专利名称：一种Maspin基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用的制作方法
一种Maspin基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和
应用
技术领域：
本发明涉及一种试剂盒，具体地说关于一种Maspin基因的原位杂交检测试剂盒 及其检测方法和应用
背景技术：
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，据资料统计，发病率占全身各种恶性肿瘤 的7-10%，在妇女仅次于子宫癌。它的发病常与遗传有关，以及40-60岁之间，绝经期前后 的妇女发病率较高。仅约1-2%的乳腺患者是男性。通常发生在乳房腺上皮组织的恶性肿 瘤。是一种严重影响妇女身心健康甚至危及生命的最常见的恶性肿瘤之一，乳腺癌是一种 严重危害妇女健康的恶性肿瘤，近年来发病率稳定上升且趋年轻化，发病率在女性肿瘤中 居第三位。据世界范围统计，全球每年约有120多万人患乳腺癌，每年死于乳癌人数20万， 工业发达国家乳腺癌进一步增加，根据美国癌症协会(ACS)的报告，美国每年超过20万人 接受乳癌治疗，其中约四万人被夺去生命。从2006中国乳腺癌内分泌治疗高峰论坛上了 解到，中国是乳腺癌发病率增长最快的国家之一，我国每年有约20万名妇女患乳腺癌，中 国乳腺癌发病率每年约增长3% ；在京、津、沪等大中城市，乳腺癌已跃居女性恶性肿瘤之 首。研究显示，乳腺癌发病与家族遗传有密切关系，特别是犹太人妇女有一种特殊的BRCA1、 BRCA2基因变异与家族性乳癌密切相关，家族遗传导致的乳癌大约占所有病例的5% -10， 有乳癌家族史同时有BRCAl和BRCA2基因变异的妇女，她们一生中有85%机率患乳癌，而且 有50 %的机率患妊巢癌。同时也发现，BRCAl和BRCA2基因无变异的大部分妇女患乳癌，亚 洲的大部分女性乳癌的发病与BRCAl和BRCA2基因变异无关，各国乳癌的总发病率都在升 高，由此可见，乳癌的发病机制是多因素参与而致。乳腺癌从癌前变到形成癌症，需要几年时间，如何做到早期检测、诊断、预后的检 测及诊治后的复发、转移早期检出是降低发病率和死亡率的关键。Maspin基因表达于人正常乳腺上皮细胞中，但在大多数乳癌细胞中不表达，并且 Maspin基因在乳癌发生过程中起着重要的作用，国内邵志敏等研究表明乳腺上皮细胞分泌 大量的Maspin蛋白，去除该蛋白的人类肌上皮细胞不再具有抑制乳癌细胞体外浸润的能 力。提高Maspin蛋白在乳腺肌上皮细胞抑制乳癌细胞体的浸润能力方面起重要作用。随着分子生物技术日益完善，功能基因组学，癌症基因组学等研究的深入展开，至 今，我们已有可能在基因水平上做更精确的早期诊断，在癌变前期或癌细胞形成(单克隆 时)就能做到早期预测诊断。这一技术的实施可能是肿瘤诊治方法的一次革命。做到更科 学的早期诊断、早期预防、早期治疗，希望彻底治愈癌症。本发明采用吓哪位杂交技术检测 Maspin基因，对乳腺癌地早期基因水平的诊断有十分重要的临床意义。本发明的原位杂交技术(in situ hybridization)是将分子生物学与细胞化学技 术结合起来，以标记的核酸分子为探针，在组织细胞原位检测特异性核酸分子的技术。其原 理是使含有特异序列、经过标记的核酸单链(即探针)，在适宜条件下与组织细胞中的互补核酸单链即靶核酸发生杂交，再以放射自显影或免疫细胞化学方法对标记探针进行探测， 从而在细胞原位显示特异的DNA或RNA分子。
发明内容本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种Maspin基因的原位杂交检测 试剂盒的用途。本发明的再一的目的是，提供一种Maspin基因的原位杂交检测试剂盒。本发明的另一的目的是，提供一种Maspin基因的原位杂交检测方法。为实现上述目的，本发明采取的技术方案是一种Maspin基因的原位杂交检测试剂盒在制备检测乳腺癌疾病药物中的应用， 所述的试剂盒包括杂交探针、标记物，所述的杂交探针序列如Maspin基因SEQ ID 基因序 列号:NM_002639,2633bp, 18q21. 3"，cds :143…1270bp。所述的杂交探针序列如SEQ ID NO. 1所示的RNA序列。所述的标记物选自放射性核素或非放射性标记物。所述的放射性核素选自3H、35S、125I或32P中的一种。所述的非放射性标记物选自生物素、地高辛、碱性磷酸酶、辣根过氧化酶或荧光素 中的一种。所述的非放射性标记物优选自地高辛。所述的试剂盒还包括增效剂，所述的增效剂是碱性磷酸酶抗体。为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是一种Maspin基因的原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针、标记物，其中所述的杂 交探针序列如SEQ ID NO. 1所示，所述的标记物选自放射性核素或非放射性标记物。为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是一种Maspin基因的原位杂交检测方法，该方法包括以下步骤a、将试剂盒中的杂交探针与底物中待测RNA接触，形成杂交复合体；b、检测a步骤得到的杂交复合体。本发明的诊断试剂盒的组份是由杂交探针，杂交液，显色剂，增效剂等组成。本试 剂盒的核酸杂交原理是分子生物学业内人士均熟知，具体操作步骤是标本处理、预杂交、杂 交、免疫组化染色、镜下进行定量分析、结果报告，其中杂交的具体步骤包括仪器操作
1).将待测标本放入反应槽中；
2).仪器自动弃去液体，自动加消化液；
3).仪器自动弃去液体，自动后固定；
4).仪器自动弃去液体，自动预杂交(42°C )；
5).仪器自动弃去液体，自动清洗；
6).仪器自动弃去液体，自动杂交(42°C )；
7).仪器自动弃去液体，自动清洗；
8).仪器自动弃去液体，自动与DIG抗体培养(室温)
9).仪器自动弃去液体，自动清洗，显色；
10).取出封片镜检。本发明优点在于1、本发明提供的试剂盒具有灵敏度高、特异性强的特点。2、本发明的检测方法操作方便、简单，能在区级以上医院普遍使用和推广。3、本发明的临床意义是更早期跟踪检测乳腺癌发生动态过程，以及用于乳腺癌预 防医学的检测和筛选工具。本发明的诊断试剂盒与临床上其它检测癌胚蛋白标志物，以及 影像医学检查有显著不同。本发明可以在基因水平上检测Maspin异常表达，在影像医学检 查及其它检查未发现占位性乳腺癌病灶之前，癌症生化指标未产生异常之前，亦未形成肿 块之前，能及早做到以上基因表达异常的信息采集，给临床乳腺癌病患一个真正的预后早 期诊断。这样才有可能实施乳腺癌的早期诊断、早期预防、早期治疗，有可能从源头上彻底 根治乳腺癌恶疾。
图1是本发明实施例中乳腺癌症病人Maspin基因表达图片。图2是正常乳腺Maspin基因表达图片。
具体实施方式下面结合附图对本发明具体实施方式
作详细说明。实施例1一种Maspin基因的原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针、标记物、增效剂，其中， 所述的杂交探针序列如SEQ ID NO. 1所示。杂交探针用地高辛标记。试剂盒中的其它液体
和标本组成如下
消化液100 μ 1/管1管/盒无色透明液体
保护液100 μ 1/管1管/盒无色透明液体
预杂交液1300 μ 1/ 管2管/盒无色透明液体
正义杂交液10μ 1/管1管/盒无色透明液体
反义杂交液10μ 1/管1管/盒无色透明液体
封闭液1000 μ 1/ 管1管/盒无色透明液体
碱性磷酸酶抗体 μ /管1管/盒无色透明液体
显色剂A175 μ 1/ 管1管/盒黄色液体
显色剂B320 μ 1/ 管1管/盒无色透明液体
缓冲液I IOx90ml/ 瓶1瓶/盒浅黄色或无色透明液体
缓冲液II IOx80ml/ 瓶1瓶/盒浅黄色或无色透明液体
缓冲液III IOx20m/瓶3瓶/盒浅黄色或无色透明液体
缓冲液IV IOx90ml/ 瓶1瓶/盒浅黄色或无色透明液体
固定液90ml/ 瓶1瓶/盒无色透明液体
阳性对照标本6片/盒
上述试剂成分说明:(所有试剂购自SIGMA)
1、消化液:20mg/ml蛋白酶K，IOOmg蛋白酶K，加 DEPC-H2O 5ml ；
2、保护液0. 2g的glycine加入Iml的1 X缓冲液I ；3、预杂交液:1 X缓冲液II 7. 5ml50 X D 3ml10mg/ml yest t-RNA 750ulllmg/ml SALMON TESTES DNA 682ul0. 04M EDTA 3ml50% formamide 15ml4、封闭液0.03g的bloking(购买自罗氏公司)加入Iml IX缓冲液III;5、IOx 缓冲液 I (PH7. 1-7. 4)NaCl 80gNa2HPO4. 12H20 360gKCl 2gKH2P042g加三蒸水至11，并高压灭菌；6、IOx 缓冲液 II (PH7. 0)NaCl 175. 3g柠檬酸钠88. 2gHCl 几滴加三蒸水至11，并高压灭菌；7、缓冲液 III :(PH7. 9)Tris 121. IgNaCl 87. 66gHCl 60ml 左右加三蒸水至11，并高压灭菌；8、缓冲液 IV:IM Tris-HCl (PH9. 5) =Tirs 121. Ig 加 HCl 3ml 左右，加水 900ml，调 PH 至 9. 5，加 水至11，并高压灭菌；IM NaCl =NaCl 58. 44 加水至 11，并高压灭菌；0. 5M MgCl2 101. 65g MgCl2. 6H20 加水至 11，并高压灭菌；9、固定液多聚甲醛40g加IX缓冲液I至11，稍加热(约50_60度)搅拌至溶 解；10、显色剂 A =NBT Ig 加 70% DMFl 1. 44ml ；11、显色剂 B =BCIP Ig 加 100% DMF30ml。本发明的试剂盒可以多人份使用或一人份使用。实施例2一种Maspin基因原位杂交检测方法及其试剂盒应用一、标本处理1、用IOml的离心管，装4. 5ml淋巴细胞分离液，再将3ml抗凝血缓慢加入含有淋 巴细胞分离液(血淋巴细胞分离液=1 1.5)的离心管中，2000r/min离心IOmin ；
2、吸取中间层白细胞至另一离心管中，再在此管中加入约两倍的IX缓冲液I，混 勻，1500g/min 离心 IOmin ；3、弃上清.沉淀加入约两倍的1 X缓冲液I，混勻，1500g/min离心IOmin ；4、弃上清，并把试管口多余的液体用擦手纸吸去。再将沉淀制成悬液，滴在玻片上 推片，自然干燥。(有条件的医院可以用制片机制片。)3ml血，可以做4张片子；5、用40ml 4%固定液，在玻璃缸中，固定30min，再用1 X缓冲液I洗5min。每缸 可以放16片；6、标本可保存在_20°C，或继续做实验。二、将试剂盒中试剂配制成使用浓度1、将IOX缓冲液I用三蒸水按1 10稀释成IX缓冲液I ；2、将20X缓冲液II用三蒸水按1 10稀释成2X缓冲液II ；按1 100稀释成0. 2X缓冲液II ；按1 200稀释成0. 1 X缓冲液II ；3、将IOX缓冲液III用三蒸水按1 10稀释成1 X缓冲液III ；4、10 X缓冲液IV用三蒸水按1 10稀释成X缓冲液IV (取1#，2#，3#各10ml， 加水至IOOml既可)。三、实验步骤1、取每位待检者标本两张，(另外两张留作复查用)及阳性对照标本两张(每次 实验做一对阳性对照)；2、在玻璃缸里加消化液(消化液IOOul加IX缓冲液199.9ml，即为使用浓 度)20ml。37°C水浴预热10分钟。放进16张玻片，37°C处理12min，再用1 X缓冲液I洗 5min ；3、用0. 2%的保护液(保护液Iml加IX缓冲液I99ml即为使用浓度)洗IOmin, 三蒸水洗5min，以上过程都在玻璃缸进行。玻片自然干燥；4、将玻片放入保湿盒内，加预杂交液20ul/片.盖上盖玻片，盖紧保湿盒，放在 42°C恒温水浴箱中3h以上；5、取出玻片，弃去盖玻片，将玻片放入玻璃缸内，用70%，90%，95%的乙醇各洗 2min,自然干燥；6、将玻片放入保湿盒内，每位病人标本两张，一张加正义杂交液20ul/片，另一张 加反义杂交液20ul/片，盖上盖玻片，盖紧保湿盒，放在42°C恒温水浴箱中16-24h ；7、取出玻片，弃去盖玻片，将玻片放入玻璃缸内在42°C恒温水浴箱中用2 X缓冲液II洗两次，每次15min在42°C恒温水浴箱中用0. 2X缓冲液II洗一次，每次15min在42°C恒温水浴箱中用0. 1 X缓冲液II洗两次，每次15min ；8、用IX缓冲液III洗30s，取出玻片，自然干燥；9、将玻片放入保湿盒内，加0.5% 1封闭液(Iml封闭液加5mllX缓冲液 III) IOOul/片，盖紧保湿盒，在室温下作用30min ；10、取出玻片，用IX缓冲液III洗30s，自然干燥；11、将玻片放入保湿盒内，加碱性磷酸酶抗体(加入1.8ml 1 X缓冲液III) IOOul/ 片，盖紧保湿盒在室温下作用30min ；
12、取出玻片，用IX缓冲液III洗3次，每次15min;13、IX缓冲液IV洗2min，加显色剂(显色剂A73. 3ul，显色剂B157. 5ul加到30ml 1 X缓冲液IV中，混勻)，室温避光12h以上；14、用三蒸水洗5min，自然干燥，(用甘油加10%的IX缓冲液I混勻)封片镜检。四、结果判断在光镜下计数100-300个细胞，计算染上紫色细胞的百分比。阳性对照标本加反义杂交液的应该80%以上染上紫色。所有加正义杂交液的阴性内对照应无色。地高辛标记的cDNA、RNA和寡核苷酸探针，不但探针的具有生物素标记优点，还克 服了生物素标记的探针在原位杂交过程中受组织内源性生物素干忧等缺点)，将该杂交探 针与人体血液白细胞的待测RNA核酸进行杂交，再用免疫组化的方法显色，在光镜下观察 mRNA的存在和定位，根据染色的细胞数，判断目的基因的表达量。本发明方法是目前常用的核酸原位杂交技术，该方法通过检测底物细胞中的 Maspin基因表达量，用来确定乳腺癌的预后。临床研究表明，Maspin基因在乳腺癌中低表 达，因为Maspin基因在正常人高表达，Maspin基因的低表达说明乳腺癌，Maspin基因的表 达程度与乳癌的预后有关，属负相关，表达愈低预后愈差。从而获得乳腺癌的诊断信息。如 上所述，当检测Maspin基因表达时，可预测受试者为乳腺癌情况。具体结果请见图1和图 2。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为 本发明的保护范围。SEQUENCE LISTING<110>芮屈生物技术(上海)有限公司<120> 一种Maspin基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用<130>/<160>1<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>2633<212>DNA<213> 智人(Homo sapiens)<400>1
0145]agtgggcgtggcggtgctgcccaggtgagccaccgctgcttctgcccagacacggtcgcc600146]tccacatccaggtctttgtgctcctcgcttgcctgttccttttccacgcattttccagga1200147]taactgtgactccaggcccgcaatggatgccctgcaactagcaaattcggcttttgccgt1800148]tgatctgttcaaacaactatgtgaaaaggagccactgggcaatgtcctcttctctccaat2400149]ctgtctctccacctctctgtcacttgctcaagtgggtgctaaaggtgacactgcaaatga3000150]aattggacaggttcttcattttgaaaatgtcaaagatgtaccctttggatttcaaacagt3600151]aacatcggatgtaaacaaacttagttccttttactcactgaaactaatcaagcggctcta420
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ttcaatattgaatttttcctatgctattga caataaaata ttattgaactaca263权利要求
一种Maspin基因的原位杂交检测试剂盒在制备检测乳腺癌疾病药物中的应用，所述的试剂盒包括杂交探针、标记物，所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的杂交探针序列如SEQID NO. 1所 示的RNA序列。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述的标记物选自放射性核素或非 放射性标记物。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述的放射性核素选自3H、35S、125I或32P 中的一种。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述的非放射性标记物选自生物素、地高 辛、碱性磷酸酶、辣根过氧化酶或荧光素中的一种。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述的非放射性标记物优选自地高辛。
7.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述的试剂盒还包括增效剂，所述的 增效剂是碱性磷酸酶抗体。
8.一种Maspin基因的原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针、标记物，其特征在于，所述 的杂交探针序列如SEQ ID NO. 1所示，所述的标记物选自放 射性核素或非放射性标记物。
9.一种Maspin基因的原位杂交检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤a、将权利要求8所述试剂盒中的杂交探针与底物中待测RNA接触，形成杂交复合体；b、检测a步骤得到的杂交复合体。
10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于a步骤中形成杂交复合体的条件为 核酸杂交的温度为42°C ；核酸杂交的时间为16-24小时，所述的底物选用血液细胞标本或 组织细胞标本。
全文摘要
本发明涉及一种Maspin基因的原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针、标记物，所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还提供了一种Maspin基因原位杂交检测方法。另外，本发明还提供了试剂盒在制备检测乳腺癌疾病药物中的应用。本发明优点在于本发明提供的试剂盒具有灵敏度高、特异性强的特点。本发明的检测方法操作方便、简单，能在区级以上医院普遍使用和推广。
文档编号C12Q1/68GK101993937SQ20091005617
公开日2011年3月30日 申请日期2009年8月10日 优先权日2009年8月10日 公开号200910056174.9
发明者张云福, 裘建英 申请人:芮屈生物技术(上海)有限公司