专利名称：一种重组毕赤酵母发酵方法
技术领域：
本发明涉及一种新的重组毕赤酵母发酵方法。
背景技术：
巴斯德毕赤酵母表达系统是近20年来发展起来的一种真核表达系统。Koichi Ogata等人于1969年首次发现了可以利用甲醇为唯一碳源和能源生长(Koichi Ogata， et al.l969)的酵母。由于这一特性，早期毕赤酵母被用来生产单细胞蛋白。直到，1987年， Cregg等人才首次将毕赤酵母用于外源基因的表达(JMCregg， etal.1987)。巴斯德毕赤酵 母表达系统既具有原核表达系统基因操作简易、易于培养、生长速度快、表达量高、生 产成本低等优点，同时还具有真核表达系统的对外源蛋白的翻译后修饰等特点，如糖基 化、蛋白磷酸化等。与酿酒酵母表达系统相比，它还避免了其分泌效率差、表达菌株不 够稳定、表达质粒易丢失等缺陷。由于这些优点使得该系统成为目前研究最多、应用最 广泛的真核表达系统之一。 在毕赤酵母利用甲醇的代谢途径中存在两个乙醇氧化酶，AOXl和AOX2。其 中AOXl承担大部分的乙醇氧化酶活性。根据AOX1和AOX2基因的完整性不同，毕赤 酵母表现出三种甲醇利用表现。当AOXl和AOX2基因都完整时，毕赤酵母菌株表现出 甲醇快速利用的表型(mut+);当AOXl被敲除、AOX2基因完整时，毕赤酵母菌株表现出 甲醇慢速利用的表型(muts);当AOXl和AOX2基因都被敲除时，毕赤酵母菌株表现不利 用甲醇生长的表型(mut-)。在表达外源蛋白时，后面两种表型有时优于mut+，而且甲醇 的消耗量小。三种表型的菌株均可以在AOXl启动子的调控下控制外源蛋白的表达。但 是在三种表型重组毕赤酵母菌株的发酵策略上存在一定的差异。 毕赤酵母发酵工艺一般分为三个阶段，甘油分批发酵阶段、甘油补料阶段和外 源基因诱导表达阶段。前两个阶段对于三种表型都是一样，但在外源基因诱导表达阶段 却有较大的不同。对于!!1加+-重组菌，在甲醇诱导时菌体还可以利用甲醇生长，故在诱 导阶段多采用直接甲醇补料；对于muts重组菌，在甲醇诱导菌体生长缓慢，为了维持一 定的生长速度，在诱导阶段多采用混合补料，如甲醇-甘油混合补料、甲醇-山梨醇混 合补料和甲醇-乳酸混合补料等；对于mut-重组菌，在甲醇诱导菌体不生长，为了维持 一定的生长速度，在诱导阶段加入一定量的甲醇后，还需流加甘油等维持菌的生长。在 诱导阶段，不同的甲醇流加策略对重组菌表达外源蛋白的影响很大。文献中报道的甲醇 流加策略有间歇式恒速流加、DO stat流加和居于甲醇传感器的反馈控制流加。这些 甲醇流加方式在不同程度上存在局限性。间歇式恒速流加流加速率的控制比较困难， 当流加速率设置的太大，容易造成发酵液中甲醇的蓄积，从而影响外源蛋白的表达，当 流加速率设置的太小，发酵液中甲醇浓度始终处于很低的水平，影响诱导效果。DOstat 流加，发酵液中甲醇浓度始终处于很低的水平，诱导效果不加。居于甲醇传感器的反馈 控制流加，该方法需要使用甲醇传感器，目前甲醇传感器还不是很成熟，还存在一些问 题，如传感器对甲醇浓度非线性响应、零点漂移等，在此基础上要进行有效控制有一定的困难。因此，设计简单易行的甲醇流加策略，对于提高发酵表达外源蛋白十分重要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种毕赤酵母发酵方法，从而可以通过高密度发酵，高 效地生产外源蛋白。 本发明所述的重组毕赤酵母发酵方法，包括三个阶段，甘油分批发酵阶段、甘 油补料发酵阶段和外源基因诱导表达阶段。甘油分批阶段，菌体利用培养中甘油生长， 当培养基中甘油耗尽时开始流加甘油，进一步提高菌浓。最后进入外源基因诱导表达阶
段，在该阶段采用脉冲式流加甲醇诱导外源基因表达。 本发明所说脉冲式甲醇流加是指在发酵液中甲醇耗尽时，以发酵液中溶氧反弹 作为指示， 一次性流加甲醇使发酵液中甲醇浓度至设定值。待下一次甲醇耗尽时，重复 这一操作，周期性执行，直至发酵结束。 本发明的优点是综合了 DO Stat和间歇式恒速流加的优点，即以溶氧作为发酵液 中甲醇是否耗尽的指示，当溶氧反弹表示发酵液中甲醇耗尽，然后以恒速流加的方式一 段时间甲醇至所需浓度。有效克服了外源基因诱导表达阶段甲醇间歇式恒速流加、DO stat流加和居于甲醇传感器的反馈控制流加存在的不足，
图1、诱导阶段过程数据图 图2、诱导不同时间下融合蛋白IFN13 -HSA表达情况的SDS-PAGE分析 M :低分子量标准；1 :诱导前的样品；2 :诱导12h的样品；3 :诱导24h的 样品；4 :诱导36h的样品；5 :诱导48h的样品；6 :诱导60h的样品；7 :诱导72h的 样品；8 :诱导84h的样品；9 :诱导96h的样品； 图3、诱导不同时间下融合蛋白IFN a 2b-HSA表达情况的SDS-PAGE分析 M :低分子量标准；1 :诱导24h的样品；2 :诱导36h的样品；3 :诱导42h的
样品；4 :诱导59h的样品；5 :诱导66h的样品；7 :诱导70h的样品；7 :诱导90h的 样品；8 :诱导96h的样品
实施例1表达P干扰素-人血清白蛋白融合蛋白的工程菌GS115/pPIC9K-IFNP -HSA由
本室构建保存，该重组毕赤酵母甲醇利用表型为mut+。 取lml-8(TC甘油管保存的菌种GS115/pPIC9K-IFNP-HSA，融化后，接入装 有50ml BMGY培养基(1 % Yeast Extract, 2 % Peptone, 2 % Glycerol, lOOmM potassium phosphate pH6.0， 1.34 % Yeast Nitrogen Base, 4X 10-5Biotin)的250ml摇瓶中，于 200rmp， 3(TC培养24h，制备得到一级种子。取以5 %的接种量将一级种子接入装有 100ml BMGY培养基的1L三角瓶中，于200rmp， 3(TC培养24h，制备得到二级种子。 按5%的接种量把二级种子接入装有2L BMGY培养基的5L发酵罐中，设定发酵初始条 件为温度3(TC、转速500rpm、通气量2VVM、 pH6.0后开始发酵。发酵约22h左右，初 始培养基中的碳源甘油消耗完，溶氧开始反弹，此时开始流加补料生长培养基(5% Yeast Extract, 10 % Peptone, 10 % Glycerol, 6.7 % YNB， 2X10-4 % Biotin)，流速为2.5mL/min，共补料600mL。补料完成后，待再次溶氧上升超过60%时，开启甲醇脉冲式流加， 一次性补加0.5%发酵液体积的甲醇。周期性执行，每当溶氧上升超过60%时， 一次性补 加0.5%发酵液体积的甲醇，诱导96h，典型的诱导阶段过程曲线如图1。 SDS-PAGE电 泳检测不同时段表达情况(如图2)，用双抗体夹心Elisa方法定量检测发酵结束时融合蛋 白的表达量为500mg/L。
实施例2表达干扰素a 2b-人血清白蛋白融合蛋白的工程菌GS115/pPIC9K-IFN a 2b-HSA
由本室构建保存，该重组毕赤酵母甲醇利用表型为mut+。 取lml-80。C甘油管保存的菌种GS115/pPIC9K-IFNa 2b-HSA，融化后，接入装 有50mlBMGY培养基的250ml摇瓶中，于200rmp， 3(TC培养24h，制备得到一级种子。 取以5%的接种量将一级种子接入装有100mlBMGY培养基的1L三角瓶中，于200rmp， 3(TC培养24h，制备得到二级种子。按5X的接种量把二级种子接入装有2LBMGY培养 基的5L发酵罐中，设定发酵初始条件为温度3(TC、转速500rpm、通气量2VVM、 pH6.0 后开始发酵。发酵约22h左右，初始培养基中的碳源甘油消耗完，溶氧开始反弹，此时 开始流加补料生长培养基，流速为2.5mL/min，共补料600mL。补料完成后，待再次溶 氧上升超过60%时，开启甲醇脉冲式流加， 一次性补加0.5%发酵液体积的甲醇。周期性 执行，每当溶氧上升超过60%时， 一次性补加0.5%发酵液体积的甲醇，诱导96h，典型 的诱导阶段过程曲线如图1。 SDS-PAGE电泳检测不同时段表达情况(如图3)，用双抗体 夹心Elisa方法定量检测发酵结束时融合蛋白的表达量为300mg/L。
权利要求
一种重组毕赤酵母的发酵方法，该发酵方法包括三个部分，甘油分批阶段、甘油补料阶段和甲醇诱导表达表达阶段，其特征在于，甲醇诱导表达表达阶段甲醇诱导表达阶段采用甲醇脉冲式补料。
2. 如权利要求1所述发酵方法，其特征在于，其中所说的甲醇脉冲脉冲式补料是在发 酵液中甲醇耗尽时一次性补入甲醇使发酵液中甲醇浓度至设定值，周期性执行这一操作 直至发酵结束。
3. 如权利要求2所述，其特征在于，设定的甲醇浓度范围为0.05%至5%。
4. 如权利要求3所述，其特征在于，设定的甲醇最佳浓度为0.5%。
全文摘要
本发明涉及一种新的重组毕赤酵母的发酵方法。在甘油生长重组毕赤酵母的基础上，采用脉冲式甲醇补料诱导重组蛋白的表达。该方法在甲醇流加控制时不需使用甲醇传感器，同时克服DO stat补料诱导过程中的甲醇浓度过低，也克服了恒速间歇式恒速流加诱导过程中由于补料速度过快而带来的甲醇蓄积和补料速度过低导致的甲醇浓度过低等缺点。采用脉冲式甲醇补料后，重组长效融合干扰素的表达量得到了很大程度的提高。
文档编号C12P21/02GK101691595SQ20091018469
公开日2010年4月7日 申请日期2009年8月28日 优先权日2009年8月28日
发明者储敏, 朱瑞宇, 李英, 金坚, 陈蕴, 雷楗勇 申请人:江南大学