专利名称：一种用酶比色反应测定β-羟丁酸的方法及其配用的试剂盒和其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于医学检验测定技术领域，具体涉及一种用酶比色反应测定P-羟丁酸
的方法及其配用的试剂盒和其用途。
背景技术：
目前血清|3 -羟丁酸的测定目前检测的方法是酶动力学法，在辅酶I (NAD+)存在
的条件下，P-羟丁酸在P-羟丁酸脱氢酶的作用下生成乙酰乙酸、还原型辅酶I(NADH)及
氢离子，反应生成的还原型辅酶I (NADH)在340nm吸光度的变化可以间接反映病人血清中
的P-羟丁酸的浓度。其反应过程如下
e -羟丁酸脱氢酶
e -羟丁酸+辅酶i--^乙酰乙酸+还原型辅酶i +氢离子 但是此方法易受外源性的干扰。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的现状，而提供一种在酶动力学法反 应测定P-羟丁酸的基础上偶联了一步酶反应，从而保证精确度高及其配速度快、操作简 单的用酶比色反应测定P-羟丁酸的方法。 本发明的另一个目的是提供用以实现用酶比色反应测定P-羟丁酸的方法配用 的试剂盒。 本发明的第三个目的是一种用酶比色反应测定P-羟丁酸的方法配用的试剂盒 的用途，用来判断人体酮症酸中毒程度。 本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为一种用酶比色反应测定P-羟丁 酸的方法，所采取的措施为P-羟丁酸与辅酶I在P-羟丁酸脱氢酶的催化下脱氢生成乙 酰乙酸和还原型辅酶I，生成的还原型辅酶I和碘硝基四氮唑紫在黄递酶的催化下反应生 成最高吸光率在505nm处的红色物质甲月替(formazane)，并在505nm波长处测定红色物质 甲月替(formazane)吸光度的变化来定量生物样本中P _羟丁酸的含量，其反应方程式如
下
0 -羟丁酸脱氢酶
e-羟丁酸+辅酶i---------^乙酰乙酸+还原型辅酶i+氢离子
黄递酶
还原型辅酶I+碘硝基四氮唑紫--^甲月替(formazane) +辅酶I。 采取的措施还包括 在上述的一种用酶比色反应测定P-羟丁酸的方法中，上述的反应过程具体为在0. 225ml的试剂I中加入6 ii L的0 4. 5mmol/L的P -羟丁酸，并置于37。C水浴5分钟，并 读取吸光度AO，加入0. 075ml的试剂11，37"水浴5分钟后，读取吸光度Al， AA = Al-AO。
在上述的一种用酶比色反应测定P-羟丁酸的方法中，所述的试剂I包括 lOOmmol/L的Tris-HCL缓冲液、pH值为8. 5的20mmol/L的草酸、2. 5mmol/L的辅酶I、1KU/ L的黄递酶以及lmmol/L的碘硝基四氮唑紫，所述的试剂II包括1KU/L的P -羟丁酸脱氢 酶。 在上述的一种用酶比色反应测定13 -羟丁酸的方法中，其特征是13 -羟丁酸的含 量计算按以下公式进行计算 P -羟丁酸浓度(mmol/L) = ECX AAX/AAC ; 其中AX =样本吸光率A5。5 Ac =标准品吸光率A5。5Ec = P -羟丁酸标准品浓度(mmol/L)。 —种用酶比色反应测定P-羟丁酸的方法配用的试剂盒，所述的试剂盒由以下成 分组成包括试剂I，试剂II、 P-羟丁酸标准品、P-羟丁酸异常血清对照以及266测试/ 盒，所述的试剂I包括100mmol/L的Tris-HCL缓冲液、pH值为8. 5的20mmol/L的草酸、 2. 5mmol/L的辅酶I、1KU/L的黄递酶以及lmmol/L的碘硝基四氮唑紫，所述的试剂II包括 1KU/L的13 -羟丁酸脱氢酶，所述的试剂I为120ml ，试剂II为40ml 。 在上述的一种用酶比色反应测定P-羟丁酸的方法配用的试剂盒中，所述的每个 试剂盒包含试剂I 一瓶60ml 、试剂II 一瓶20ml 、 P -羟丁酸标准品一瓶1ml 、 P -羟丁酸异 常血清对照一瓶1ml 。 —种用酶比色反应测定P-羟丁酸的方法配用的试剂盒的用途，该测定用于判断 人体酮症酸中毒诊断。 在上述的一种用酶比色反应测定P-羟丁酸的方法配用的试剂盒的用途中，所依
据的原理反应方程式如下
0 -羟丁酸脱氢酶
e-羟丁酸+辅酶I---------^乙酰乙酸+还原型辅酶I +氢离子
黄递酶
还原型辅酶I+碘硝基四氮唑紫--^甲月替(formazane) +辅酶1。 与现有技术相比，本发明的优点在于可线性测定生物样本中P-羟丁酸浓度范 围，并应用液体双试齐U，测定P _羟丁酸所需样本量少，仅需6 P L血清即可，此夕卜，测定时反 应时间短，操作简单，适用于大量检测，同时也方便通过测定血中P-羟丁酸的含量可作为 糖尿病患者病情变化的指标，为防止并发症的产生和酮症酸中毒形成提供了及时可靠的防 治依据。
具体实施例方式
以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并 不限于这些实施例。 本发明酶比色法反应测定13 -羟丁酸是在酶动力学法反应测定13 -羟丁酸的基础上偶联了一步酶反应，反应过程当中，首先P-羟丁酸在P-羟丁酸脱氢酶的作用下生成乙 酰乙酸、还原型辅酶I及氢离子，生成的还原型辅酶I和碘硝基四氮唑紫在黄递酶的催化下 反应生成红色物质甲月替(formazane)在505nm处有最高吸光度，其反应方程式如下
e -羟丁酸脱氢酶
e-羟丁酸+辅酶i---------^乙酰乙酸+还原型辅酶i+氢离子
黄递酶
还原型辅酶I+碘硝基四氮唑紫--^甲月替(formazane) +辅酶I 1.试剂组成试剂I包括100mmol/L的Tris-HCL缓冲液、pH值为8. 5的20mmol/L的草酸、 2. 5mmol/L的辅酶I、1KU/L的黄递酶以及lmmol/L的碘硝基四氮唑紫，所述的试剂II包括 1KU/L的13 -羟丁酸脱氢酶
2. P -羟丁酸测定
1)反应过程在0. 225ml的试剂I {100,1/LTris-HCL缓冲液、pH值为8. 5的20,1/L的草 酸、2. 5mmol/L的辅酶I、1KU/L的黄递酶以及lmmol/L的碘硝基四氮唑紫}中加入L的 0 4. 5mmol/L的P -羟丁酸，并置于37。C水浴5分钟，并读取吸光度A0，加入0. 075ml的 试剂II (1KU/LP -羟丁酸脱氢酶)，37t:水浴5分钟后，读取吸光度Al， AA = Al-AO。
2)计算及结果 |3 -羟丁酸的含量计算按以下公式进行计算 P -羟丁酸浓度(mmol/L) = ECX A Ax/ A Ac ; 其中AX =样本吸光率A5。5 Ac =标准品吸光率A5。5 Ec = |3 -羟丁酸标准品浓度(mmol/L)， 结果13 -羟丁酸线性范围0 4. 5mmol/L。 —种用酶比色反应测定13 -羟丁酸的方法配用的试剂盒，所述的试剂盒由以下成 分组成包括试剂I，试剂II、 P-羟丁酸标准品、P-羟丁酸异常血清对照以及266测试/ 盒，所述的试剂I包括lOOmmol/L的Tris-HCL缓冲液、pH值为8. 5的20mmol/L的草酸、 2. 5mmol/L的辅酶I、1KU/L的黄递酶以及lmmol/L的碘硝基四氮唑紫，所述的试剂II包括 1KU/L的13 -羟丁酸脱氢酶，所述的试剂I为120ml，试剂II为40ml，所述的每个试剂盒包 含试剂I 一瓶60ml、试剂II 一瓶20ml、 P -羟丁酸标准品一瓶lml、 P -羟丁酸异常血清对 照一瓶lml，检测介质血清，主要适用于体外诊断。
试剂配置 本试剂盒为液体双试剂，可直接上机使用。如果受限于分析仪比色杯容积限制，可 以依比例(详见试验参数)调整试剂试剂1、样本/标准品/血清对照及试剂试剂II使用 试剂的稳定与贮存期试剂及标准品避光保存2 8t:—年，严禁冷冻，P-羟丁酸
质控血清2 8t:或冷冻保存一年。
5
倍数。
样本处理
1) 空腹采血并尽快分离血清；
2) 血清标本2 8t:保存稳定一周，_201:冷冻保存可稳定3个月。 试验参数与操作步骤
温度 37 °C
测试方法 终点法
启动反应 6 ii L样本/标准品/血清对照+225 ii L试剂I (或依比例混匀) 孵育时间 5min
终止反应力B 75 ii L试剂11 (或依比例混匀) 延迟时间 10min 测试仪 日立710Q
1. 试剂和样品用量可因仪器不同，按比例增减。
2. 测试中P-羟丁酸正常或升高血清对照应作为阴性或阳性参照。
3. 若样品P-羟丁酸浓度大于4. 5mmol/L，须用生理盐水稀释样品，结果乘以稀释
4. 如保存不当，试剂发现有浑浊时，应弃用。
5. 溶血对测定有干扰，操作过程中要尽量避免溶血。
参考值正常参考范围0 0. 28mmol/L，各实验室需要根据自身实验条件自行制 定正常人血清e-羟丁酸范围。 —种用酶比色反应测定13 -羟丁酸的方法配用的试剂盒的用途，用于测定血清标 本中的13 _羟丁酸含量，从而用来判断人体酮症酸中毒的危险性，这里酮体是脂肪酸的代 谢产物，包括乙酰乙酸、P-羟丁酸、丙酮，其中绝大部分为P-羟丁酸，血清中P-羟丁酸 的含量可以反映酮体的含量。糖尿病患者病情与葡萄糖的利用密切相关，与脂类的代谢密 切相关。目前用于糖尿病病情监测的指标主要有血糖、糖化血红蛋白，二者是血中糖在不同 时期的反映，不能充分说明体内脂类代谢情况和病情发展趋势，而体内酮体的含量可反映 脂肪的代谢的状况，血清中P-羟丁酸的测定可作为脂肪毒性作用的观察指标。长链脂肪 酸长期作用胰岛将损害葡萄糖氧化代谢和葡萄糖引起的胰岛素分泌，加速了糖尿病患者病 情的发展，有研究表明，高脂肪酸使平滑肌细胞排列无序化，失去特征结构，变为泡沫细胞。 对血中酮体的检测，可及时有效地控制血脂水平，有助于预防和推迟动脉粥样硬化的发生 和发展。因此，血中P-羟丁酸的测定可作为糖尿病患者病情变化的指标，为防止并发症的 产生和酮症酸中毒形成提供了及时可靠的防治依据。
原理 在ra为8. 5的Tris-HCL缓冲液体系下血清P-羟丁酸与辅酶I在P-羟丁 酸脱氢酶的催化下脱氢生成乙酰乙酸和还原型辅酶I。生成的还原型辅酶I和碘硝基四 氮唑紫(INT)在黄递酶的催化下反应生成最高吸光率在50511111处的红色产物-甲月替 (formazane)，据此可在505nm波长处测定红色产物吸光度的变化来定量生物样本中P _羟
丁酸的含量，所依据的原理其反应过程为
6e -羟丁酸脱氢酶
e -羟丁酸+辅酶i--^乙酰乙酸+还原性辅酶i+氢离子
黄递酶
还原性辅酶I+碘硝基四氮唑紫--^甲月替(forraazane)(红色)+辅
酶I (AMax = 505nm) 本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领 域的技术人员可以对所描术的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替 代，但并不会偏离本发明的精神所定义的范围。
权利要求
一种用酶比色反应测定β-羟丁酸的方法，其特征是β-羟丁酸与辅酶I在β-羟丁酸脱氢酶的催化下脱氢生成乙酰乙酸和还原型辅酶I，生成的还原型辅酶I和碘硝基四氮唑紫在黄递酶的催化下反应生成最高吸光率在505nm处的红色物质甲月替(formazane)，并在505nm波长处测定红色物质甲月替(formazane)吸光度的变化来定量生物样本中β-羟丁酸的含量，其反应方程式如下F2009101556381C00011.tif
2. 根据权利要求l所述的一种用酶比色反应测定P-羟丁酸的方法，其特征是上述的反应过程具体为在0. 225ml的试剂I中加入6 ii L的0 4. 5mmol/L的P -羟丁酸，并置 于37t:水浴5分钟，并读取吸光度AO，加入0. 075ml的试剂11，37t:水浴5分钟后，读取吸 光度Al， AA = Al-AO。
3. 根据权利要求2所述的一种用酶比色反应测定P-羟丁酸的方法，其特征是所述 的试剂I包括100mmol/L的Tris-HCL缓冲液、pH值为8. 5的20mmol/L的草酸、2. 5mmo1/ L的辅酶I、1KU/L的黄递酶以及lmmol/L的碘硝基四氮唑紫，所述的试剂II包括1KU/L的 P-羟丁酸脱氢酶。
4. 根据权利要求3所述的一种用酶比色反应测定P-羟丁酸的方法，其特征是P-羟 丁酸的含量计算按以下公式进行计算P -羟丁酸浓度(mmol/L) = ECX AAX/AAC ;其中^=样本吸光率~。5Ac二标准品吸光率A^Ec = 13 -羟丁酸标准品浓度(mmol/L)。
5. —种用酶比色反应测定P-羟丁酸的方法配用的试剂盒，其特征是所述的试剂盒 由以下成分组成包括试剂I，试剂II、 P-羟丁酸标准品、P-羟丁酸异常血清对照以及 266测试/盒，所述的试剂I包括100,1/L的Tris-HCL缓冲液、pH值为8. 5的20,1/L 的草酸、2. 5mmol/L的辅酶I、1KU/L的黄递酶以及lmmol/L的碘硝基四氮唑紫，所述的试剂 II包括1KU/L的13 -羟丁酸脱氢酶，所述的试剂I为120ml ，试剂II为40ml 。
6. 根据权利要求5所述的一种用酶比色反应测定P-羟丁酸的方法配用的试剂盒，其 特征是所述的每个试剂盒包含试剂I 一瓶60ml 、试剂II 一瓶20ml 、 P -羟丁酸标准品一 瓶lml、 13 -羟丁酸异常血清对照一瓶1ml 。
7. —种用酶比色反应测定P-羟丁酸的方法配用的试剂盒的用途，其特征是该测定 用于判断人体酮症酸中毒诊断。
8. 根据权利要求7所述的一种用酶比色反应测定P-羟丁酸的方法配用的试剂盒的用途，其特征是所依据的原理反应方程式如下 <formula>formula see original document page 2</formula>
全文摘要
本发明提供了一种用酶比色反应测定β-羟丁酸的方法及其配用的试剂盒和其用途。在Tris-HCL缓冲液体系下血清β-羟丁酸与辅酶I在β-羟丁酸脱氢酶的催化下脱氢生成乙酰乙酸和还原型辅酶I，生成的还原型辅酶I和碘硝基四氮唑紫在黄递酶的催化下反应生成最高吸光率在505nm处的红色物质甲月替(formazane)，据此可在505nm波长处测定红色产物吸光度的变化来定量生物样本中β-羟丁酸的含量。本法可线性测定生物样本中β-羟丁酸浓度范围(0～4.5mmol/L)，该测定用于判断人体酮症酸中毒诊断，本发明所用试剂应用液体双试剂，测定β-羟丁酸所需样本量少，此外，测定时反应时间短，操作简单，适用于大量检测。
文档编号C12Q1/32GK101726463SQ200910155638
公开日2010年6月9日 申请日期2009年12月24日 优先权日2009年12月24日
发明者张闻 申请人:张闻