任选地 g6pdh、zwfa 和 6pgl)和 metF 的量和/或活性升高和mcbR、metQ和serA的量和/或活性降低。本领域人员还清楚地知晓，在涉及甘氨酸切割系统增强和硫辛酸和/或硫辛酰胺 的摄取、形成和适应性得以改善的所有上述实施方式中，起始微生物，其优选地是上述谷氨 酸棒杆菌菌株，具有对参与上述丝氨酸生物合成途径的酶和/或参与甲酰基代谢的酶例如 甲酰基-THF-脱甲酰基酶、N5, N10-次甲基-THF-环化合成酶、N5, N10-次甲基-THF-还原酶 和/或N5，Nltl-亚甲基-THF-还原酶的进一步遗传学修饰。因此，优选的起始菌株可具有0M264C的特征，并表现为ask^^hon^、metH、metA、 metY、和hsk—d的量和/或活性升高和serA的量和/或活性降低。另一种优选的起始 菌株可具有 GK1259 的特征，并表现为 askfbr、homfto、metH、metA、metY、hskmutated、metF、tkt、 tal、zwf和6pgl的量和/或活性升高和mcbR、metQ和sda的量和/或活性降低。为了升高上述酶的量和/或活性，可根据相应的起始微生物是否提供所需的活性 而决定是依赖编码这些酶的内源性核酸序列还是使用外源性序列。对于谷氨酸棒杆菌微生物，优选地使用杰氏棒杆菌的编码序列来升高甲酰基-THF-合成酶、gcvP、gcvH和gcvT、lplA、lipA、IipA和/或Ipd的量和/或活性。这些 酶的序列见SEQ ID NO :1和2以及9至20。本领域人员当然知晓也可使用编码上述序列号 (SEQ ID NO)的功能性同源物或片段的序列。此类功能性同源物可包括其他来源的序列，例 如大肠杆菌的序列。表1通过引用Genbank登录号的方式给出了可以使用的序列的总体情
况。 本发明的微生物且特别是谷氨酸棒杆菌微生物可用于通过培养和任选地分离甲 硫氨酸而生产甲硫氨酸。如上所述，修饰的生物体可培养在补充了增加量的甲酸盐和硫辛 酸和/或硫辛酰胺的培养基中。下表给出了前面详细讨论过的一些酶的总体情况。所引用的Genbank登录号可参 见一下网页:http//www, ncbi. nlm. nih. rov/。
上述登录号是Genbank的官方登录号或等同于具有Genbank交叉引用号的登录 号。可在http: //www, ncbi. nlm. nih. gov/捭索到这胜编号。下文从总体上描述如何升高和降低谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌的多肽和基因的量 和/或活性。不过，本领域人员知晓其他的技术和方法可用于通过进行合适的数据库搜索 来鉴定表1的酶的新的同源物和/或用于改变这些酶在棒状杆菌或埃希氏菌属的细菌之外 的生物体中的表达。量和/或活件的升高或引入就升高量而言，可区分两种基本的情况。在第一种情况中，通过表达相应蛋白质的 外源性形式而升高酶的量。在另一情况中，通过影响例如启动子和/或增强子元件的活性， 和/或通过影响在转录、翻译或翻译后水平调节相应蛋白质的活性的其他调节活性，而升 高内源性蛋白质的表达。因此，可通过不同途径升高蛋白质的活性和量，例如，通过在转录、翻译和蛋白质 水平关闭抑制性调节机制，或通过与起始生物体相比，升高编码这些蛋白质的核酸的基因 表达，后者例如可通过强启动子诱导内源性转酮醇酶和/或通过引入编码转酮醇酶的核酸 而实现。在一个实施方式中，通过将编码表1的酶的核酸引入微生物例如谷氨酸棒杆菌和 大肠杆菌而升高表1的酶的量和/或活性。原则上，可使用任何具有表1所列蛋白质酶活性的不同生物体的蛋白质。对于含 有内含子的真核生物来源的此类酶的基因组核酸序列，如果宿主生物体不能剪接相应的 mRNA或无法使之能够剪接相应的mRNA，则可使用已经加工过的核酸序列例如相应的cDNA。 本说明书所提及的所有核酸可以是例如RNA、DNA或cDNA序列。根据本发明，升高或引入蛋白质的量通常包括如下步骤a)产生载体，其从5' -3'方向包含如下核酸序列，优选为DNA序列
_在本发明的生物体中有功能的启动子序列-与所述启动子可操纵地连接的编码蛋白质的DNA序列，所述蛋白质例如为表1的 蛋白质、其功能性同源物、功能性片段或功能性突变体_任选地，在本发明的生物体中有功能的终止序列b)将步骤a)的载体转移至本发明的生物体内，例如谷氨酸棒杆菌，且任选地，整合至相应基因组内。
如上所述，功能性片段涉及编码例如表1的酶的核酸序列的片段，其表达仍然产 生具有与相应的全长蛋白质基本上相似的酶活性的蛋白质。上述方法可用于增加编码例如表1的酶或其功能性片段的DNA序列的表达。此类 包含调节序列如启动子和终止序列的载体的使用是本领域人员已知的。此外，本领域人员 知晓如何将来自步骤a)的载体转移至生物体例如谷氨酸棒杆菌或大肠杆菌，以及载体需 要具有何种特性才能整合至所述生物体的基因组中。如果是通过转移编码来自一种生物体如大肠杆菌的酶的核酸来升高另一种生物 体例如谷氨酸棒杆菌内的酶含量，在转移例如由来自大肠杆菌的核酸序列所编码的氨基酸 序列时，建议通过将多肽序列根据遗传密码子逆翻译为主要包含因生物体特异性密码子使 用而更多使用的密码子的核酸序列。可通过使用计算机分析有关生物体的其他已知的基因 而确定其密码子使用。根据本发明，升高编码表1的酶的核酸的基因表达也被理解为是操纵生物体特别 是谷氨酸棒杆菌内的相应的内源性酶的表达。例如，可通过改变编码这些酶的基因的启动 子DNA序列而实现这一目的。可通过强启动子置换和通过DNA序列缺失和/或插入而实现 这种改变，并引起这些酶的表达率发生改变，优选地为升高。内源性基因的启动子序列的改变通常引起基因表达量的改变，因此细胞或生物体 内可检测到的活性也发生改变。此外，可通过调节蛋白实现内源性基因表达的改变和升高，所述调节蛋白在转 化的生物体内不存在或已经被缺失，且所述调节蛋白与这些基因的启动子相互作用。所 述调节物可以是由DNA结合结构域和转录激活物结构域组成的嵌合蛋白，例如参见WO 96/06166。升高内源性基因的活性和含量的其他可能性是上调参与内源性基因的转录的转 录因子，例如通过过表达。过表达转录因子的措施是本领域人员已知的。可通过表达与这些基因的启动子序列特异性结合的适体而调节内源性酶例如表1 所述的那些酶的表达。根据适体结合刺激性或阻抑性启动子区域，可例如增加表1的酶的量。此外，通过对内源性基因拷贝进行定点诱变可改变内源性基因的活性。还可通过影响酶的翻译后修饰来改变编码例如表1的酶的内源性基因。例如，可 通过相应的措施例如过表达或基因沉默，通过调节参与酶的翻译后修饰的酶例如激酶或磷 酸酶的活性而实现这一目的。在另一实施方式中，可以改进酶的功效或破坏其别构调节区域，以便阻止对化合 物产生的反馈抑制。类似地，可使降解酶缺失或通过取代、缺失或添加对其进行修饰，使得 其对表1中的所需酶的降解活性降低，而不损害细胞的活力。在各种情况中，可以提高甲硫 氨酸的总体产率、产生速度或量。上述这些用于升高或引入表1的酶的量和/或活性的策略并非是限制性的；对这 些策略加以改动对本领域人员而言将是显而易见的。降低酶的量和/或活件前面已经阐述了可优选地使用已经为产生甲硫氨酸而被遗传工程化的起始生物体。例如，对于谷氨酸棒杆菌，可下调metQ的活性。
对于降低酶的量和/或活性，也有各种不同的策略。对于内源性酶例如表1的那些酶，例如可通过表达特异性结合这些基因的启动子 序列的适体而调节其表达。根据适体结合刺激性或阻抑性启动子区域，可降低表1的酶的 量以及活性。适体也可被设计为能够特异性结合酶本身，并例如通过结合相应的酶的催化中心 而降低酶的活性。适体的表达通常是通过基于载体的过表达而实现的(见上)，这一点以及 适体的设计和选择均是本领域人员所熟知的(Famuloket al.，(1999)Curr Top Microbiol Immunol. ，243，123—36)。此外，可通过本领域人员熟知的各种实验方法来降低表1的内源性酶的量和活 性。这些方法通常被称为"基因沉默"。例如，可通过将前述的含有反义顺序的编码所述 酶或其部分的DNA序列的载体转移至生物体如谷氨酸棒杆菌中而使得内源性基因的表达 沉默。这是基于如下事实，即这种载体在细胞内的转录可产生能够与从内源性基因转录而 来的mRNA相杂交的RNA，并由此阻止其翻译。原则上，反义策略可与核酶方法联合。核酶是具有催化活性的RNA序列，当与 反义序列联合时，其催化切割靶序列(Tanner et al. (1999)FEMSMicrobiol Rev. 23(3) 257-75)。这可增强反义策略的效力。为了产生同源重组微生物，制备含有编码表1的酶的基因的至少一部分的载体， 其中已经引入了缺失、添加或取代，由此改变(例如功能性破坏)所述内源性基因。在一个实施方式中，所述载体被设计为使得在同源重组后，所述内源性基因被功 能性破坏(即不再编码功能性的蛋白质)。或者，所述载体被设计为使得在同源重组后，所 述内源性基因被突变或被改变，但仍然编码功能性的蛋白质，例如可改变上游调节区域以 便改变表1的内源性酶的表达。该方法的优势在于酶的表达不被完全消除，而是降低至所 需的最低水平。本领域人员知晓哪些载体可用于置换或缺失内源性序列。下文给出了破坏 谷氨酸棒杆菌的染色体序列的详细说明。此外，通过降低转录因子的量可实现基因阻抑。也可向细胞中引入抑制靶蛋白本身的因子。蛋白质结合因子可以是例如前述的适 体(Famulok et al.，(1999)Curr Top Microbiol Immunol. 243，123-36)。可考虑将酶特异性抗体作为蛋白质结合因子，其表达可降低表1的酶的量和/ 或活性。重组的酶特异性抗体例如单链抗体是本领域已知的。文献也描述了抗体的表达 (Fiedler et al.，(1997)Immunotechnology 3，205-216 ；Maynardand Georgiou(2000) Annu. Rev. Biomed. Eng. 2，339-76)。本领域人员熟知上述技术。因此，本领域人员也熟知用于例如反义方法的核酸构 建体必须具有的大小，以及相应的核酸序列必须具有怎样的互补性、同源性或相同性。术语 互补性、同源性和相同性是本领域人员已知的。术语互补性描述的是核酸分子与另一核酸分子通过两种互补碱基之间的氢键而 杂交的能力。本领域人员已知两种核酸分子为了能够彼此杂交并不需要一定具有100%的 互补性。能够与另一种核酸序列杂交的核酸序列与所述另一种核酸序列的互补性分别为优 选地至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、优选地至少70%、特别优选地至少80%、更特别优选地至少90%、尤其优选地至少95%和最优选地至少98或100%。反义序列与内源性mRNA序列的杂交典型地在体内细胞条件下发生或在体外发生。根据本发明，杂交在足以保证发生特异性杂交的严格性条件下在体内或体外进行。严格性体外杂交条件是本领域人员已知的，并可自文献获知(见例如Sambrook et al. , Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Press (2001))。术语〃特异性杂交〃指的 是如下情况，即在严格性条件下，分子优先与特定核酸序列结合，而该核酸序列是复杂的混 合物如DNA或RNA分子的混合物的一部分。因此，术语"严格性条件"指的是，在该条件下，核酸序列优先与靶序列结合，而 与其他序列不结合或至少结合程度明显降低。严格性条件取决于一些条件。较长的序列在更高温度发生杂交。通常，选择的严格 性条件能够使得在给定的离子强度和给定PH值时，杂交温度比解链温度(Tm)低大约5°C。 Tm是(在给定pH值、离子强度和给定核酸浓度条件下)与靶序列互补的分子中的50%与 所述靶序列杂交时的温度。典型地，严格性条件包括0.01至1.0M钠离子(或其他盐的离 子)之间的盐浓度以及PH值在7. 0至8. 3之间。对于短分子(例如对于包含10至50个 核苷酸之间的分子)，该温度为至少30°C。此外，严格性条件可包括加入去稳定剂，如甲酰 胺。典型的杂交和洗涤缓冲液具有如下组成。预杂交溶液0.5% SDS5x SSC50mM NaPO4, pH 6. 80.1% Na-焦磷酸盐5x 登哈特试剂(Denhardt' s reagent)100 μ g 鲑精杂交溶液预杂交溶液lxl06cpm/mL 探针(5-10 分钟 95°C )20x SSC 3M NaCl0. 3M柠檬酸钠以 HCl 调至 pH750x 登哈特试剂5g Ficoll5g聚乙烯吡咯烷酮5g牛血清白蛋白加蒸馏水至500mL典型的杂交程序如下任选以 Ix SSC/0. 1 % SDS 洗涤膜 30 分钟，65°C预杂交至少2h，50_55°C杂交55_60°C过夜洗涤5 分钟 2x SSC/0. 1 % SDS杂交温度30 分钟 2x SSC/0. SDS
杂交温度30 分钟 Ix SSC/0. SDS杂交温度 45 分钟 0. 2x SSC/0. SDS 65 °C5 分钟 0. Ix SSC室温以反义为目的，互补性序列长度超过100个核苷酸、80个核苷酸、60个核苷酸、40
个核苷酸、和20个核苷酸即可以是足够的。更长的核苷酸长度当然也是足够的。上述方法 的组合应用也是可以的。根据本发明，如果使用以5' -3'-方向可操纵地连接于在生物体内有活性的启 动子的DNA序列，则通常所构建的载体在转移到所述生物体的细胞内之后，可实现编码序 列的过表达，或分别引起内源性核酸序列的抑制或竞争和阻断由其表达的蛋白质。也可通过在生物体内过表达其非功能性突变体而降低特定酶的活性。因此，不能 催化有关反应、但能够结合例如底物或辅因子的非功能性突变体，在过表达后，可与内源性 酶竞争并抑制反应。降低宿主细胞内酶的量和/或活性的其他方法是本领域人员已知的。根据本发明，非功能性酶分别具有与功能性酶及其功能性片段基本上相同的核酸 序列和氨基酸序列，但在一些位置具有核酸或氨基酸的点突变、插入或缺失，其效果是所述 非功能性酶不能或仅能非常有限地催化相应的反应。不能将这些非功能性酶与那些仍然能 够催化相应的反应但不再受到反馈调节的酶相混。根据本发明，术语“非功能性酶"不包括 那些分别在氨基酸水平和核酸水平与相应的功能性酶不具有明显序列同源性的蛋白质。因 此，根据定义，不能催化相应的反应且与相应的酶不具有明显序列同源性的蛋白质不是本 发明的术语“非功能性酶”。在本发明的范围内，非功能性酶也被称为失活的或无活性的酶。因此，例如表1的携带上述点突变、插入和/或缺失的本发明的非功能性酶的特征 在于其与例如表1的本发明的野生型酶或其功能性等价部分具有明显的序列同源性。为了 确定明显的序列同源性，可适用前述的相同性等级。载体和宿主细胞本发明的一个方面涉及载体，优选地是表达载体，其含有如上所述的修饰的核酸 序列。在本发明中，术语"载体"指的是核酸分子，其能够转运与其相连接的其他核酸。一种类型的载体是"质粒"，其指的是一种环状双链DNA环，其中可连接额外的 DNA区段。另一种类型的载体是病毒载体，其中可将额外的DNA区段连接到病毒基因组内。某些载体在所引入的宿主细胞中能够自我复制(例如具有细菌复制起始点的细 菌载体和附加型哺乳动物细胞载体)。其他载体(例如非附加型哺乳动物细胞载体)在引 入宿主细胞后整合到宿主基因组中，并随着宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导 与其可操纵地连接的基因的表达。此类载体在此称为〃表达载体〃。通常，重组DNA技术所用的表达载体一般是质粒的形式。在本说明书中，“质粒" 和"载体"可互换使用，因为质粒是最为常用的载体形式。不过，本发明也包括其他形式的 表达载体，例如病毒载体(如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)，它们可发挥 相同的功能。本发明的重组表达载体可包含如上所述的修饰的核酸，其形式适合于在宿主细胞中表达相应的核酸，这意味着所述重组表达载体包括可操纵地连接于待表达核酸序列的一 或多个基于进行表达所用的宿主细胞而选择的调节序列。在重组表达载体中，“可操纵地连接"指的是感兴趣的核酸序列与调节序列连 接的方式允许所述核酸序列被表达(例如在体外的转录/翻译系统或在载体所引入到的 宿主细胞内)。术语"调节序列"意欲包括启动子、阻抑物结合位点、活化物结合位点、增 强子和其他表达控制元件(如终止子、腺苷酸化信号、或mRNA 二级结构的其他元件)。此 类调节序列例如可参见 Goeddel ；Gene Expression Technology :Methods in Enzymology 185，Academic Press, SanDiego, CA (1990)。调节序列包括那些在许多宿主细胞类型中指导 核酸序列组成型表达的调节序列以及那些仅在特定宿主细胞中指导核酸序列表达的调节 序列。优选的调节序列例如为，启动子如cos-、tac-、trp-、tet-、trp-、tet-、Ipp-, lac-、 lpp-lac-> lacIq-> I7_、T5_、T3_、gal_、trc_、ara-> SP6_、arny>λ λ Pl、噬菌体 SPOl P15、噬菌体 SPOl P26, pSOD、EFTu, EFTs, GroEL, metZ (最后 5 种来自谷 氨酸棒杆菌)，它们优选地在细菌中使用。额外的调节序列例如为，来自于酵母和真菌的启 动子，如 ADCl、MFa、AC、P-60、CYCU GAPDH, TEF, rp28、ADH，ΕΝ02、来自于植物的启动子，如 CaMV/35S、SSU、OCS、lib4、usp、STLS1、B33、nos或遍在蛋白-或菜豆蛋白-启动子。也可 以使用人工启动子。本领域人员能够理解，表达载体的设计取决于一些因素，例如所选择的 待转化的宿主细胞、蛋白质的期望表达水平等等。本发明的表达载体可被引入到宿主细胞 中以便产生由上述修饰的核酸序列所编码的蛋白质或肽，包括融合蛋白或融合肽。在原核细胞中表达蛋白质最常见地是使用含有指导融合蛋白或非融合蛋白的表 达的组成型或诱导型启动子而进行。融合载体给其中所编码的蛋白质添加一些氨基酸，通常是在重组蛋白质的氨基 端，但也可以在C端或融合于蛋白质内部的合适区域。此类融合载体典型地用于4个目的 1)增加重组蛋白质的表达；2)增加重组蛋白质的可溶性；3)通过在亲和纯化中作为配体而 有助于重组蛋白质的纯化；和4)提供“标签”用于蛋白质的后续检测。在融合表达载体中， 通常在融合部分与重组蛋白质的连接处引入蛋白酶切割位点，以便在融合蛋白被纯化后使 重组蛋白质与融合部分分离。此类酶及其同种识别序列(cognate recognitionsequences) 包括Xa因子、凝血酶和肠激酶。典型的融合表达载体包括pGEX (Pharmacia Biotech Inc ；Smith, D.B.andjohnson, K.S. (1988)Gene 67:31_40)、pMAL(New England Biolabs, Beverly, MA) 和pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ)，它们分别融合谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E 结合蛋白、或蛋白A。合适的诱导型非融合大肠杆菌表达载体的实例包括pTrc (Amarm et al. (1988) Gene 69 :301_315)、pLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pR印4、pHSl、pHS2、 pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-111113-Bl、egtll、pBdCl、和 pET lld(Studier et al. , GeneExpression Technology :Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California(1990)60-89 ；Pouwels et al. , eds. (1985)Cloning Vectors. Elsevier :New York ISBN 0444904018)。来自pTrc载体的靶基因表达依赖于宿主RNA聚 合酶自杂交trp-lac融合启动子转录。来自pET Ild载体的靶基因表达依赖于由共表达的 病毒RNA聚合酶(T7gnl)介导的自T7gnl0-laC融合启动子的转录。该病毒聚合酶由宿主菌株BL21(DE3)或HMS174(DE3)从携带置于IacUV 5启动子转录控制下的T7gnl基因的常驻 X原噬菌体提供。对于其他种类细菌的转化，可选择合适的载体。例如，已知质粒PIJ101、 PIJ364、pIJ702和pIJ361可用于转化链霉菌，而质粒pUBllO、pC194、或pBD214适合用于 转化芽孢杆菌。一些用于将遗传信息转移至棒杆菌内的质粒包括PHM1519、pBLl、pSA77、 ^pAJ667(Pouwels et al. , eds. (1985) CloningVectors. Elsevier :New York IBSN O 444 904018)。 合适的谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌穿梭载体的实例例如为 pClik5aMCS (W02005059093)或可参见 Eikmanns et al (Gene. (1991) 102,93-8)。用于操作棒状杆菌的合适的载体的实例可参见Handbook ofCorynebacterium(Eggeling 和 Bott 编辑，ISBN 0-8493-1821-1，2005)。其中可找到一 系列大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭载体(表23. 1)、一系列大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭表 达载体(表23. 2)、一系列可用于将DNA整合至谷氨酸棒杆菌染色体内的载体(表23. 3)、 一系列用于整合至谷氨酸棒杆菌染色体内的表达载体(表23. 4.)、以及一系列用于定点整 合至谷氨酸棒杆菌染色体内的载体(表23. 6)。在另一个实施方式中，蛋白质表达载体是酵母表达载体。用于在酵母(酿酒酵 母)中表达的载体的实例包括 pY印Secl(Baldari，et al. (1987) Embo J. 6 :229_234)、2i、 pAG-1、Y印6、Y印 13、pEMBLYe23、pMFa(Kurjan andHerskowitz (1982) Cell 30 :933_943)、 pJRY88(Schultz et al. (1987)Gene 54 :113—123)、禾口 pYES2(Invitrogen Corporation, San Diego，CA)。用于构建适合用于其他真菌例如丝状真菌中的载体的载体和方法可详见， 例如 van denHondel, C. Α· Μ· J. J. & Punt, P. J. (1991) in :Applied Molecular Genetics ofFungi,J. F. Peberdy,et al. ,eds. ,p. 1-28,Cambridge University Press :Cambridge禾口 Pouwels et al.，eds. (1985)Cloning Vectors. Elsevier :New York(ISBN O 444904018)。就本发明的目的而言，可操纵的连接应理解为启动子、编码序列、终止子和任选地 其他调节元件被依次排列，使得在表达编码序列时，每一元件根据其目的可实现其功能。既用于原核细胞也用于真核细胞的其他合适的表达系统可参见Sambrook，J. et al. Molecular Cloning :A Laboratory Manual. 3rd ed. , Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2003 的 16 和 17 章。可通过常规的转化或转染技术将载体DNA引入原核细胞。在本发明中，术语" 转化"和"转染"、“接合(conjugation)“和"转导"指的是用于将外来核酸(例 如线性DNA或RNA，例如线性化的载体或无载体的基因构建体本身)或载体形式的核 酸(例如质粒、噬菌体、噬粒、噬菌粒、转座子或其他DNA)引入宿主细胞内的多种现有 技术中已知的技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖-介导的转染、脂染、天 然感受态、化合物介导的转移、或电穿孔。合适的转化或转染宿主细胞的方法可参见 Sambrook，et al. (Molecular Cloning :A Laboratory Manual. 3rd ed.，Cold Spring HarborLaboratory， Cold Spring Harbor Laboratory Press， Cold Spring Harbor， NY, 2003)以及其他实验室手册。为了鉴定并选择这些整合体，通常将编码选择标记物(如抗生素抗性)的基因随 感兴趣的基因一起引入宿主细胞。优选的选择标记物包括那些赋予药物抗性的标记物，所 述药物例如，但不限于，G418、潮霉素、卡那霉素、四环素、新霉素、氨苄青霉素(和其他青霉素)、头孢菌素、氟喹诺酮、萘啶酸、氯霉素、壮观霉素、红霉素、链霉素和甲氨蝶呤。其他选 择性标记物包括可对宿主或起始菌株内的突变形式的相应基因构成互补的野生型基因。例 如，可突变或缺失如上所述的本发明的谷氨酸棒杆菌起始或宿主菌株的基因组中的对于在 基本培养基中生长所必需的基因，例如serA，以产生丝氨酸营养缺陷体。然后可使用含有野 生型或其他功能性拷贝的serA基因的载体来筛选转化体或整合体。可使用编码上述修饰 的核酸序列的同一载体或使用分开的载体将编码选择性标记物的核酸引入宿主细胞。稳定 转染了引入的核酸的细胞可通过药物筛选得以鉴定(例如，已经引入了选择性标记物基因 的细胞能够存活，但其他细胞则会死亡)。
当使用无复制起点的质粒和两种不同的标记物基因(例如pClik int sacB)时， 也可产生无标记物的菌株，其中插入体的一部分被插入至基因组内。为此可采用两个连 ^Μ^ΗΜΜ^ ^- ^ ( iii#jAL Becker et al. , Applied andEnvironmental Microbilogy, 71 (12)，p. 8587-8596)。质粒 pClik int sacB 的序列见 W02005059093 ;SEQ ID 24 ；该质粒 在该文献中称为PCIS。在另一个实施方式中，可产生含有如下的选定系统的重组微生物，所述选定系统 能够允许所引入的基因的受控表达。例如，将载体中的上述核酸序列之一置于Iac操纵子 的控制下，这允许仅当存在IPTG的情况下基因发生表达。此类调控系统是本领域熟知的。本发明的另一方面涉及生物体或宿主细胞，其中已经引入了本发明的重组表达载 体。术语"宿主细胞"和"重组宿主细胞"可在本文中互换使用。要理解这些术语不仅指 特定的所研究的细胞，也指这种细胞的子代或者潜在的子代。由于在传代过程中因突变或 者环境影响会出现某些改变，因此子代实际上可以与亲代细胞不完全相同，但其仍包括在 这里所用术语的范围内。大肠杆If禾Π谷氨,IlilffIf的牛长-培养基禾时吝养K牛本领域人员熟悉普通微生物例如谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌的培养。因此，以下就 谷氨酸棒杆菌的培养给出一般性的教导。可在标准教科书中找到用于大肠杆菌培养的相应 的信息。大肠杆菌菌株分别常规生长在MB和LB肉汤中(Follettie et al. (1993) J. Bacteriol. 175，4096-4103)。本领域熟知一些用于包括大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌在内 的细菌的基本培养基。大肠杆菌的基本培养基包括但不限于E培养基、M9培养基和改良的 MCGC (Yoshihama et al. (1985) J. Bacteriol. 162，591-507)。添加葡萄糖的终浓度在大约 0.2%和之间。可按照以下量添加抗生素(微克/毫升)氨卡青霉素，5至1000;卡那 霉素，25 ；萘啶酸，25 ；氯霉素，5至120，壮观霉素50至100，四环素5至120。可添加氨基 酸、维生素和其他补充物，例如，以如下量添加甲硫氨酸，9. 3mM ；精氨酸，9. 3mM ；组氨酸， 9. 3mM ；硫胺素，0. 05mM。根据所进行的特定的实验或进程，分别将大肠杆菌细胞常规培养在 18 至 37 440C ο遗传学修饰的棒状杆菌通常培养在合成的或天然的生长培养基中。用于棒状 杆菌的多种不同的生长培养基是已知的且能够容易地获得(Lieb et al. (1989)Appl. Microbiol. Biotechnol.，32 :205_210 ；von der Osten et al. (1998) Biotechnology Letters，11 :11-16 ;Patent DE 4, 120,867 ；Liebl (1992) The GenusCorynebacterium, in :The Procaryotes, Volume II, Balows, A. et al·，eds· Springer-Verlag)。有关指导也Handbook of Corynebacterium(Eggeling and Bott 'ΦΜ, ISBN 0-8493-1821-1,
2005)。 这些培养基包括一或多种碳源、氮源、无机盐、维生素和微量元素。优选的碳源是 糖，例如单糖、二糖或多糖。例如，葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、核糖、山梨糖、核糖、乳糖、 麦芽糖、蔗糖、甘油、棉子糖、淀粉或纤维素可作为很好的碳源。也可以通过复杂化合物例如糖蜜或糖精制过程的其他副产品来提供糖。补充不同 碳源的混合物也是有利的。其他可能的碳源是醇和有机酸，例如甲醇、乙醇、乙酸或乳酸。氮 源通常是有机或无机氮化合物或含有这些化合物的材料。示例性的氮源包括氨气或氨盐， 如NH4Cl或(NH4)2S04、NH40H、硝酸盐、尿素、氨基酸或复合氮源，如玉米浸液、大豆粉、大豆蛋 白、酵母提取物、肉提取物等等。可使用不同硫源实现超量生产甲硫氨酸。可使用硫酸盐、硫代硫酸盐、亚硫酸盐以 及更为还原性的硫源如H2S和硫化物以及衍生物。也可使用有机硫源如甲硫醇、巯基乙酸 盐、硫氰酸盐、硫脲、含硫氨基酸如半胱氨酸、以及其他含硫化合物来实现甲硫氨酸的高效 生产。甲酸盐与其他Cl源如甲醇或甲醛也可作为补充物。可加入到培养基中的无机盐化合物包括钙、镁、钠、钴、钼、钾、锰锌、铜和铁的盐酸 盐、磷酸盐或硫酸盐。可在培养基中加入螯合化合物以保持溶液中金属离子。特别有用的 螯合化合物包括二羟基苯酚类如儿茶酚或原儿茶酸(protocatechuate)，或有机酸如柠檬 酸。培养基通常还含有其他生长因子如维生素或生长促进剂，这些的实例包括氰钴胺(或 其他形式的维生素B12)、生物素、核黄素、硫胺素、叶酸、烟酸、泛酸盐和吡多辛。生长因子 和盐常产生自复杂培养基组分如酵母提取物、糖蜜、玉米浸液等等。培养基化合物的确切组 成很大程度上取决于即将进行的实验并需要根据各种具体情况分别确定。有关培养基优 化的信息可参见教科书"Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach(eds. P. M. Rhodes, P. F. Stanbury, IRL Press (1997) pp. 53-73, ISBN O 19 963577 3)。也可以选 择商品化的生长培养基，如标准I(Merck)或BHI (脑心浸液，DIFC0)或其他。所有培养基组分均应该是灭菌的，可通过加热(1. 5巴，121°C，20分钟)或过滤除 菌。这些组分可一起灭菌或者在必要时分别灭菌。在开始培养时即可加入所有的培养基组分，或任选地，以连续或分批的方式添加 培养基组分。培养条件根据各个实验分别确定。培养温度通常应该在15°C至45°C范围内，但对于嗜热微生物，该范围可以更高， 高达105°C。实验过程中的温度可保持恒定或可以改变。培养基的pH可在5至8. 5范围 内，优选地在7. O附近，并可通过向培养基加入缓冲液而维持pH。用于此目的的抑制示例性 缓冲液是磷酸钾缓冲液。合成缓冲物如MOPS、HEPES、ACES等可替代使用或同时使用。也 可在生长过程中通过加入酸或碱来维持稳定的培养PH值，例如乙酸、硫酸、磷酸、NaOH, KOH 或ΝΗ40Η。如果使用复杂培养基成分如酵母提取物，则不必使用额外的缓冲物，因为其中许 多复杂化合物具有高缓冲能力。如果使用发酵罐培养微生物，也可用气态氨来控制PH。培养时间通常为数小时至数日。时间的选择是为了使得最大量的产物积聚在肉汤 中。可在多种容器中实施所述生长实验，例如微滴定板、玻璃管、玻璃瓶或不同体积的玻璃 或金属发酵罐。为了筛选大量克隆，微生物应该培养在微滴定板、玻璃管、或摇瓶中，有无挡 板均可。优选地，使用IOOmL或250摇瓶，其中加入大约10% (体积比)的所需生长培养基。培养瓶应该在旋转摇床上摇动(幅度25mm)，速度在IOOrpm至300rpm。可通过保持湿 环境而消除蒸发损失；或者，应该对蒸发损失进行数学校正。如果要测试遗传学修饰的克隆，则也应该测试未修饰的对照克隆或者只含有基本 质粒而无任何插入体的对照克隆。用生长于琼脂板、例如已经在30°C孵育过的CM板(IOg/ L葡萄糖、2. 5g/L NaCl、2g/l尿素、10g/L多蛋白胨、5g/L酵母提取物、5g/L肉提取物、22g/ L (NH4) 2S04、2g/l尿素、10g/L多蛋白胨、5g/L酵母提取物、5g/L肉提取物、22g/L琼脂，以2M NaOH调节pH为6. 8至7. 2)上的细胞接种于培养基使得0D600为0. 5-1. 5。既可通过加入 来自CM板的谷氨酸棒杆菌细胞的盐水悬液也可通过加入该细菌的液体预培养物而实现培 养基接种过程。通用方法 通用方法的方案可参见 Handbook on Corynebacterium glutamicum, (2005)eds. :L. Eggeling, Μ.Bott. , Boca Raton, CRC Press, at Martin et al. (Biotechnology(1987) 5，137-146)，Guerrero et al. (Gene(1994),138, 35-41), Tsuchiya und Morinaga (Biotechnology (1988),6,428-430), Eikmanns et al. (Gene (1991)，102，93-98)，EP 0 472 869，US 4，601，893，Schwarzer and Piihler (Biotechnology (1991) ,9, 84-87, Reinscheid et al. (Applied and EnvironmentalMicrobiology(1994),60,126-132), LaBarre et al. (Journal of Bacteriology(1993)，175，1001-1007)， WO 96/15246, Malumbres et al. (Gene(1993)， 134,15-24), inJP-A-10-229891, at Jensen und Hammer(Biotechnology and Bioengineering(1998),58,191-195), Makrides(Microbiological Reviews(1996),60, 512-538)以及熟知的遗传学和分子生物学教科书。菌株、培养基和质粒可选取的菌株例如，但不限于谷氨酸棒杆菌ATCC 13032，醋谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium acetoglutamicum)ATCC 15806，嗜醋酸棒杆菌(Corynebacteriumacetoacidophilum)ATCC 13870，^/^M^ff · (Corynebacterium thermoaminogenes)FERM BP-1539,栖糖蜜棒杆菌(Corynebacterium melassecola)ATCC 17965，黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)ATCC 14067，发酵乳短杆菌(Brevibacterium lactofermentum) ATCC 13869，和叉开短杆菌(Brevibacterium divaricatum) ATCC 14020或衍生自例如谷氨酸棒 杆菌 KFCC10065、DSM 17322 的菌株，或谷氨酸棒杆菌ATCC21608Corynebacterium efficiens DSMZ44547>44548>44549重组DNA技术Tj M^ B Sambrook, J. , Fritsch, E. F. , and Maniatis, Τ. , in MolecularCloning :A Laboratory Manual, 3rd edition(2001)Cold Spring Harbor LaboratoryPress, NY, Vol. 1, 2, 3,禾口 Handbook on Corynebacterium glutamicum(2005) eds.L. Eggeling, M. Bott. , Boca Raton, CRC Press。
氨基酸和甲硫氨酸中间体的定量fflilHPLC(Agilent 1100， Agilent, ffaldbronn, Germany)GuardCartridge 禾口 Synergi 4μπι 柱(MAX-RP 80 A, 150*4. 6mm) (Phenomenex, Aschaffenburg, Germany) 进行分析。注射之前使用ο-酞二醛(ΟΡΑ)和还原剂巯基乙醇(2-MCE)对分析物进行衍生 化。此外，使用碘乙酸封闭巯基。使用40mM NaH2PO4 (洗脱液A，以NaOH调整pH = 7. 8)作 为极性相，甲醇水混合物(100 1)作为非极性相(洗脱液B)，以Iml/分钟的流速进行分 离。使用如下梯度开始0% B ；39分钟39% B ；70分钟64% B ； 100% B, 3. 5分钟；2分钟 0% B用于平衡。如下所述在室温自动进行衍生化。首先将0.5μ 1 η，η-二(羟乙基)甘氨 酸(0. 5Μ，ρΗ8. 5)中的0. 5% 2-MCE与0. 5 μ 1细胞提取物混合。随后加入1. 5 μ 1 η，η_ 二 (羟乙基)甘氨酸(0.5Μ，ρΗ8. 5)中的50mg/ml碘乙酸，随后加入2·5μ1 η，η-二(羟乙 基)甘氨酸缓冲液(0. 5Μ, ρΗ8· 5)。Derivatization is done by通过加入0. 5 μ 1溶解于 l/45/54v/v/v of 2-MCE/Me0H/n，n-二(羟乙基)甘氨酸(0·5Μ，ρΗ8·5)中的 10mg/ml ΟΡΑ 试剂完成衍生化。最后以32 μ 1 H2O稀释混合物。以上各移取步骤之间均等候1分钟。然 后将总体积37. 5μ 1注射到柱上。注意，如果在样品制备过程中(例如在等候时间内)和样 品制备之后定时清洗自动采样针，则可显著改善分析结果。使用荧光检测器(340nm激发， 450nm发射，Agi lent ,Waldbronn ,Germany)进行检测。定量时使用α -氨基丁酸(ABA)作 为内标。重组方案的定义下文将描述如何构建甲硫氨酸产生效率升高的谷氨酸棒杆菌菌株以实现以上预 期的发现。在描述菌株构建之前，先给出下面要使用的重组事件/方案的定义。在本发明中，"坎贝尔插入(Campbell in)“指的是初始宿主细胞的转化体，其 中通过单次同源重组事件(交换进来事件(cross-in event))将完整的环状双链DNA分子 (例如基于pCLIK int sacB的质粒)整合到染色体中，这有效地导致线性化形式的所述环 状DNA分子插入到染色体中与所述环状DNA分子的第一 DNA序列同源的第一 DNA序列中。〃 被坎贝尔插入(Campbelled in) 〃指的是已经被整合到〃坎贝尔插入〃转化体的染色体中 的线性化的DNA序列。“坎贝尔插入"含有双份的第一同源DNA序列，其中每一拷贝包括 并跨越一个拷贝的同源重组交换点。该名称来自阿兰 坎贝尔教授(Alan Campbell)，其最 先提出了这种重组方式。在本发明中，丨‘坎贝尔删除(Campbell out)“指的是来自〃坎贝尔插入〃转化 体的子代细胞，其中在"被坎贝尔插入"DNA的线性化插入体DNA中所含的第二 DNA序列 与染色体中与所述线性化插入体的第二 DNA序列同源的第二 DNA序列之间发生了第二同源 重组事件(交换出去事件(cross-out event))，该第二重组事件导致所整合的DNA序列的 一部分发生缺失(丢弃)，但重要的是，这还导致所整合的"被坎贝尔插入"DNA的一部分 (其可以甚至仅仅为一个碱基)留在染色体中，这样一来，与初始宿主细胞相比，所述"坎 贝尔删除"细胞在染色体中便含有一或多个故意的变化(例如，单碱基取代、多碱基取代、 插入异源基因或DNA序列、插入额外一或多拷贝的同源基因或修饰的同源基因、或插入包 含一种以上的如上所述的实例的DNA序列)。“坎贝尔删除"细胞或菌株通常(但并非必然)是通过针对"被坎贝尔插 入"DNA序列的一部分(希望丢弃的那部分)中所含的基因进行反选择而获得的，例如枯草芽孢杆菌sacB基因，当细胞培养于存在5%至10%的蔗糖条件下时，该基因的表达对细 胞是致死性的。无论是否进行反选择，均可使用任何可筛选表型通过筛选而获得或鉴定出 所需的"坎贝尔删除"细胞，所述可筛选表型例如但不限于，集落形态、集落颜色、是否存 在抗生素抗性、通过聚合酶链反应检测是否存在给定的DNA序列、是否存在营养缺陷型、是 否存在某种酶、集落核酸杂交、抗体筛选等等。术语"坎贝尔插入"和"坎贝尔删除"也可 用作不同时态的动词来指代上述的方法或过程。 要理解导致〃坎贝尔插入〃或〃坎贝尔删除〃的同源重组事件可出现在同源DNA 序列内的一系列DNA碱基上，且由于同源序列在该一系列DNA碱基的至少一部分上彼此相 同，因此通常不可能精确地指出交换事件的发生之处。换言之，不可能精确地指出哪一序列 最初是来自插入的DNA的，而哪一序列最初是来自染色体DNA的。此外，所述第一同源DNA 序列和第二同源DNA序列通常由部分非同源性区域间隔开，而正是该非同源性区域仍然留 在"坎贝尔删除"细胞的染色体中。实践中，在谷氨酸棒杆菌中，典型的第一和第二同源DNA序列的长度通常为至少 约200个碱基对，并可多达数千碱基对。不过，更短或者更长的序列也可用于该过程。例如， 第一和第二同源序列的长度可在约500至2000个碱基的范围，并且将第一和第二同源序列 设置为大致相同的长度，优选地使它们的差异小于200个碱基对，且最优选地使两者中较 短者的碱基对长度至少是较长者长度的70%，将有利于自"坎贝尔插入"获得"坎贝尔删 除〃。“坎贝尔插入和坎贝尔删除方法〃可参见W02007012078。
实施例以下实验说明了杰氏棒杆菌甲酰基-THF-合成酶和gcvHTP以及IipB或Ipl过表 达如何导致甲硫氨酸的产生升高。不过这些实施例无意于以任何方式限制本发明。摇瓶实验和HPLC分析使用标准糖蜜培养基(Molasses Medium)进行摇瓶实验，其中使用的菌株均 一式而份或一式四份。每升糖蜜培养基含有40g葡萄糖；60g糖蜜；20g(NH4)2S04 ；0. 4g MgS04*7H20 ；0. 6g KH2PO4 ；IOg 酵母提取物(DIFCO) ；5mlof 400mM 苏氨酸；2mgFeS04. 7H20 ； 2mg MnSO4. H2O ；禾口 50g CaCO3 (Riedel-de Haen)，以 ddH20 补足体积。使用 20% NH4OH 将 pH 调节至7. 8。将20ml持续搅动的培养基(以便保持CaCO3悬浮)加入至250ml的带挡板的 Bellco摇瓶并高压灭菌20分钟。高压灭菌后，每升基础培养基加入4ml的“4B溶液”(或 8(^1/瓶)。每升“4B溶液”含有0.25g盐酸硫胺素(维生素Bl)，50mg氰钴胺(维生素 B12)，25mg生物素，1. 25g盐酸吡多辛(维生素B6)，并以12. 5mM KPO4, ρΗ7· 0缓冲，以溶解 生物素，并过滤除菌。培养物在置于NewBrunswick Scientific地板摇床(200或300rpm) 上的有挡板的瓶中生长大约48小时，温度大约28°C或30°C，所述的瓶覆盖Bioshield纸并 以胶带密封。典型地在大约24小时和/或大约48小时时取样。离心去除细胞，随后使用 等体积的60%乙腈或60%乙醇稀释上清液，然后使用Centricon 0. 45 μ m的离心柱对溶液 混合物进行膜过滤。使用HPLC来分析过滤物中甲硫氨酸、甘氨酸加高丝氨酸、0-乙酰高丝 氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、和其他指定氨基酸的浓度。对于HPLC分析，将过滤的上清液按1 100稀释于经0. 45 μ m过滤的ImM Na2EDTA,将1 μ 1的这种溶液以硼酸缓冲液(80mM NaBO3, 2. 5mMEDTA, pH 10. 2)中的OPA试剂(AGILENT)进行衍生化，并注射至200x4. Imm Hypersil 5 μ AA-ODS柱上进行Agilent IlOOSeries HPLC，该系统装配了 G1321A荧光检测器(AGILENT)。激发波长是338nn，检测 的发射波长是425nm。对氨基酸标准溶液进行层析并用于确定各种氨基酸的滞留时间和标 准峰面积。使用Agilent提供的随带软件包Chem Station用于设备控制、数据获取和数 据处理。硬件为HP Pentium 4计算机，其支持以Microsoft ServicePack(SP6a)升级的 Microsoft Windows NT 4.0。
实验1 产生M2014菌株谷氨酸棒杆菌菌株ATCC 13032以DNA A(也称为pH273) (SEQ IDNO :21)转化 并“被坎贝尔插入”以产生“坎贝尔插入”菌株。“坎贝尔插入”菌株随后“被坎贝尔删除 (Campbelled out) ”以产生“坎贝尔删除”菌株M440，后者含有编码反馈抗性高丝氨酸脱 氢酶(homfto)的基因。产生的高丝氨酸脱氢酶蛋白质包括如下氨基酸改变，即S393改变为 F393 (称为 Hsdh S393F)。菌株M440随后以DNA B(也称为pH373) (SEQ ID NO 22)转化以产生“坎贝尔插 入”菌株。“坎贝尔插入”菌株然后“被坎贝尔删除”以产生“坎贝尔删除”菌株M603，后者 含有编码反馈抗性天冬氨酸激酶(Askfto)(由IysC编码)的基因。得到的天冬氨酸激酶蛋 白质中，T311变为1311(称为LysCT311I)。发现菌株M603产生大约17. 4mM的赖氨酸，而ATCC13032菌株没有产生可检测量 的赖氨酸。此外，M603菌株产生大约0. 5mM高丝氨酸，而ATCC13032菌株没有产生可测量 到的高丝氨酸，结果见表2。表2 菌株ATCC13032和M603产生的高丝氨酸、0-乙酰高丝氨酸、甲硫氨酸和赖氨 酸的量 菌株Μ603以DNA C(也称为pH304) (SEQ ID NO 23)转化以产生“坎贝尔插入”菌 株，后者随后“被坎贝尔删除”以产生“坎贝尔删除”菌株M690。M690菌株含有位于metH基 因(称为P497HietH)上游的PgroES启动子。P497启动子的序列为SEQ ID NO :4。M690菌株 产生大约77. 2mM赖氨酸和大约41. 6mM高丝氨酸，见表3。表3 菌株M603和M690产生的高丝氨酸、0_乙酰高丝氨酸、甲硫氨酸和赖氨酸的 M690菌株随后如下进行诱变将生长在BHI培养基(BECT0NDICKINS0N)中的M603 过夜培养物在50mM柠檬酸缓冲液pH5. 5中洗涤，以N-甲基-N-亚硝基胍(10mg/ml，溶于 50mM柠檬酸缓冲液pH5. 5)处理20分钟，30°C。处理后，细胞再以50mM柠檬酸缓冲液pH5. 5 中洗涤并铺板，培养基含有如下成分(所有提及的量均以500ml培养基计)IOg(NH4)2SO4 ； 0. 5g KH2PO4 ；0. 5g K2HPO4 ；0. 125g MgSO4JH2O ；2Ig MOPS ；50mgCaCl2 ； 15mg 原儿茶酸；0. 5mg 生物素；Img 硫胺素；和 5g/L D，L-乙硫氨酸(ethionine) (SIGMA CHEMICALS, CATALOG #E5139),以KOH调至pH7.0。此外，培养基含有0. 5ml的微量金属溶液，包括10g/L FeSO4JH2O ； lg/L MnS04*H20 ；0. lg/L ZnS04*7H20 ；0. 02g/L CuSO4 ；和 0. 002g/LNiCl2*6H20，均 溶于0. 1 M HCl0最终的培养基经过滤除菌，并向培养基中加入40ml的无菌50%葡萄糖溶 液(40ml)和终浓度为1. 5%的无菌琼脂。将最终的含琼脂培养基倒在琼脂板上并标记为基 本乙硫氨酸培养基。将诱变的菌株分布于板上(基本乙硫氨酸)并温育3-7天，30°C。分 离再培养基上生长的克隆，并再次划线培养于相同的基本乙硫氨酸培养基上。选择若干克 隆用于分析甲硫氨酸的产生。
如下分析甲硫氨酸的产生。菌株在CM-琼脂培养基上生长2天，300C，所述培养基 含有:10g/L D-葡萄糖，2. 5g/L NaCl ；2g/L 尿素；10g/L BactoP印tone (DIFCO) ；5g/L 酵母 提取物(DIFCO) ；5g/L牛肉提取物(DIFCO) ；22g/L琼脂(DIFCO)；该培养基在121°C高温灭 菌20分钟。菌株生长后，刮下细胞并重悬于0. 15M NaCl中。对于主要培养物，将刮下细胞的 悬浮液加至IOml培养基II (见下文)中，在600nm处的起始OD为大约1. 5，其中还有0. 5g 高温灭菌的固体CaCO3 (RIEDEL DE HAEN)，然后细胞在置于200rpm轨道摇床的100ml无挡 板摇瓶中温育72小时，30°C。培养基II含有40g/L蔗糖；60g/L来自糖蜜的总糖(以糖含 量计)；10g/L (NH4)2SO4 ；0. 4g/L MgS04*7H20 ；0. 6g/L KH2PO4 ；0. 3mg/L 硫胺素 *HC1 ； lmg/L 生 物素；2mg/L FeSO4 ；和2mg/L MnS04。以NH4OH调节培养基至pH7. 8，在大约121°C高温灭菌 20分钟。高温灭菌并冷却后，加入来自过滤除菌的储存液(200yg/ml)的维生素B12(氰钴 胺)(SIGMA CHEMICALS)至终浓度为 100μ g/L。从培养基取样并分析氨基酸含量。使用Agilent氨基酸方法在AgilentllOO Series LC System HPLC(AGILENT)上测定产生的氨基酸，包括甲硫氨酸。以正邻苯二 醛(ortho-pthalaldehyde)进行样品的预先柱衍生化允许所产生的氨基酸经Hypersil AA-柱(AGILENT)分离后被定量。分离显示甲硫氨酸滴度至少为M690的两倍的克隆。一种这样的克隆被用于进一 步的实验中，该克隆命名为Ml 197，于2005年5月18日保藏于DSMZ菌株保藏中心，菌株保 藏号为DSM 17322。将该菌株的氨基酸产生情况与菌株M690相比，结果概括于表4。表4 菌株M690和Ml 197产生的高丝氨酸、0-乙酰高丝氨酸、甲硫氨酸和赖氨酸的 菌株Μ1197以DNA F(也称为pH399，SEQ ID NO :24)转化以产生“坎贝尔插 入”菌株，后者随后“被坎贝尔删除”以产生菌株Μ1494，该菌株在高丝氨酸激酶的基因中 含有突变，其导致所产生的高丝氨酸激酶中出现氨基酸改变，即Τ190改变为Α190(称为 HskT190A)。将菌株M1494的氨基酸产生情况与菌株Ml 197相比，结果概括于表5。表5 菌株M1197和M1494产生的高丝氨酸、0-乙酰高丝氨酸、甲硫氨酸和赖氨酸 的量 菌株Μ1494以DNA D(也称为pH484，SEQ ID NO 25)转化以产生“坎贝尔插入”菌 株，后者随后“被坎贝尔删除”以产生M1990菌株。M1990菌株使用groES启动子和EFTU(延 伸因子Tu)启动子过表达metY等位基因(称为P497P1284HietY)。P497P1284启动子的序列见SEQ ID NO :26。将菌株M1494的氨基酸产生情况与菌株M1990相比，结果概括于表6。表6 菌株M1494和M1990产生的高丝氨酸、0_乙酰高丝氨酸、甲硫氨酸和赖氨酸 的量 菌株Μ1990以DNA Ε(也称为ρΗ 491，SEQ ID NO 27)转化以产生“坎贝尔插入” 菌株，后者随后“被坎贝尔删除”以产生“坎贝尔删除”菌株Μ2014。Μ2014菌株使用超氧化 物岐化酶启动子过表达metA等位基因(称为P3119HietA)。P3119启动子的序列见SEQ ID NO 3。将菌株Μ2014的氨基酸产生情况与菌株Μ1990相比，结果概括于表7。表7 菌株Μ1494和Μ1990产生的高丝氨酸、0_乙酰高丝氨酸、甲硫氨酸和赖氨酸 的量 实验2 自 M2014 缺失 mcbR使用含有RXA00655缺失的质粒pH429(SEQ ID NO :28)通过整合和切割将mcbR缺 失引入谷氨酸棒杆菌(见WO 2004/050694A1)。将质粒pH429转化至具有卡那霉素抗性(坎贝尔插入)选择性的M2014菌株内。 使用sacB反选择，分离到转化菌株的卡那霉素敏感型衍生菌，推测其已经通过切割(坎贝 尔删除)而丢失了所整合的质粒。转化的菌株产生了形成小菌落的卡那霉素敏感型衍生菌 以及更大的菌落。通过PCR筛选两种大小的菌落以检测是否存在mcbR缺失。较大菌落中 无一含有所述缺失，而较小菌落中的60-70%含有预期的mcbR缺失。当在BHI板上划线培养原始分离物以便形成菌落时，出现了微菌落和小菌落。当 在BHI上再次划线培养所述微菌落时，再次出现了微菌落和小菌落。当在BHI上再次划线 培养所述小菌落时，菌落大小通常是小而均一的。选择两个单个小菌落分离物，分别称为 0M403-4和0M403-8，用于进一步研究。摇瓶实验(表8)显示0M403-8产生的甲硫氨酸的量是亲代M2014的至少两倍。该 菌株还产生赖氨酸，其量不足M2014的五分之一，提示碳从天冬氨酸半醛转而流向高丝氨 酸。第三个显著的不同在于，0M403积聚的异亮氨酸比M2014升高10倍以上。培养物均在 标准糖蜜培养基中生长48小时。表8 在接种新鲜生长的细胞的摇瓶培养物中由0M403菌株分离物产生的氨基酸 再看表9，0M403积聚的0_乙酰高丝氨酸比M2014降低15倍以上。对这一结果最 合理的解释是，在M2014中积聚的绝大多数0-乙酰高丝氨酸在0M403中已被转化为甲硫氨 酸、同型半胱氨酸和异亮氨酸。培养物均在标准糖蜜培养基中生长48小时。表9 在接种新鲜生长的细胞的摇瓶培养物中由两种0M403分离物产生的氨基酸 实验3 降低metQ表达为了降低0M403-8的甲硫氨酸输入，缺失了 metQ基因的启动子和5’部分。metQ 基因编码甲硫氨酸输入复合体的亚基，该亚基是所述复合体的功能所必需的。可使用质粒 pH449(SEQ ID NO 29)通过标准的坎贝尔插入和坎贝尔删除技术实现这一目的。在摇瓶分 析中测定0M403-8和0M456-2的甲硫氨酸产生情况。结果(表10)显示0M456-2比0M403-8 产生了更多的甲硫氨酸。培养物均在标准糖蜜培养基中生长48小时。表10 :0M456-2的摇瓶分析 实验4:构建 0M469构建称为0M469的菌株，其包括metQ缺失，同时通过将0M456-2中的metF启动子 替换为噬菌体入？1；启动子而过表达111讨？。可使用质粒p0M427(SEQ ID NO 30)通过标准的 坎贝尔插入和坎贝尔删除技术实现这一目的。在摇瓶培养分析中测定0M469的四种分离物 的甲硫氨酸产生情况，如表11所示，它们均比0M456-2产生了更多的甲硫氨酸。培养物均 在含2mM苏氨酸的标准糖蜜培养基中生长48小时。表11 :0M469的摇瓶分析，0M469是0M456-2的衍生物，其中用噬菌体λ Pe启动子 替换了 metF启动子 实验5:构建 M 2543
使用SEQ ID NO :31所示的质粒pCLIK5A PSOD TKT通过电穿孔转化菌株0M469-2。 可使用标准的坎贝尔插入和坎贝尔删除技术实现这一目的。在摇瓶培养分析中测定OM 469PS0D TKT的分离物(标记为M2543)的甲硫氨酸产 生情况，它们均比0M469-2产生了更多的甲硫氨酸。菌株M2543的结果见表12。表12 :0M469和M2543的摇瓶分析 实验6:构建 GK1259为了降低丝氨酸脱氨酶(sda)的表达，缺失了一部分sda基因。可使用质粒ρΗ626 int SacB delta sdaA(SEQ ID NO :32)通过标准的坎贝尔插入和坎贝尔删除技术实现这一 目的。为此，使用质粒PH626 int SacB delta sdaA通过电穿孔转化菌株M2543。得到的菌 株命名为GK1259。实验7:构建 0M264C质粒p0M253(SEQ ID NO 33)被用于缺失谷氨酸棒杆菌菌株M2014的serA并将其 替换为壮观霉素抗性。得到的“被坎贝尔删除”菌株M2014 AserA: spec命名为0M264C。 0M264C是丝氨酸营养缺陷体。由于还缺乏功能性GCS，因此0M264C不能在缺乏丝氨酸但含 有甘氨酸的基本培养基上生长。但是，如果将功能性GCS系统加入到0M264C中，它将获得 在含有甘氨酸的基本培养基上生长的能力。基本(化学限定)培养板的配方如下 所用储存液均过滤除菌。对于琼脂陪替培养皿，将15g琼脂溶于800ml蒸馏水中，
高温灭菌。10 X Spizizen 盐20g硫酸铵174g磷酸氢二钾(三水化物)60g磷酸二氢钾(无水)IOg柠檬酸钠(二水化物)2g硫酸镁(七水化物)加蒸馏水至1升加入3. 5ml 过滤除菌的 0. 4% FeCl3 · 6H20Iml微量营养素溶液(见下文)。最终PH应该为大约7. 2过滤除菌。微量营养素溶液(1升)0. 15g Na2MoO4 · 2H202. 5g H3BO30. 7g CoCl2 · 6H200. 25g CuSO4 · 5H201. 6g MnCl2 · 4H200. 3g ZnSO4 · 7H20
加蒸馏水至1升过滤除菌。4B 溶液(1 升)
0. 25g盐酸硫胺素(维生素B1)50mg氰钴胺(维生素B12)25 to 28mg 生物素1. 25g吡多辛HCl (维生素B6)溶于50mM 磷酸钾，pH7. 0过滤除菌，避光保存。实验8 在谷氨酸棒杆菌中构建表达杰氏棒杆菌gcvPTH基因的菌株与谷氨酸棒杆菌不同，其近亲杰氏棒杆菌不含有GCS。在杰氏棒杆菌染色体中， gcvP、gcvT 禾口 gcvH 基因成簇位于一操纵子内(Tauch et al.，2005，J. Bacteriol.，vol 187，pp4671-4682)。使用杰氏棒杆菌菌株K411染色体DNA作为模板，通过聚合酶链反应 (PCR)，将该基因簇克隆在四个重叠的亚片段中。通过将序列分为4个较小的区域并获得4个独立的较小的PCR片段而获得必要的 DNA。使用4组引物扩增这4个片段。在相应的有义引物中的gcvP起始密码子的立即上游 处遗传工程化引入人工XbaI位点和人工核糖体结合位点，并在相应的反义引物中的gcvH 终止密码子的立即下游处遗传工程化引入人工BamHI位点。如此在XbaI至BamHI的片段 上重建gcvPTH基因簇的编码序列。所得到的XbaI至BamHI的片段含有重建的gcvPTH基因簇，然后将其克隆入谷氨 酸棒杆菌复制型质粒，该质粒被设计为从谷氨酸棒杆菌groESL启动子(称为P497)或从枯 草芽孢杆菌噬菌体SPOl启动子(称为P15) (SEQ IDNO 42)表达基因。所得质粒分别命名为 p0M615(SEQ ID NO 34)和 p0M616(SEQ ID NO :35)。使用 P497 和 P15 启动子是因为它们可促 进位于下游的基因的组成型表达。具体而言，这些启动子不受任何甘氨酸相关代谢物例如 甘氨酸、丝氨酸、甲硫氨酸、胸苷、嘌呤等的显著调节。实验9 杰氏棒杆菌gcvPTH基因在谷氨酸棒杆菌中起作用将质粒p0M615、p0M616和空载体pCLIK各自分别地转化至测试菌株谷氨酸棒杆 菌菌株0M264C和甲硫氨酸生产菌株谷氨酸棒杆菌菌株GK1259内，在含有硫酸卡那霉素 (25mg/L)的脑心浸液(原Difco JllBectonDickenson)琼脂板上进行选择。将0M264C转 化体划线接种在缺乏丝氨酸但含有甘氨酸的基本板上。将硫辛酸加入至培养基中至终浓度 为lmg/L，以保证存在足量的GcvH的这种辅因子。p0M615 与 p0M616 衍生菌、0M264C(p0M615)与 0M264C (p0M616)、以及 GK1259(p0M615)和 GK1259 (p0M616)均生长，但 pCLIK 转化体 0M264C (pCLIK)不生长。实验10 来自杰氏棒杆菌的IipBA基因在谷氨酸棒杆菌中起作用谷氨酸棒杆菌是硫辛酸原养型，且推测谷氨酸棒杆菌具有硫辛酰合成酶，因为丙 酮酸脱氢酶和α-酮戊二酸脱氢酶具有活性。大肠杆菌内存在两种不同途径用于将硫辛酸附着(连接)至靶蛋白，即用于内源 性合成的硫辛酸的LipB依赖性途径和用于补料的硫辛酸的LplA途径(Morris et al., 1995, J. Bacteriol. Vol 177，pp 1-10)
经序列比较发现，谷氨酸棒杆菌似乎对LipB和IplA均具有很高的同源物。因此， 通过PCR从作为模板的杰氏棒杆菌菌株K411染色体DNA克隆了 IipB基因及其天然启动子 以及IipA基因。将所得平端PCR片段连接至p0M615或p0M616的唯一的SwaI位点，分别 产生 p0M620AF(SEQ IDNO 36)禾口 p0M621AR(SEQ ID NO :37)。
质粒p0M620AF和p0M621AR各自转化至菌株0M264C内，分别产生 0M264C (p0M620AF)和0M264C (p0M621AR)，和各自转化至产生甲硫氨酸的菌株GK1259，分别 产生GK1259(p0M620AF)和GK1259 (p0M621AR)。将0M264C转化体划线接种在如上所述的基 本甘氨酸板上(但不含硫辛酸)，两种转化体均生长，但0M264C(pCLIK)不生长，说明当两者 在谷氨酸棒杆菌中一起表达时，杰氏棒杆菌LipB途径能够硫辛酰化杰氏棒杆菌GcvH蛋白。在摇瓶中测试了p0M615、p0M616、p0M620AF、p0M621AR 和 pCLIK 的 GK1259 转化体 中甲硫氨酸和甘氨酸产生的情况，其中使用不含硫辛酸或含有硫辛酸终浓度为大约IOmg/ ml的糖蜜培养基。结果见下文的表13和14。表13 被设计为用于表达杰氏棒杆菌gcvPTH与IipBA的不同质粒所转化并生长 于糖蜜培养基摇瓶中的GK1259的甲硫氨酸和甘氨酸的产生情况 表14 被设计为用于表达杰氏棒杆菌gcvPTH与IipBA的不同质粒所转化并生长 于糖蜜培养基摇瓶中的0264C的甲硫氨酸和甘氨酸的产生情况 *除p0M616加硫辛酸的样品是单份样品外，其他甲硫氨酸和甘氨酸的滴度均是一 式二份的样品的平均值。从这些结果显然可以看出，通过表达杰氏棒杆菌gcvPTH操纵子，过量的甘氨酸副 产品被消耗，而甲硫氨酸滴度被升高。通过从同一质粒表达杰氏棒杆菌gcvPTH操纵子和杰 氏棒杆菌IipBA操纵子可实现进一步的改善。实验11 从整合盒(integrated cassette)表达 gcvPTH 和 IipBA在前面的实施例中，gcv和Iip基因是在能够在谷氨酸棒杆菌中复制的质粒上引 入的。不过，也可通过整合型载体引入这些基因。例如，将从启动子P15表达的杰氏棒杆菌gcvPTH操纵子连接至整合型载体内产生pOM627(SEQ ID NO :38)，后者被设计为用于整合至 谷氨酸棒杆菌的bioB基因座。p0M627可被“被坎贝尔插入，，菌株0M469和GK1259内并可自菌株0M469禾口 GK1259 “被坎贝尔删除”。如同上述实施例中那样，观察到甲硫氨酸产生的改善和降低的甘 氨酸积聚，见表15。表15 在含或不含10mg/L硫辛酸的糖蜜培养基内在摇瓶中生长的、使用p0M627 得到的0M469和GK1259转化体的甲硫氨酸和甘氨酸的产生情况，p0M627被设计为当其整 合至bioB后从P15表达杰氏棒杆菌gcvPTH 可通过引入多个拷贝或通过升高启动子的强度而改善整合型质粒p0M627对甘氨 酸和甲硫氨酸产生的影响。还可添加杰氏棒杆菌IipBA操纵子(在复制型或整合型载体上)。在整合至谷氨 酸棒杆菌bioAD基因座后可从启动子P497表达IipBA的整合型质粒的实例是p0M180 (SEQ ID NO 39)。实验12 大肠杆菌GCS系统也在谷氨酸棒杆菌内起作用PCR扩增大肠杆菌Ipd基因并置于整合型质粒内产生p0M331 (SEQ IDNO 40)。整 合位置是在此称为metE2的基因，该基因与metE的一部分同源，但在谷氨酸棒杆菌中似乎 不是生长或产生甲硫氨酸所必需的。在p0M331中，从P497启动子表达大肠杆菌Ipd基因。p0M331被转化入0M264C并 从0M264C被坎贝尔删除，产生菌株0M197，后者经合适的诊断性PCR确认其含有整合的P497 Ipd盒。此外，通过PCR扩增大肠杆菌gcvTHP操纵子并连接至复制型载体的P497启动子的 立即下游，产生p0M344(SEQ ID NO :41)。将p0M344和pCLIK各自分别地转化至菌株0M197 内，所得菌株在含有甘氨酸和硫辛酸但缺乏丝氨酸的基本甘氨酸板(见上文)上划线培养。30°C生长数天后，0M197/p0M344已经生长，但0M197/pCLIK没有生长，说明大肠杆 菌GCS系统在谷氨酸棒杆菌内起作用。上述实施例显示，编码GCS亚基P、T和H的基因以及编码催化硫辛酸连接或合成 的酶的基因(其克隆自两种“供体”生物体(它们彼此相互无关联)之一)能够在谷氨酸 棒杆菌中产生可检测量的GCS活性，这表现为含有甘氨酸但不含丝氨酸的板上对丝氨酸营 养缺陷型提供互补，或是表现为与作为对照的以空载体转化的相关亲代或前体菌株产生的 甘氨酸相比，产生甲硫氨酸的菌株的甘氨酸产生降低。
进一步而言，似乎可以合理地认为，本领域人员能够遵循在此所披露的实施例并 在谷氨酸棒杆菌中重建其他GCS系统，并可通过从相同的供体生物体(即大肠杆菌和杰氏 棒杆菌)或其他供体生物体中克隆相关的基因而建立和/或升高GCS活性。改善也可通过 补料硫辛酸，例如以大约0. 1至10mg/L，而实现。实验13:构建 M2616 构建谷氨酸棒杆菌M2616。该菌株显示出缺失的serA活性，其允许测试甲酰基THF 合成酶的功能。质粒pHF96(SEQ ID 43)是整合型质粒，其被设计为用于在与谷氨酸棒杆菌ATCC 13032相关的谷氨酸棒杆菌菌株的serA基因中产生缺失-取代。使用质粒pHF96 int sacB delta serA来造成M2543中的sera缺失。通过电穿孔将质粒转化至谷氨酸棒杆菌M2543 内并分离卡那霉素抗性克隆。经PCR确定这些卡那霉素抗性菌株是成功的"被坎贝尔插 入"菌株后，将菌株在液体CM培养基中生长过夜，并接种在含蔗糖(10%浓度)的CM培养 基中。所得“被坎贝尔删除”菌株M2543 delta serA被命名为M2616。如预期的那样，在 基本培养基中进行分析时，M2616是丝氨酸营养缺陷体。还如预期的那样，由于缺乏甲酰基 THF合成酶，M2616不能在缺乏丝氨酸但含有甘氨酸和甲酸盐的基本培养基(见基本(化 学限定)培养基配方的实施例)上生长。如果在M2616中添加功能性甲酰基THF合成酶系 统，其便可获得在含有甘氨酸的基本培养基上生长的能力。实验14 从两种杰氏棒杆菌来源克隆两种甲酰基-THF合成酶基因与谷氨酸棒杆菌不同，其近亲杰氏棒杆菌不含有登录号为NP_939608的甲酰 基-THF合成酶蛋白和登录号为GeneID =2649808的相应的基因。使用了两种来源的模板从杰氏棒杆菌克隆甲酰基-THF合成酶。使用来自 NCTC(National Collection of Type Cultures London，UK)编号为 11915、菌株名称为 K411的菌株的DNA和来自DSMZ菌株7171的DNA。按照生产商的方法使用Quiagen DNA Kit 制备染色体DNA。使用寡核苷酸HS1304(SEQID NO 44)和HS1305 (SEQ ID NO 45)从两种来 源(NCTC 11915和DZMZ 7171)的基因组DNA扩增甲酰基-THF合成酶基因的基因组序列。 使用来自RocheMannheim的Pwo聚合酶，条件如下52°C退火30”，72°C延伸120”，产生大约 1700bp 的 PCR 片段。此外还使用引物HS1302(SEQ ID NO :46)和HS1303 (SEQ ID NO :47)扩增启动子表 达单元，其具有所述来自菌株ATCC13032的染色体DNA的序列。使用来自Roche Mannheim 的Pwo聚合酶，条件如下53°C退火30”，72°C延伸30”，产生大约200bp的PCR片段。将两种片段加到第三PCR中，向其中加入引物HS13032和HS1305。在衔接引物 足量的条件下对有限量的PCR片段I和II进行第三PCR并使用衔接引物使之融合。使用 HS1302+HS1305 扩增得自 HS1302+HS1303 和 HS1304+HS1305 的 PCR 片段的融合产物。使 用来自Roche Mannheim的Pwo聚合酶，条件如下55°C退火30”，72°C延伸120”，产生大约 1900bp 的 PCR 片段。使用GFX PCR纯化试剂盒纯化片段并使用限制性酶MluI和XbaI消化。对含有甲 酰基-THF合成酶基因插入物的阳性质粒进行测序。测序了来自杰氏棒杆菌NCTC K11915的基因。该基因的测序结果显示序列是预期 的序列。测序了来自杰氏棒杆菌DSMZ 7171的基因。该基因的测序结果显示其是质粒序列PH657中所述的序列。通过电穿孔将包含来自NCTC K11915的甲酰基-THF-合成酶的质粒pH655(SEQ ID NO 48)和包含来自DSMZ7171的甲酰基-THF-合成酶的质粒pH657 (SEQ ID NO 49)转化至 缺乏功能性serA基因的菌株M2616中。将所得菌株M2616 (pH655)和M2616 (pH657)以及不含质粒的菌株划线接种于基本培养基，该培养基含有IOmM苏氨酸，20mM甲酸钠和20mM甘氨酸+/-IOmM丝氨酸。含有质 粒pH655和pH657却不含pCLIK5a的菌株在含甲酸盐和甘氨酸的基本培养基上形成菌落， 而即便延长培养时间，菌株M2616也没有在这种不含丝氨酸的培养基上形成菌落。在添加 苏氨酸、甲酸钠和甘氨酸也添加丝氨酸(20mM)的同样的基本培养基上，包括M2616在内的 所有菌株均形成了菌落。结果显示，来自杰氏棒杆菌NCTC和DSMZ 7171的甲酰基THF合成酶在谷氨酸棒杆 菌中成功的功能性表达产生了利用甲酸盐合成丝氨酸的菌株。实验15 构建表达甲酰基-THF合成酶基因的甲硫氨酸超量生产菌株通过电穿孔将质粒pH655和pH657转化入菌株GK1259。在如前所述的摇瓶分析中 培养所得到的菌株GK1259(pH655)和GK1259 (pH657)以及不含质粒的菌株。此外，向生长 培养基中加入20mM甲酸盐。发现甲酰基THF合成酶基因的表达升高了菌株的甲硫氨酸生 产能力，使之超过缺乏甲酰基THF合成酶基因的菌株。结果见表16。表16 :GK1259和过表达甲酰基-THF合成酶的GK1259 (pH655)的摇瓶分析 实验16 在菌株M2543中缺失甲酰基-THF-脱甲酰基酶通过序列比较检测到谷氨酸棒杆菌含有一种基因，其被认为是甲酰基-THF脱甲 酰基酶(登录号NCgl0371)。该基因被认为是编码具有甲酰基-THF脱甲酰基酶的酶活性的 酶，甲酰基-THF脱甲酰基酶从代谢物甲酰基-四氢叶酸酯裂解甲酸盐(Annual review of plant physiology and plant molecular biology(2001) 52 :119-137)。通过如下方法敲除甲酰基-THF脱甲酰基酶(登录号NCgl0371)克隆DNA片段， 其中编码NCgl0371上游区域的基因(长度大约500bp)和同一基因的下游区域(长度大 约500bp)被扩增并通过融合PCR进行融合，并克隆至载体中产生pH670 int sacB delta deformylase (SEQ ID NO :50)。将该质粒转化至菌株M2543中以产生第一重组体(“坎贝 尔插入步骤”)。PCR成功筛选正确的第一重组体之后，将菌株在液体培养基中培养过夜并 在含10%蔗糖的生长培养基中铺板。这一处理(“坎贝尔删除步骤”)产生称为GK1546的 菌株，其中卡那霉素抗性标记物和质粒PH670上编码的Ievan蔗糖基因被成功地从染色体 上交换出去，并随后自染色体和细胞中丢失。来自坎贝尔删除步骤的后续菌株经使用编码 所述甲酰基-THF脱甲酰基酶的5’和3’区域内的序列的引物进行PCR筛选，被鉴定为是甲 酰基-THF脱甲酰基酶缺失体。阳性克隆具有的PCR片段比来自甲酰基-THF脱甲酰基酶野生型菌株的PCR产物短大约900bp。所得菌株命名为GK1546。实验17 构建缺失甲酰基-THF-脱甲酰基酶并过表达甲酰基-THF-合成酶的菌株以质粒pH655和pH657转化菌株GK1546。所得菌株GK1546 (pH655)和 GK1546(pH657)在含有甲酸盐、甘氨酸和苏氨酸但不含丝氨酸的基本培养基上较菌株 M2543显示出显著改善的生长特性。
实验18 表达用于产生甲硫氨酸的功能性甲酰基-THF-合成酶菌株M2616 以 pH655 (甲酰基-THF-合成酶 NCTC 11915)和 pH657 (甲酰 基-THF-合成酶DSMZ 7171)转化。在如前所述的摇瓶分析中分析所得菌株M2616 (pH655) 和 M2616(pH657)。除了上述常规成分之外，培养基中还添加了 20mM甘氨酸以及20mM甲酸钠。摇瓶在 30°C温育，摇动速度为200RPM。48小时后测定甲硫氨酸。发现不含表达甲酰基-THF合成 酶的质粒的亲代菌株M2616不能生长至出现可检测到的0D，而且其不利用所提供的碳源。 通过HPLC分析上清液中的甲酸盐。含有质粒pH655和pH657的菌株显示出利用所有添加 至培养基中的甲酸盐。此外还观察到可在甲酸盐、甘氨酸上生长且表达甲酰基THF-合成酶 基因的菌株产生了可检测量的甲硫氨酸，而菌株M2616根本不产生任何甲硫氨酸。结果见 表17。表17 :M2616和M2616的质粒转化体的甲硫氨酸产生情况 在另一实验中，在实验18中所述的培养基中加入20mM丝氨酸。在存在丝氨酸的 情况下培养表达甲酰基-THF-合成酶DSMZ 7171基因的M2616和M2616并测定所产生的甲 硫氨酸。将表达甲酰基-THF-合成酶DSMZ基因的菌株与不含有甲酰基-THF-合成酶基因 的菌株相比，发现过表达该酶的菌株所产生的甲硫氨酸滴度高于菌株M2616。结果见表18。表18 在过表达甲酰基-THF合成酶的菌株中超量生产甲硫氨酸
权利要求
在至少一种微生物中产生甲硫氨酸的方法，其包括如下步骤培养微生物，其中所述微生物通过遗传学修饰而衍生自起始生物体，使得与所述起始生物体相比，所述微生物产生更多的N5，N10-亚甲基-THF。
2.权利要求1的方法，其中所述微生物选自包括肠杆菌属、埃希氏菌属、克雷伯菌属、 棒杆菌属、芽孢杆菌属、酵母菌属、裂殖酵母属、毕赤酵母属、克鲁维酵母属、阿舒囊霉属 (Ashbya)、曲霉菌属、短杆菌属和链霉菌属的微生物的组。
3.权利要求2的方法，其中所述微生物优选地选自包括谷氨酸棒杆菌 (Corynebacterium glutamicum)、醋谷M酸棒杆菌(Corynebacteriumacetoglutamicum)、 P誉St酸棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)、热产M棒杆菌(Corynebacterium thermoaminogenes)、杰氏棒杆菌(Corynebacteriumjeikeium)、栖糖蜜棒杆菌 (Corynebacterium melassecola)禾口 Corynebacteriumefficiens 的组。
4.权利要求3的方法，其中所述微生物衍生自谷氨酸棒杆菌的菌株。
5.权利要求1至4任一项的方法，其中所述微生物通过遗传学修饰而衍生自起始生物 体，使得与所述起始生物体相比，所述微生物中的甲酰基-THF-合成酶的量和/或活性是升 高的。
6.权利要求5的方法，其中所述微生物通过遗传学修饰而衍生自起始生物体，使得与 所述起始生物体相比，所述微生物中的甲酰基-THF-脱甲酰基酶的量和/或活性是降低的。
7.权利要求5或6的方法，其中所述微生物通过遗传学修饰而衍生自起始生物体，使 得与所述起始生物体相比，所述微生物中的N5，N10-次甲基-THF-环化合成酶、N5，N10-次甲 基-THF-还原酶和/或N5，N1Q-亚甲基-THF-还原酶的量和/或活性是升高的。
8.权利要求5至7任一项的方法，其中甲酰基-THF-合成酶的编码序列衍生自杰氏棒 杆菌或大肠杆菌。
9.权利要求1至4任一项的方法，其中所述微生物通过遗传学修饰而衍生自起始生物 体，使得与所述起始生物体相比，所述微生物中的甘氨酸切割系统(GCS)的酶活性是升高 的。
10.权利要求9的方法，其中所述微生物通过遗传学修饰而衍生自起始生物体，使得与 所述起始生物体相比，所述微生物中的gcvP、gcvT和gcvH的量和/或活性是升高的。
11.权利要求9或10的方法，其中与所述起始生物体相比，所述微生物中的lipA、lipB 或lipA和lipB的量和/或活性是升高的。
12.权利要求9至11任一项的方法，其中与所述起始生物体相比，所述微生物中的 lplA的量和/或活性是升高的。
13.权利要求9至12任一项的方法，其中与所述起始生物体相比，所述微生物中的lpd 的量和/或活性是升高的。
14.权利要求10至13任一项的方法，其中gcvP、gcvT、gcvH、lplA、lipA禾口lipB的编 码序列衍生自杰氏棒杆菌或大肠杆菌。
15.权利要求9至14任一项的方法，其中在存在硫辛酸和/或硫辛酰胺的情况下培养 所述微生物。
16.权利要求1至4任一项的方法，其中与所述起始生物体相比，所述微生物中的甲酰 基-THF-合成酶的量和/或活性和甘氨酸切割系统(GCS)的酶活性是升高的。
17.权利要求16的方法，其中与所述起始生物体相比，所述微生物中的甲酰基-THF-合 成酶、gcvP、gcvT和gcvH的量和/或活性是升高的。
18.权利要求16或17的方法，其中与所述起始生物体相比，所述微生物中的lipA、 lipB或lipA和lipB的量和/或活性是升高的。
19.权利要求16至18任一项的方法，其中与所述起始生物体相比，所述微生物中的 lplA的量和/或活性是升高的。
20.权利要求16至19任一项的方法，其中与所述起始生物体相比，所述微生物中的 lpd的量和/或活性是升高的。
21.权利要求16至20任一项的方法，其中gcvP、gcvT、gcvH、lplA、lipA和lipB的编 码序列衍生自杰氏棒杆菌或大肠杆菌。
22.权利要求16至21任一项的方法，其中在存在硫辛酸和/或硫辛酰胺的情况下培养 所述微生物。
23.微生物，其中所述微生物通过遗传学修饰而衍生自起始微生物，使得与所述起始生 物体相比所述微生物产生更多的N5，N1Q-亚甲基-THF。
24.权利要求23的微生物，其中所述微生物选自包括肠杆菌属、埃希氏菌属、克雷伯 菌属、棒杆菌属、芽孢杆菌属、酵母菌属、裂殖酵母属、毕赤酵母属、克鲁维酵母属、阿舒囊霉 属、曲霉菌属、短杆菌属和链霉菌属的微生物的组。
25.权利要求24的微生物，其中所述微生物优选地选自包括谷氨酸棒杆菌、醋谷氨 酸棒杆菌、嗜醋酸棒杆菌、热产氨棒杆菌、杰氏棒杆菌、栖糖蜜棒杆菌和Corynebacterium efficiens 的组。
26.权利要求25的微生物，其中所述微生物衍生自谷氨酸棒杆菌的菌株。
27.权利要求23至26任一项的微生物，其中所述微生物通过遗传学修饰而衍生自起始 生物体，使得与所述起始生物体相比，所述微生物中的甲酰基-THF-合成酶的量和/或活性 是升高的。
28.权利要求27的微生物，其中所述微生物通过遗传学修饰而衍生自起始生物体，使 得与所述起始生物体相比，所述微生物中的甲酰基-THF-脱甲酰基酶的量和/或活性是降 低的。
29.权利要求27或28的微生物，其中所述微生物通过遗传学修饰而衍生自起始生物 体，使得与所述起始生物体相比，所述微生物中的N5，N1(l-次甲基-THF-环化合成酶、N5， N10-次甲基-THF-还原酶和/或N5，N1Q-亚甲基-THF-还原酶的量和/或活性是升高的。
30.权利要求23至26任一项的微生物，其中所述微生物通过遗传学修饰而衍生自起始 生物体，使得与所述起始生物体相比，所述微生物中的甘氨酸切割系统(GCS)的酶活性是 升高的。
31.权利要求30的微生物，其中所述微生物通过遗传学修饰而衍生自起始生物体，使 得与所述起始生物体相比，所述微生物中的gcvP、gcvT和gcvH的量和/或活性是升高的。
32.权利要求30或31的微生物，其中与所述起始生物体相比，所述微生物中的lipA、 lipB或lipA和lipB的量和/或活性是升高的。
33.权利要求30至32任一项的微生物，其中与所述起始生物体相比，所述微生物中的 lplA的量和/或活性是升高的。
34.权利要求30至33任一项的微生物，其中与所述起始生物体相比，所述微生物中的 lpd的量和/或活性是升高的。
35.权利要求30至35任一项的微生物，其中gcvP、gcvT、gcvH、lplA、lipA禾口lipB的 编码序列衍生自杰氏棒杆菌或大肠杆菌。
36.权利要求23至26任一项的微生物，其中与所述起始生物体相比，所述微生物中的 甲酰基-THF-合成酶的量和/或活性和甘氨酸切割系统(GCS)的酶活性是升高的。
37.权利要求36的微生物，其中与所述起始生物体相比，所述微生物中的甲酰 基-THF-合成酶、gcvP、gcvT和gcvH的量和/或活性是升高的。
38.权利要求36或37的微生物，其中与所述起始生物体相比，所述微生物中的lipA、 lipB或lipA和lipB的量和/或活性是升高的。
39.权利要求33至38任一项的微生物，其中与所述起始生物体相比，所述微生物中的 lplA的量和/或活性是升高的。
40.权利要求36至39任一项的微生物，其中与所述起始生物体相比，所述微生物中的 lpd的量和/或活性是升高的。
41.权利要求36至40任一项的微生物，其中gcvP、gcvT、gcvH、lplA、lipA禾口lipB的 编码序列衍生自杰氏棒杆菌或大肠杆菌。
42.权利要求27至41任一项的微生物，其中通过增加编码甲酰基-THF-合成酶、gcvP、 gcvT、gcvH、lpd、lplA、lipA或lipB的核酸序列的拷贝数、增加编码甲酰基_THF_合成 酶、gcvP、gcvT、gcvH、lpd、lplA、lipA或lipB的核酸序列的转录和/或翻译、在编码甲酰 基-THF-合成酶4(评4(^1\§(^11、1 (1、1 认、11 4或11 8的核酸序列中引入突变或其组 合而升高甲酰基-THF-合成酶40评4(^1\§(^11、1 (1、1 认、11 4或lipB的量和/或活性。
43.权利要求42的微生物，其中通过使用包含编码甲酰基-THF-合成酶、gcvP、gcvT、 gCVH、lpd、lplA、lipA或lipB的核酸序列的自主复制型载体和/或通过将额外拷贝的编码 甲酰基-THF-合成酶、gcvP、gcvT、gcvH、lpd、lplA、lipA或lipB的核酸序列染色体整合至 所述起始生物体的基因组内而增加基因拷贝数。
44.权利要求43的微生物，其中通过使用强启动子来增加转录，所述强启动子优选地选自包括PEFTu、P groES、1 SOD、1 15 和的组。
45.权利要求23至44任一项的微生物用于生产甲硫氨酸的用途。
全文摘要
本发明涉及微生物，特别是谷氨酸棒杆菌，其中N5，N10-亚甲基-THF的形成是提高的。本发明还涉及此类微生物用于产生甲硫氨酸的用途。
文档编号C12P13/12GK101849016SQ200880005502
公开日2010年9月29日 申请日期2008年2月14日 优先权日2007年2月19日
发明者A·黑罗尔德, C·克洛普罗格, H·施罗德, J·G·佩罗, O·泽尔德, R·R·优卡姆, S·黑夫纳, T·A·帕特松 申请人:羸创德固赛有限责任公司