造血干细胞生长因子的制作方法

专利名称：造血干细胞生长因子的制作方法
技术领域：
本发明总体而言涉及干细胞，具体而言涉及造血干细胞(HSC)生长因子以及使用它的方法。
背景技术：
多效生长因子(PTN)是一种14kDa的具有多效性的肝素结合生长因子。PTN在胚胎形成时被彻底调控，并在维管组织和结缔组织中以及在发育过程中在神经系统中表达。 PTN的表达在成年个体中主要是下调的，并且已证实其仅在成年个体的成骨细胞、睾丸间质细胞、神经细胞和脂肪组织中表达。已证实PTN对于培养物中的上皮细胞、内皮细胞和成纤维细胞是成长因子。PTN还是涉及乳腺癌和黑素瘤转化的原癌基因。并不知道PTN在造血作用中或是在HSC命运决定的调控中有任何功效(见Deuel et al, Arch. Biochem. Biophys. 397 162 (2002),Gu et al，FEBS Letters 581 :382 (2007)，Meng et al,Proc. Natl Acad. Sci. USA 97 :2603(2000), Perez-Pinera et al, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 103 17795(2006), Fukuzawa et al，Mol. Cell. Biol. 28 :4494(2008))。造血干细胞(HSC)具有自我更新的独特能力，并且是血液和免疫系统的所有成熟因素的成因(Zon, Nature 453:306-13(2008), Orkin et al, SnapShot :hematopoiesis. Celll32 :712(2008), Kiel et al, Nat Rev Immunol 8 :290-301 (2008)) HSC 的自我更新由内在信号和外在信号两者来调控(Zon，Nature 453 :306-13 (2008)，Orkin et al, SnapShot :hematopoiesis. Cell 132 :712 (2008), Kiel et al, Nat Rev Immunol 8: 290-301(2008), Varnum-Finney et al. Blood 91 :4084-91(1998), Stier et al, Blood 99 :2369-78(2002), Reya,et al, Nature 423 :409-14(2003)，Karlsson et al, J Exp Med 204 :467-74(2007), Zhang et al, Nat Med 12 :240-5(2006), North et al, Nature 447 1007-11 (2007))，但是，该过程的控制所涉及的机制仍未完全为人所知。现已识别出几种其作用与鼠科HSC自我更新有关的生长因子，包括Notch配体(Varnum-Finney et al. Blood 91:4084-91(1998),Stier et al,Blood 99 :2369-78(2002))、Wnt 3a(Reya, et al,Nature 423 :409-14^003))、血管生成素样蛋白(Zhang et al，Nat Med 12 :240-5(2006))以及前列腺素E2(North et al，Nature447 :1007-11 (2007))。或者，HSC与支持性间质细胞或内皮细胞的共培养(Hackney et al, Proc Natl Acad Sci U S A 99 :13061-6(2002), Chute et al, Blood 100 :4433-9(2002))或者转录因子 HoxB4 或 HoxA9 的强制表达(hn，Nature 453 :306-13 (2008), Antonchuk et al, Cell 109 :39-45 Q002))会引起培养物中 HSC 的强力扩增。但是，需要细胞共培养或HSC的基因修饰的策略并不容易转化至临床(Blank etal,Blood 111 :492-503 Q008))。此外，尽管对HSC自我更新及分化的生物学研究的理解已有进展，但对能诱导HSC体内再生的可转化的生长因子的识别和发展仍持续滞后。以年来计算，HSC移植法对于成千上万患有恶性血液病的人来说是一种有效疗法。 但是，对于有条件被选中的更大数量的人实施HSC移植法的能力受限于HSC的稀有性并受限于无法以医疗为目的扩增这些细胞。每年有几十万人为了治疗癌症要接受化学疗法和/ 或放射疗法，而这些患者中的大多数因其对HSC和祖细胞的伤害而遭受血液毒性。对能够在试管内或体内导致HSC自我更新和扩增的新型生长因子的识别和特征化将会为这类患者的新的治疗方法提供基础，并能用于加速从化学疗法和/或放射疗法中的恢复。几十万人可能会受益于这种(这些)生长因子，就像服用优保津(Neupogen) (GCSF)和促红细胞生成素所得结果那样，这两者各自刺激了嗜中性粒细胞和红细胞的恢复。本发明至少部分源于如下的研究，所述研究显示出PTN对HSC来说是一种可溶性的生长因子，并且会引起HSC的自我更新。

发明内容
本发明总体而言涉及干细胞。更具体而言，本发明涉及HSC生长因子以及使用它在体内和试管内引起或增进HSC自我更新和/或扩增的方法。根据后面的描述，本发明的目的和优点将会更加清楚。


图IA和图IB 源自人脑的内皮细胞(HUBEC)过表达PTN。(图1A)生物芯片分析表明，与非脑内皮细胞(EC) (η = 8)相比，来自7个不同供体的原发HUBEC过表达PTN。(图 IB) qRTPCR分析证实了与非脑EC相比，HUBEC过表达PTN达100 1000倍。图2A 图2E =PTN导致在HUBEC培养液中发现的HSC的扩增。使用HUBEC加上同种型对照抗体(IgG)或使用HUBEC加抗PTN抗体(a_PTN)将⑶34—KSL细胞培养7天。将这些培养液的后代连同用于辐射防护的自体骨髓(BM)细胞一起移植到受到致命性辐射的小鼠体内。使用抗PTN的处理阻碍了 HSC在HUBEC培养液中的扩增，暗示了 PTN给试管内 HSC的自我更新和扩增发出信号。所示为10个细胞(图2A)、30个细胞(图2B)或100个细胞(图2C)的移植后，接受了致命性辐射的小鼠体内的8周45. 1供体植入的散点图。12 周的评价点示于图2D和图2E。图3A 图3H :HUBEC培养导致了能分化骨髓、淋巴和类红细胞的HSC的显著扩增， 并且该扩增被使用抗PTN的处理完全抵消。在用抗PTN处理的HUBEC培养液中，供体T细胞 (图3A和图3B)和骨髓细胞(图3C和图3D)的体内粒子数再增明显降低，意味着抗PTN对于培养液中HSC的扩增是关键的。B细胞(图3E和图3F)以及类红细胞(图3G和图3H) 的体内扩增也基本上由使用抗PTN的处理抵消，进一步证实多效再植细胞在HUBEC培养期间得到了扩增，并且该扩增被使用抗PTN的处理完全消除。图4A 图4D (图4A)用重组人PTN培养的34—KSL后代的表型分析。图4B 四周的竞争再植单元(CRU)数据。图4C:四周的CRU估测。图4D:用PTN进行的HSC的处理没有改变HSC的常规多向分化潜能。图 5 人 PTN 的 cDNA 序列。
图6A 图6H:用PTN进行的处理足以引发LT-HSC的扩增。(图6A)通过细胞离心涂片器收集C57B16 BM MNC,并用25ng/mL的抗RPTP β / ζ -FITC抗体或同种型对照抗体染色。(顶部)示出了用RPTPii/ζ染色的BM MNC与同种型对照对比的有代表性的高倍视野显微图像(20χ)。(底部)流式细胞仪分析确认了 89%的BM KSL细胞表达RPTP β / ζ。(图 6Β)用 20ng/mL 的促血小板生成素、120ng/mL 的 SCF 和 50ng/mL 的 Flt-3 配体(“TSF”)， 在提高和不提高PTN浓度(10、100和lOOOng/mL)的情况下用7天在培养板上的液体悬浮液中培养BM 34—KSL细胞(500细胞/孔)。显示出了总细胞的扩增倍数、％ KSL细胞和KSL 细胞的扩增。(左侧)与单独用TSF培养相比(黑色条带)，在TSF中10ng/ml和100ng/ml 的PTN的添加(灰色条带)导致总细胞的明显增加(平均值士SD，n = 3,*P = 0.01广P = 0. 006)。(中间)与单独用TSF培养相比，在用10ng/ml或100ng/ml的PTN+TSF处理的培养液中％ KSL细胞同样明显增加了(平均值士SD，η = 3，*P = 0. 04，**P = 0. 004)。(右侧)与单独TSF的后代相比，用10ng/mL或100ng/mL的PTN+TSF处理的BM 34KSL细胞的后代显示出总KSL细胞的明显增加(平均值士SD，n = 3,*P = 0. 005, **P = 0. 006)。所有的对比均为单尾t检验。(图6C)将有限剂量(10个细胞)的BM 34—KSL(⑶45. 1+)细胞或者它们的单独用TSF或用TSF+lOOng/mL的PTN培养了 7天后的后代通过尾部静脉注射移植到接受了致命性辐射的CD45. 2+小鼠中。在12周时，在周围血液(PB)中测定来源于供体的 ⑶45. 1+细胞的植入水平。散点图示出了总⑶45. 1+供体细胞和来源于供体的B220+(B-淋巴)、Mac-l+/Gr-r (骨髓)和Thyl. 2+(T细胞)群在所有移植了 10个BM 34—KSL细胞或它们的培养后的后代的小鼠中的百分比(η = 8 10只小鼠每组)。在12周时，移植了用 TSF+PTN培养的34—KSL细胞的后代的小鼠显示出> 10倍高的总⑶45. 1+细胞植入水平(平均值士SD，P = 0. 006)以及明显增加的B-淋巴(P = 0.003)、骨髓(P = 0. 03)和T细胞植入水平(P = O. 006)，该数据是通过与移植了相同剂量的O日BM 34—KSL细胞或它们的单独用TSF培养的后代的小鼠比较得出的(分别为P = 0. 007，P = 0. 004，P = 0. 04，P = 0.007;单尾t检验)。水平线代表每一组的平均植入水平。(图6D)示出了在移植了 10个 BM 34KSL细胞的小鼠vs.移植了用TSF+100ng/mL PTN培养后的10个BM 34KSL细胞后代的小鼠中移植后12周的来源于PB供体的(CD45. 1+)多向植入的代表性流式细胞仪分析。 在每个象限中示出了总体的百分比。(图6E)进行了有限稀释分析，其中CD45. 2+小鼠接受了致命性辐射，然后移植了有限剂量(10、30和100个细胞)的CD45. I+BM 34_KSL细胞或它们的单独用TSF或用TSF+lOOng/mL的PTN培养的后代。进行了泊松统计分析，获得了各图，其允许在各个条件下对CRU含量进行估测(n = 8 10只在每种条件下用每一剂量移植的小鼠；总计η = 75只小鼠)。各图显示出在移植后12周时PB中含有少于⑶45. I+ 细胞的受体小鼠与每只小鼠所注射的细胞数相比的百分比。还示出了对于0日BM34—KSL细胞(红线)、BM 34-KSL细胞用TSF+PTN培养后的后代(蓝线)以及单独用TSF培养的后代 (黑线)的CRU估测。(图6F)移植了用PTN处理的34—KSL细胞的小鼠(纹状条带)与移植了 0日:M_KSL细胞的小鼠(黑色条带，平均值士SEM，n = 6 10/组，*P = 0. 006, *P = 0. 002，= 0. 006，P = 0. 05)或单独用TSF培养的34_KSL细胞的后代(灰色条带；平均值士SEM，分别为"P = 0. 005，"P = 0. 002，"P = 0. 007，P = O. 05)相比，在 4、8、12 和 24 周时显示出来源于CD45.1+受体的细胞的增长的粒子数再增。(图6G)使用BM进行了二次
(Secondary competitive repopulating transplant assays), Bf^BM收获自移植了 0日BM 34—KSL细胞(10细胞剂量)或移植了用TSF+PTN培养vs.单独用 TSF培养的后代后M周的初代小鼠。在移植到CD45. 2+第二代小鼠中后的12周时，移植了来自TSF+PTN组小鼠的BM的小鼠与来自移植了 0日34—KSL细胞或单独用TSF培养后的它们的后代的小鼠的BM的受体小鼠相比，显示出明显更高的受体CD45. 1+细胞的粒子数再增 (平均值士SEM，η = 5 6/ 组，分别为 P = O. 003 和 P = 0. 02 ；Mann-Whitney 检测)。水平条带代表PB中CD45. I+细胞植入的平均水平。(图6Η)代表性FACS分析示出了移植了 BM的第二代小鼠的移植后12周时CD45. I+细胞植入以及Β220+、Mac-l./Gr-l+和Thy 1. 2+ 植入水平，所述BM来自于移植了 0日34—KSL细胞或它们的用TSF+PTN培养后的后代的初代小鼠。图7A和图7B =PTN引发PI 3-k/Akt在HSC中发出信号。(图7A)将BM 34KSL 细胞置于仅有TSF或有TSF+lOOng/mL PTN的培养液中，在存在(灰色条带)和不存在1 μ M 的渥曼青霉素(黑色条带)——一种PI 3-激酶抑制剂——的条件下共7天。用TSF+PTN 对34_KSL细胞进行的处理与单独用TSF处理相比提高了总细胞(左侧)和KSL细胞的扩增 (中间)(平均值士SD，n = 3，分别为*P = 0. 04和*P = 0. 04)。相反，渥曼青霉素+TSF+PTN 的后代与用TSF+PTN处理的细胞相比在总细胞和KSL细胞的扩增方面有明显下降(平均值士SD，η = 3，分别为"P = 0. 02，"P = 0. 02)。用TSF+PTN培养的BMIMKSL细胞的后代与单独用TSF培养的后代(右侧)相比同样显示出具有磷酸化Akt的细胞百分比的明显增长 (平均值士SD，n = 3,*P = 0. 03)。相反，TSF+PTN+渥曼青霉素的后代与TSF+PTN的后代相比，磷酸化Akt的水平明显降低了(平均值士SD，n = 3, "P = 0. 04)。(图7B)将BM KSL 细胞置于有TSF (黑色条带)或TSF+lOOng/mL PTN (灰色条带)的培养液中7天，然后在日期+7那一天通过FACS分选将KSL细胞分离，用于qRT-PCR分析以及基因表达的比较。用 TSF+PTN进行的处理与单独用TSF培养相比，导致了 HES-1(平均值士SD，n = 3,*P = 0. 04) 和GFI-I (平均值士SD，n = 3,*P = 0. 005)的表达在KSL细胞中的显著增长，并且PTEN表达显著下降(平均值士SD，n = 3,*P = 0. 002)。所有的比较均为单尾t检验。图8A 图8C:PTN引发BM干细胞和祖细胞的体内再生。让成年B16. SJL小鼠接受700cGy TBI的辐射，然后通过腹腔注射用2 μ g的PTN或盐水处理7天(n = 10只小鼠 /组)。在日期+7那一天，将所有小鼠处死，收集BM细胞，并分析干细胞和祖细胞的含量以及功能。(图8Α)与对照相比，用PTN处理的小鼠显示出明显增加的总BM细胞数和BM KSL 祖细胞数(平均值士SEM，n = 5，分别为*P = 0.03和P = 0.04)。(图8Β):功能性分析显示出，与对照相比，BM集落形成细胞(CFC)在用PTN处理的组中数目增长(平均值士SEM， η = 5，^ = 0.004)。(图8C)在日期+7那一天，在高剂量辐射后，与对照相比，在用PTN 处理的小鼠中用LTC-IC分析测定的BM HSC含量增加至11倍(平均值士SEM，n = 4,*P = 0. 02)。图9A和图9B =HUBEC与非脑EC的基因表达分析。(图9A)从初代HUBEC (n = 6， 每样本3个复制品)和非脑EC(n = 8，每样本3个复制品)中分离出mRNA。对每一样本进行生物芯片分析，给出了热图，其显示出基因在HUBEC和非脑EC中的相对表达(红色=增加的表达，绿色=降低的表达)。非监督式系统聚类分析表明，与非脑EC相比，在HUBEC中有1335个基因(红色条带区)上调。(图9B)(左侧)HUBEC vs.非脑EC中PTN基因表达的生物芯片分析的散点图(平均值25. 1+7. 4vs. 1. 0士0. 3，η = 6 8个样本/组，P =0.001)。水平线代表在各组中的平均PTN表达。(中间)HUBECvs.非脑EC中通过qRT-PCR 的 PTN 表达(平均值士SEM，η = 2 3 每组，HUBECsl vs.冠状脉，P = O. 004 ；HUBECs 1 vs.肺部，P = 0.004)。(右侧)HUBEC条件培养基与非脑EC CM相比，来自ELISA的PTN浓度(平均值士SEM，η = 3, *P = 0. 04)。图IOA 图IOC :PTN信号对于HUBEC介导的HSC扩增来说是必需的。将BM34KSL细胞(500个细胞/孔)置于具有TSF的培养液中，并与具有HUBEC+TSF或HUBEC+TSF+50 μ g/ mL的抗PTN的非接触式培养液对比7天。将IgG同种型抗体添加到HUBEC+TSF培养液中以与在对比培养液中添加抗PTN抗体进行对照。(图10A)将有限剂量(30个细胞)的BM ;MKSL(CD45. 1+)细胞或它们的用 HUBEC+TSF+IgG vs. HUBEC+TSF+ 抗 PTN 培养了 7 天的后代通过尾部静脉注射移植到接受了致命性辐射的(950cGy全身)CD45.2+小鼠中。来自于供体的CD45. 1+细胞植入水平在移植到全部小鼠中之后12周时在PB中进行测定。散点图示出了在所有移植了 30个BM34—KSL细胞或它们的培养了 7天的后代的小鼠中总CD45. I+ 供体细胞以及来自于供体的B-淋巴细胞、脊髓细胞和T细胞群在PB中的百分比。移植了 TSF+HUBEC+IgG培养液的后代的小鼠与移植了相同剂量的0日BM 34—KSL细胞的小鼠相比，显示出明显更高的总⑶45. 1+细胞植入水平(P = 0. 03)以及B-淋巴细胞(B-220+，P =0. 004)和脊髓细胞(Mac-l/Gr-1+，P = O. 01)的植入水平(平均值+SEM，η = 7 10/ 组)。相反，移植了用TSF+HUBEC+抗PTN培养的BM 34-KSL细胞的后代的小鼠与移植了 TSF+HUBEC+IgG后代的小鼠相比，在总⑶45. I+细胞、B-淋巴细胞、脊髓细胞和T细胞(Thy
1.2+)植入水平方面有明显的下降(平均值士SEM，n = 7 10/组，分别为P = O. 004, P = 0. 0001，P = 0. 002，P = 0. 001 ；单尾 t 检验)。(图 10B)示出了在移植了 TSF+HUBEC+IgG 培养液后代的小鼠vs.移植了 TSF+HUBEC+抗PTN后代的小鼠中移植后12周的来源于PB 供体的(CD45. 1+)多向植入的代表性流式细胞仪分析。在每个象限中示出了总体的百分比。(图10C)对PTN信号的抑制防止了 LT-HSC的由HUBEC介导的扩增。在移植了 0日BM 34KSL细胞(30个细胞剂量)或用HUBEC+TSF或HUBEC+TSF+抗PTN培养的34KSL细胞的后代的小鼠中供体⑶45. I+细胞随时间的植入水平。在移植了用HUBEC+TSF培养的34_KSL 细胞后代的小鼠(纹状条带)中的植入水平一贯地高于移植了相同剂量的0日34_KSL细胞的小鼠(黑色条带)，在第8周和第12周时有显著性差异(平均值士SEM，n = 7 10/ 组，分别为*P = 0. 004和*P = 0. 03)。移植了用HUBEC+TSF+抗PTN培养的34KSL细胞后代的小鼠(灰色条带)与移植了用HUBEC+TSF培养的34_KSL细胞后代的小鼠相比，在移植后8周、12周和M周时显示出明显降低的⑶45. 1+细胞植入水平(平均值士SEM，n = 7 10/组，对于 8 周、12 周和 24 周，分别为"P = 0. 0001，"P = 0. 002 和"P = 0. 002)。图11 :PTN并不通过β-连环蛋白发出信号。将来自于flox-β-连环蛋白小鼠 (灰色条带)和β-连环蛋白-/-(LoxPjLoxP ；Vavcre)小鼠(黑色条带)的BM 34—KSL细胞(500 1000个细胞/孔)铺在只具有TSF或具有TSF+lOOng/mL PTN的培养液中7天。 在第7天对细胞进行培养液中％ KSL细胞的分析，以测算响应于PTN处理的造血祖细胞的保留程度。在flox-β-连环蛋白组和β-连环蛋白-/_组的培养液之间，未观察到％ KSL 细胞的差别(平均值士SD，η = 3，*P = 0. 04和**P = 0. 04)。图12A和图12B 促血小板生成素、干细胞因子(SCF)、Flt_3配体组合当与PTN组合时要优于各自的单独细胞因子。
具体实施例方式各种成年内皮细胞(EC)的源都可用于供养鼠科动物、狒狒和人HSC的试管内生长和扩增。主动脉、肾动脉、肺动脉、脐带血管/动脉和脑源性血管的详细比较(Circle of Willis)揭示了 HUBEC会产生可溶性活性，其能在短期(7天)培养中引发人HSC的1 21og扩增。这些研究证实了，这种人HSC的有效扩增并不需要细胞与细胞的接触，但其严格地通过由HUBEC产生的可溶性因子介导。使用生物芯片的广泛基因表达分析已识别出被多种HUBEC源(n = 7 10)过表达(与非脑HEC(n = 7 10)相比，已证实后者不具有这种造血-供养活性)的基因。这种差减分析揭示出几种基因，其中可溶性基因产物为HSC的候选生长因子。选择PTN用于功能特征化。PTN——其在造血作用中不具有注释功能—— 在胚胎形成期间高度表达，在该期间，出现造血作用的决定性发作。接下来的实施例中描述的研究表明，PTN对于HSC来说是一种新型的、重要的生长因子，并且在造血作用的体内调控中起到重要作用。本发明涉及一种使用PTN (例如重组PTN)来引发或增强HSC (例如哺乳动物HSC， 优选人HSC)的自我更新和/或扩增的方法。本发明还涉及基于对哺乳动物(例如人)用 PTN或者是使用PTN试管内扩增的HSC给药的治疗策略。适于在本发明的方法中使用的PTN可以分离自哺乳动物，包括人，或者可以在异源宿主中表达并从中分离，该异源宿主例如为细菌、酵母或培养过的细胞，包括昆虫细胞或哺乳动物细胞(优选灵长类动物细胞，更优选人细胞)。分离方法以及表达并纯化多肽的方法是本领域公知的。优选PTN为哺乳动物PTN(例如，GenBank编号CAA37121、ΑΑΒ24425 ΝΡ_002816 或ΑΑΗ05916)。天然ΡΤΝ(例如人PTN)的使用是优选的，但是，也可使用其具有PTN活性的片段或变体，或者是包含其的融合蛋白。具有PTN活性的PTN片段和/或变体，或者是包含其的融合蛋白，可用来在本发明上述或下述任何实施方案中代替天然ΡΤΝ，而没有其效果的明确声明。对于长期表达，为了避免对表达、分离和/或纯化PTN的需要，或者为了方便PTN 在细胞亚群例如在递送位点中的表达，在实施本发明方法时可使用编码PTN的多核苷酸。 (见图幻这种多核苷酸可存在于载体，例如病毒载体或其他表达载体。适合使用的病毒载体包括逆转录病毒载体(包括慢病毒载体)、腺病毒载体、腺相关病毒载体、疱疹病毒载体以及痘病毒载体。其他的病毒也已显示出能在细胞中表达感兴趣的基因，并且这种重组病毒载体的构建是本领域公知的。(见例如Baum et al，J Hematother5 (4) :323-9(1996)； Schwarzenberger et al, Blood 87 :472-478(1996) ；Nolta et al, Proc. Natl. Acad. Sci. 93 :2414-2419(1996) ；Maze et al, Proc. Natl. Acad. Sci. 93 :206-210(1996)； Mochizuki et al, J Virol 72(11) :8873-83(1998) ；Ogniben and Haas, Recent Results Cancer Res 144 :86-92(1998).)除病毒载体外，非病毒表达载体也可使用。各种真核表达载体的任一种均可使用，条件是能实现足量(并且，也许合适的是，以合适的特异于细胞类型的方式)的PTN的表达。多核苷酸可以可操作地连接于启动子(例如诱导型启动子)的方式存在于载体中。已知多种在HSC中诱导的启动子，例如T细胞中的IL-2启动子、B细胞中的免疫球蛋白启动子、其他细胞类型中的CMV启动子等。将表达载体递送给目标细胞/组织的方法包括裸DNA直接递送、脂质体介导的递送、弹道DNA递送以及致使DNA被细胞吸收的其他手段。这些方法是本领域公知的。如上所示，在一个实施方案中，本发明涉及一种增进HSC在试管内增殖的方法。该方法可包括例如在足以增进HSC增殖的量的PTN的存在下培养HSC。有利的是，HSC在PTN、 促血小板生成素、干细胞因子(SCF)和Flt-3配体(TSF)的存在下进行培养。(见例如Chute et al，Blood 105 =576-583(2005)的最佳浓度测定)为了实现HSC的试管内扩增，可在合适的液体营养培养基中对HSC进行培养。各种培养基都是市售的并且均可使用。可优选在无血清的培养基中进行培养。移种后，可在用于哺乳动物细胞生长的常规条件下维持该培养基。试管内扩增的HSC群可用于移植以为自体受体或异体受体(例如哺乳动物受体， 如人)恢复造血功能。举例来说，扩增的HSC可用于促进接受了化学疗法或放射疗法的患者的造血功能恢复。在该实施方案的一个具体方面，骨髓样本可取自患者，而干细胞取自扩增的样本；扩增的HSC群可作为化学疗法或放射疗法后的自体骨髓移植的移植物。扩增的 HSC的移植可使用本领域公知的方法实施。对于自体移植，HSC可在体外通过用PTN (最好与TSF组合使用)培养来进行扩增， 并且所扩增的移植物可用于例如具有次优PB选样的个体以促进在患者中的植入。对于异体干细胞移植，PTN可用于(最好与TSF组合使用)例如扩增脐带血细胞以促进在脐带血移植受体中供体HSC的更快速植入和成熟细胞的植入。对于50 60%的缺少HLA匹配供体的成年患者来说，脐带血是供体HSC的理想替代来源，这是因为不完全的HLA匹配CB单元可被安全地移植到患者体内而没有高比例的移植物抗宿主疾病；因此，原则上CB可成为通用的HSC供体来源用于需要干细胞移植的成年人。但是，成年人体内的CB移植并未成为注意的标准，这是因为令人无法接受的高移植失败率和延迟的成年患者造血功能恢复，其导致令人无法接受的高传染性死亡率。这些问题主要与每一 CB单元中相对较小剂量的HSC 有关。因此，能可靠地扩增CB HSC的方法(例如使用PTN，最好与TSF组合使用)可极大地改善CB移植的潜能，用于大量的在其疾病治疗中符合CB移植条件的患者。在另一个实施方案中，本发明涉及一种增进HSC(例如哺乳动物HSC)的体内增殖的方法。该方法可用于产生扩增的HSC群，从而使血细胞谱系成熟。该方法还可用于促进 /提升患者体内血液的更快速恢复。当例如哺乳动物因例如辐射、化学疗法或疾病而遭受造血功能或成熟血细胞降低时，该方法是有利的。本发明的方法包括对有需要的哺乳动物 (例如人)以能在哺乳动物体内实现HSC增殖的量和条件下用PTN给药。本领域的熟练技术人员可优化待在试管内、体外、体内使用的PTN的量。举例来说，在试管内可使用约lOOng/mL的量，培养液中的HSC例如在0日接受一次曝光。对于HSC 的体内扩增，TSF组分的示例性范围为促血小板生成素为20 50ng/ml，干细胞因子为 100 200ng/ml，而Flt-3配体为20 50ng/ml。在体内，举例来说，在完成化学疗法或放射疗法那天+1天开始，可用约Imcg的PTN每日皮下给药，共14天。待给药(例如对于人类患者)的PTN的实际量可取决于多种因素，包括患者的身体条件和所寻求的效果。尽管本发明的方法优选用于人类，其还可用于家畜、实验室动物或农场动物，例如狗、马、猫、牛、小鼠、大鼠、兔等。本发明的某些方面会在如下的非限制性实施例中进行更详细的描述。(还可参见 Chute et al，Blood 100 :4433-4439(2002), Chute et al，Blood 105 :576-583(2005), Epub2004 Sep 2.)实施例1实验详述抗体重组人PTN、山羊抗PTN以及山羊IgG购自R&D系统(Minneapolis，丽)。内皮细胞培养人内皮细胞系来自于如下血管子宫微血管、脐动脉、髂动脉、皮肤微血管、冠状动脉以及肺微血管获自Lonza(Portsmouth，NH)并按照推荐的指南进行培养。如先前所描述的那样(Chute et al, Stem Cells 22 :202-215(2004), Chute et al, Blood 105 :576-583(2005), Chute et al, Blood 100 :4433-4439 Q002))得到六种人脑内皮细胞(HUBEC)系，并维持在完整的内皮细胞培养基中，该培养基含有M199(GIBC0/BRL， Gaithersburg，ffl))、10%热灭活的胎牛血清(FBQ (Hyclone，Logan，UT)、100 μ g/mL 的 L-谷氨酰胺、50μ g/mL的肝素、30 μ g/mL的内皮细胞生长补给物(Sigma，St Louis, MO) U00U/ mL 的青霉素和 100 μ g/mL 的链霉素(1% pcn/strp, Invitrogen, Carlsbad CA)。以 25，000 个细胞/cm2的密度将内皮细胞铺在M孔板上，使其用2 3天的时间生长至汇合。生物芯片分析使用Qiagen RNeasy试剂盒Oliagen，Valencia CA)提取来自每种脑细胞系和非脑细胞系的一式三份RNA样本。使用Agilent Bioanalyzer对RNA样本的品质进行检验。这些样本用Duke Microarray Facility进行处理，包括对RNA样本进行了一轮扩增(Ambion AmpII，Ambion，Austin，TX)，用 Cy5 染料来标记样本，然后将样本与 Operon Human version 4的寡核苷酸阵列(Operon，Huntsville, AL)杂交。鼠科动物骨髓HSC的分离所有的动物程序都按照经杜克大学IACUC认可的动物使用协议来进行。将富含干细胞的造血细胞按如下方式从C57/BL6雌性小鼠和同类系B6. SJL-Ptprca P印3b/ BoyJ(B6. SJL)小鼠(Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME)股骨骨髓中分离出。将股骨切碎，并用补充有10% FBS和100U/mL青霉素的冷的PBSanvitrogen)以及100 μ g/mL链霉素将骨髓冲洗出来。冲洗出的骨髓用70μπι的细胞过滤器过滤掉碎片，在红细胞溶解缓冲液(Sigma Aldrich)中将红血细胞溶解。使用谱系去除柱(lineage depletion column) (Miltenyi Biotec Inc, Auburn CA)将谱系定型细胞(lineage committed cells)去除。进行多参数流式细胞计数以分离出纯化的HSC亚群。使用结合了抗CD34的异硫氰酸荧光素(FITC) (eBioscience, San Diego, CA)、结合了抗sca_l的藻红蛋白(PE)以及结合了抗 c-kit 抗体的别藻蓝蛋白(APC) (Becton Dickinson[BD]，San Jose，CA)对 Lin-细胞或者合适的同种型对照进行染色。无菌细胞的分选在BD FACSVantage SE流式细胞仪上使用FACSdiva软件(BD)进行。将用7-氨基放线菌素D (7-AAD ；BD)染色的死细胞排除在分析和分选之外。将纯化的OKM-c-kit+sca-l+lin-CMKSL)或KSL亚群收集到Iscove，s Modified Dulbecco' s Medium(IMDM)+10% FBS+1% pcn/strp 巾。共培养研究利用内皮细胞的共培养实验使用0. 4μ m的transwell插入物(Corning，LowellMA)在非接触式条件下进行。抽出内皮生长培养基，用PBS清洗内皮细胞单层两次，然后插入transwell。共培养研究在HSC细胞因子培养基(TSF)中进行。同类系竞争性粒子数再增单元分析将带有⑶45. 1等位基因、来自于B6. SJL小鼠的34—KSL细胞分类整理到含 IMDM+10% FBS+1 % pcn/strp的96孔U形底培养板(BD)中。将0日！MKSL细胞要么分离用于注射到受体动物体内，要么放置在含有TSF、TSF+重组PTN的培养液中，与HUBEC+山羊 IgG或与HUBEC+山羊抗PTN —起共培养。使用Csl37辐照器使表达⑶45. 2等位基因的受体C57BL6动物接受LD100/30剂量的950cGy全身照射(TBI)，然后通过尾部静脉注射移植了 10个、30个或100个34—KSL细胞或它们的经培养的后代。将救援剂量的IxlO5未经辐照的CD45. 2MNC共同注射到受体小鼠体内。如之前所描述的那样，在移植后第4、8、12和M周时，使用流式细胞仪来监测周围血液(PB)中的多谱系造血重建。通过颂下穿刺来收集PB; 细胞用RBC溶解缓冲液(Sigma-Aldrich)处理，并冲洗两次，然后用FITC-或PE-CD45. 1、 FITC-CD45·2、PE-抗Thy 1. 2、APC-抗 B220、APC-抗 Ter-119 或 PE-抗 Mac-I 以及 PE-抗 Grl染色。如果对于所有谱系，供体⑶45. 1细胞以> 存在，则认为这些动物已被植入 (Zhang et al，Nat. Med. 12 :240-245(2006))。抗辐射细胞频度和竞争性粒子数再增单元(CRU)的计算采用L-Calc软件(Mem Cell Technologies) ii^f (Zhang et al, Nat. Med. 12 :240-245(2006),Bonnefoix et al, J. Immunol. Methods 194 :113-119(1996))。直接ELISA将来自于HUBEC株系用于共培养研究的条件培养基的样本一式三份在96孔ELISA 培养板中与标准量的人重组PTN —起温育过夜。ELISA特异性试剂购自R&Dsystems。冲洗培养板，用PBS中的3. 5%牛血清白蛋白(BSA)封闭1小时，用生物素化的1 μ g/ml的抗PTN 温育1小时，冲洗，用HRP结合的链霉亲和素温育30分钟。培养板用显色底物溶液显色，然后是停止液，用酶标仪测定荧光性。Mrk多效生长因子由HUBEC分泌，并导致在HUBEC培养液中观察到的HSC的扩增人HSC和鼠科动物HSC在非接触式培养液中用HUBEC进行的共培养在短期(7天) 的培养中引发了长期粒子数再增HSC的I-Iog扩增。在基因表达分析中并通过RTPCR，发现与在非脑EC株系中相比，PTN在HUBEC中显著过表达了 10 33倍(图1)。进行实验是为了测试对于出现HUBEC共培养对HSC扩增的影响，PTN是否是必需的。针对这些研究，使用封闭抗PTN抗体(R&D SyStemS，Mirmeap0liS，MN)，将其添加到培养液中，在该培养液中， 1 IOxlO3的CDIM-c-kit+sca-l+lin-CMKSL)细胞在非接触式条件在与HUBEC —起培养 (使用了 C57B16骨髓(BM) 34—KSL细胞)。先前已证实34—KSL细胞含有高含量的HSC，达到了每10 100个细胞有1个的水平，并且这些细胞可通过抗体染色和流式细胞仪分类来分离 (Chute et al，Stem Cells 22 :202-215(2004),Chute et al,Blood 105:576-583(2005)， Chute et al, Blood 100 :4433-4439 (2002)) HUBEC 共培养液同样补充有 Iscove ' s Modified Dulbecco' s Medium(IMDM)，如前所述，其补充有50ng/mL的促血小板生成素、 120ng/mL 的 SCF 和 20ng/mL 的 Flt-3 配体(Chute et al，Stem Cells 22 :202-215(2004), Chute et al, Blood 105 :576-583(2005), Chute et al, Blood 100 :4433-4439(2002)) 观察到与单独的细胞因子相比，仅补充有同种型IgG抗体的HUBEC共培养液供养了 KSL干细胞/祖细胞的明显扩增。与单独的细胞因子相比，HUBEC加抗PTN的组还显示出KSL细胞的明显增长。集落形成细胞(CFC)含量——其为定型祖细胞而非HSC的量度——的分析表明，与单独补充有同种型的HUBEC相比，HUBEC加抗PTN的培养液含有明显更少的CFC。接下来进行一项测定，以判断将抗PTN添加到HUBEC培养液(vs. HUBEC加同种型抗体)中是否能改变HSC含量在这些培养过的后代中的评测，并与投入的34_KSL细胞和单独细胞因子的后代相比。与投入的;34_KSL细胞和用细胞因子处理的后代相比，HUBEC共培养液供养了长期粒子数再增HSC的8倍增长(图2)。引人注意的是，HUBEC加抗PTN的后代显示出HSC含量几乎全部丧失，暗示了 PTN信号的封阻阻碍了 HSC在培养液中的扩增，否则其由HUBEC介导。多谱系分析还表明，移植了用HUBEC培养的后代的小鼠与0日34_KSL 移植物或单独的TSF后代相比，显示出增加的骨髓细胞、B细胞和红系祖细胞的贡献。有趣的是，移植了 HUBEC加抗PTN的后代的小鼠与其他组相比，显示出来自于供体的骨髓细胞、B 细胞和红系祖细胞的生产几乎全部丧失(图3)。重要的是，在4周、8周和12周的观察点发现，通过用抗PTN进行处理，在用HUBEC培养的后代中HSC活性消失，表明短期HSC和长期HSC均受PTN信号封阻的影响。综上，这些数据表明，PTN由HUBEC产生，其是HSC的决定性生长因子，并且触发HSC在试管内的自我更新。PTN的添加使HSC在液体悬浮培养液中扩增上面的“功能丧失”研究强烈暗示了 PTN为HSC的分泌生长因子。为了证实PTN单独促进HSC在培养液中的增殖，在供养性微环境的环境外，将鼠科动物34—KSL细胞置于含 50ng/mL的促血小板生成素、120ng/mL的SCF和20ng/mL的flt_3配体(TSF)的液体悬浮培养液中，提高和不提高重组PTN(rPTN) (R&D Systems, Minneapolis,丽)的浓度(10、100 和lOOOng/mL)，并对比总细胞扩增、表型变化和HSC功能分析。与单独细胞因子的后代相比，添加提高剂量的PTN造成培养液中总细胞(P < 0. 001)和KSL细胞(P < 0. 001)明显增加，并且观察到对应于剂量的影响(图4A)。这些数据暗示出，PTN确实是HSC的生长因子，但为了证实此点，按如下所述进行了竞争性粒子数再增分析。对于竞争性粒子数再增分析，使用950cGy TBI对受体⑶45. 2+小鼠进行致命性辐射，随后通过尾部静脉移植有限剂量(10、30或100个细胞)的供体⑶45. 1+34_KSL细胞或它们的单独用TSF或用TSF加PTN(100ng/mL)培养的后代。宿主BM细胞(IxlO7)与竞争细胞一样进行了共同移植。移植后4周，移植了 0日34_KSL细胞的小鼠显示出，剂量为10 或30个细胞时，没有来自于CD45. I+供体的多谱系植入，而剂量为100个细胞时，仅有低水平的植入(图4B)。同样，单独用TSF培养的34—KSL细胞的后代也显示出，在第4周，有很少或没有来自于多谱系CD45. 1+供体细胞的植入。相反，用TSF加PTN培养的相同剂量的34_KSL细胞的后代显示出，在第4周，在多达50%的移植小鼠中有来自于供体的多谱系植入，表明对应于PTN处理，在培养液中出现了短期HSC的扩增。泊松统计分析表明，0日 34KSL细胞的频度在32个HSC中有1个(95%置信区间(Cl) 18 57)，而用TSF培养的 34KSL细胞的后代所具有的HSC频度为在69个细胞中有1个(Cl 36 130)。与此不同， 用TSF加PTN培养的34_KSL细胞的后代中，HSC频度为在4个细胞中有1个(Cl 2 10) (图4C)。这些结果确认了 PTN为HSC的生长因子和自我更新因子，而移植小鼠的长期分析将证实，长期粒子数再增的HSC是否对应于PTN处理而明显扩增。
最后，为了确认PTN处理是否导致在体内移植后HSC的偏移或谱系限制，检查了移植小鼠中类红细胞、骨髓细胞和淋巴样细胞的体内谱系粒子数再增。如图4D所示，移植了用TSF加PTN处理的34_KSL细胞的后代的小鼠显示出骨髓细胞、类红细胞、B淋巴样细胞和 T淋巴样细胞后代的多谱系植入，其与移植后未处理的34_KSL细胞的后代在分布方面相当。 这些结果确认了用PTN对HSC进行处理不会改变HSC的常规多谱系分化潜能。实施例2实验详述EC培养液和生物芯片分析根据制造商指南培养来自于子宫动脉、脐动脉、髂动脉、皮动脉、冠状动脉和肺动脉的初代人EC株系(Lonza，Gaithersburg，MD)。如前述那样产生初代HUBEC并在完整 EC 培养基中培养(Chute et al, Blood 100 :4433-9(2002), Chute et al, Blood 105 576-83 (2005))。扩增来自于η = 6的HUBEC和η = 8的非脑EC的RNA，并与人寡核苷酸点样生物芯片杂交(Operon，Huntsville, AL)。生物芯片数据的分析采用非监督式系统聚类分析，并筛选基因目录以得到注释的可溶性蛋白。如前述那样进行样本处理和与Operon Human Arrays (Operon) ^ (Dressman et al, PLoS Medicine 4 :690_701 (2007))。BM HSC的分离和试管内培养通过前述流式细胞仪的细胞分选(Reya，et al, Nature 423:409-14(2003)， Salter et al,Blood 113 :2104-7 U009))将纯化的 BM 34KSL 细胞从 C57B16 和 Β6· SJL 小鼠中分离(Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)。对BM !MKSL细胞的液体悬浮培养液补充以具有和不具有重组(人)PTN(R&D Systems,Minneapolis,MN)的 IMDM+10% FBS+1 % pcn/strp+20ng/ml 的促血小板生成素、120ng/ml 的 SCF 和 50ng/ml 的 flt_3 配体(“TSF” 培养基)。非接触式HUBEC培养液用0. 4 μ m的transwell插入物(Corning, Lowell ΜΑ)进行处理，并补充以具有和不具有山羊抗PTN或同种型对照抗体(R&D)的TSF培养基。KSL细胞的表型分析如前述那样进行(Chute et al, Blood 109:2365-72(2007)，Salter et al, Blood 113 :2104-7(2009))。CRU 分析将BM 34_KSL细胞要么分离用于注射到受体动物体内，要么置于含有单独的TSF、 TSF+PTN、TSF+HUBEC+山羊IgG或TSF+HUBEC+山羊抗PTN的培养液中。受体C57BL6动物 (⑶45. 2+)接受了 950cGy的全身照射(TBI)，然后通过尾部静脉注射有限剂量的BM 34—KSL 细胞或它们的经培养的后代。将IxlO5的宿主BM MNC共同注射到受体小鼠体内作为竞争细胞。如前述那样在移植后用流式细胞仪在PB中测定多谱系造血重建(Reya，et al,Nature 423 :409-14(2003), Salter et al, Blood 113 :2104-7 (2009)) 如果供体 CD45. 1+细胞在 PB中以> 存在，则认为这些动物已被植入(Chute et al, Blood 100:4433-9(2002)， Chute et al,Blood 105:576-83(2005)， (Chute et al，Proc Natl Acad Sci U S A 103， 11707-12(2006))。CRU 评测如前述那样使用 L-Calc 软件(Stem Cell Technologies)进行 (Reya,et al,Nature 423 :409-14(2003), Chute et al,Blood 109 :2365-72 (2007)，Chute et al, Proc Natl Acad Sci U S A 103,11707-12(2006))。第二代竞争性移植分析采用收获自移植M周后的初代CD45. 2+小鼠的全部BM进行，所述小鼠要么移植了⑶45. I+BM 34—KSL细胞，要么移植了单独用TSF培养或用TSF+PTN培养的;M_KSL细胞的后代。用950cGy TBI对第二代受体⑶45. 2+C57B16小鼠进行照射，供体细胞植入的PB分析在第二代小鼠移植后12周进行。定量RT-PCR 和直接 Direct ELISA如前述那样使用两步RTPCR反应进行PTN在EC中，以及HES-1、GFI-I和PTEN在 BM KSL细胞和FACS分选的培养后的KSL细胞中的RT-PCR分析(Chute et al, Proc Natl Acad Sci U S A 103，11707-12 (2006))。条件培养基(CM)如前述那样生成自HUBEC和非脑 EC (Chute et al,Blood 100 :4433-9(2002), Chute et al,Blood 105 :576-83(2005)), 然后根据制造商指南进行PTN的ELISA。PI 3-激酶β-连环蛋白分析对于造血细胞中的RPTP β / ζ分析，生成了 BM丽C的细胞离心涂片( 10，000 个细胞/载玻片)。添加大鼠抗RPTPii/ζ (BD)或大鼠IgG，并使用FITC抗大鼠第二代抗体。对于BM KSL细胞进行流式细胞仪分析以确定RPTPii/ζ的表达。在HSC培养液中添加ΙμΜ的渥曼青霉素(Cell Signaling Technology, Danvers, ΜΑ)以抑制ΡΙ3激酶的活性。对于pAkt的分析，根据制造商指南(BD)用初代抗体整夜温育BM KSL细胞，以S473的水平使Akt磷酸化。转基因β-连环蛋白-/-(loxP，loXP;Vav-Cre)小鼠获赠于杜克大学的T.Reya。使用BM KSL细胞或其后代的细胞离心涂片进行活化的β-连环蛋白的免疫荧光分析，并使用抗非磷酸化β-连环蛋白的抗体(Clone 8E7,Upstate Biotechnology,Lake Placid,NY)或同种型对照以及山羊抗鼠 alexa-fluor 488 (BD)染色(Congdon et al，Stem Cells 26 :1202-10(2008))ο体内PTN研究让成年B6. SJL小鼠每天接受单次的700cGy TBI，然后用PBS (盐水)或2 μ g的PTN 进行腹腔内处理，共进行7天(辐射后的前4小时)。在日期+7那一天，处死小鼠并定量总的能存活的BM细胞。进行流式细胞仪分析以评测每一股骨中BM KSL细胞的百分比(Chute et al, Blood 109 :2365-72 (2007)，Salter et al, Blood 113 :2104-7 (2009)) 如前述那样使用 MethoCult ]\04；34 培养基(Stem Cell Technologies, Vancouver, BC)进行集落形成细胞(CFC)分析(Chute et al, Blood 109 :2365-72 (2007)，Salter et al, Blood 113 2104-7(2009)).长期培养起始细胞(LTC-IC)的分析如下进行将鼠科动物M2-10B4 (ATCC CRL-1972)BM基质细胞置于M孔培养皿上并辐射以1500cGy。将来自于用PTN或PBS处理的受辐射小鼠的极限稀释度(45，000、90，000和180，000)的BM MNC添加到基质细胞层中并在MyeloCult M5300培养基(Stem Cell Technologies)中维持4周，每周更换一半的培养基。在4周时，收集未贴壁细胞和贴壁细胞(15，000个细胞/皿)，并置于3x35mm的各皿中(MethoCult，StemCell Technologies) 两周后，对造血集落计数并打分。Mrk用PTN进行处理引发了表型HSC的扩增早已证实，人内皮细胞(EC)的成年来源在短期培养中供养人HSC的扩增(Chute et al, Blood 105 :576-83 (2005)，Chute et al, Blood 109:2365-72(2007))。其证实，与
用基质细胞进行的共培养研究(Gottschling et al，Stem Cells 25 :798-806(2007))-
该研究表明，对于试管内的HSC维持，需要细胞与细胞的接触——不同，初代人脑内皮细胞(HUBEC)产生能在体外引发人HSC I-Iog扩增的可溶活性(Chute et al, Blood 100 4433-9 (2002), Chute et al，Blood 105:576-83(2005))。为了识别负责该 HSC 扩增活性的由HUBEC分泌的蛋白，进行了 HUBEC的全基因组表达分析并与缺少HSC供养活性的非脑人EC对比(图9A)。识别出了十三条基因，它们在HUBEC中过表达>5倍，并产生可溶基因产物(表1)。发现与非脑EC相比，PTN——一种与肝素结合的生长因子，在造血作用中
没有已知作用(Meng et al, Proc Natl Acad Sci U S A 97 :2603-8(2000))-在 HUBEC
中的表达有25倍那样高(图9B)。定量RT-PCR确认，与非脑EC相比，PTN在HUBEC中的表达有> 100倍的增长，HUBEC条件培养基(Ix)的ELISA表明，PTN浓度增长到6. 9士0. 3pg/ ml，而非脑EC条件培养基中为0. 02士0. 01pg/mL(P = 0. 04，图9B)。由于PTN没有调节造血作用的已知功能(Meng et al, Proc Natl Acad Sci U S A 97 J603-8 QOOO))，首先进行了检查以确认BM干细胞/祖细胞是否表达PTN受体、受体蛋白酪氨酸磷酸酶β/ζ (RPTP β/ζ)、多配体蛋白聚糖或间变型淋巴瘤激酶(ALK)中的一种或多种(Stoica et al, J Biol Chem 276 :16772-9(2001), Landgraf et al, J Biol Chem 283 :25036-45 (2008)) 大部分的 BM MNC 和 c-kit+sca-l+lirT (KSL)干细胞 / 祖细胞表达RPTPii / ζ (η = 3，平均值分别为87. 0% 士 8. 8和89% ；图6A)，但没有一个种群表达多配体蛋白聚糖或ALK (数据未示出)。为了确认PTN是否会是HSC的生长因子，通过FACS
分离出 C57B16 BM CD34KSL细胞-其大量含有以用于HSC(Kiel et al，Nat Rev Immunol
8 :290-301 (2008), Salter et al,Blood 113 :2104-7 Q009))，并将其置于液体悬浮培养液中，该培养液具有20ng/mL的促血小板生成素、120ng/mL的SCF和50ng/mL的Flt_3配体 (“TSF”)，有或没有10、100或1000ng/mL的PTN0对应于所添加的10 100ng/mL的PTN, 在总细胞、％ KSL细胞和总KSL细胞方面发现了与剂量相关的增长。(图6B)。与单独的 TSF相比，在TSF中添加100ng/mL的PTN导致总细胞增长至6. 4倍，而总KSL干细胞/祖细胞增长至17. 7倍(分别为P = O. 005和P = 0. 006，图6B)。用PTN进行处理足以引发LT-HSC的扩增为了确认用PTN进行处理是否能引发培养液中的功能性HSC扩增，进行了竞争性粒子数再增单元(CRU)分析，其中使用极限稀释度的供体CD45. I+BM 34—KSL细胞移植到接受了致命性辐射的⑶45. 2+C57B16小鼠体内。在4周、12周和M周时从初代受体小鼠中收集周围血液(PB)，以评估受体小鼠PB中供体CD45. I+细胞的植入水平。在移植后12周时，移植了用TSF+lOOng/mL的PTN培养的34—KSL细胞后代的小鼠与移植了相同剂量的0日 34_KSL细胞的小鼠和移植了用TSF单独培养的34_KSL细胞后代的小鼠相比，显示出PB中 ⑶45. I+供体细胞水平> 10倍的增长(图6C，分别为P = O. 0008和P = 0. 001)。这些数据暗示出，PTN导致HSC在培养液中的扩增。来自于多谱系供体CD45. 1+的骨髓细胞、B淋巴样细胞和T细胞后代的PB植入水平在12周时在移植了用PTN处理的34_KSL细胞后代的小鼠中——与在移植了相同剂量的0日34—KSL细胞或它们的单独用TSF培养的后代的小鼠中观测到的水平相比——也有明显增长(图6C和图6D)。大量移植小鼠(n = 75)的泊松统计分析表明，BM 34—KSL细胞中的12周CRU频度为在39个细胞中有1个(95%置信区间 [Cl] :1/21 1/70，图6Ε，表2)。如所预期，单独用细胞因子(TSF)培养后的34—KSL细胞后代中的CRU频度降低为在58个细胞中有1个(95% CI 1/31 1/108)。相反，用TSF+PTN 培养的;M_KSL细胞后代中的CRU频度为在10个细胞中有1个(95% CI :1/5 1/20)。因此，与投入量相比，PTN的添加引发了 HSC的4倍增长，而与单独用TSF培养的后代相比有6倍的增长。与移植了 0日34_KSL细胞或它们的单独用TSF培养的后代的小鼠相比，移植了 TSF+PTN的后代的小鼠也显示出在整个对周内所有时间点上更高的供体⑶45. 1+细胞重建水平(图6F)。这与在所有时间点上在用PTN处理的后代中的增长的CRU频度(与投入的34—KSL细胞相比)相对应。在4周时，与投入的34—KSL细胞相比，在用TSF+PTN培养的 34KSL细胞的后代中的短期CRU的频度为6. 4倍高(在5个细胞中有1个，95% CI :1/2 1/10相比于在32个细胞中有1个，95% CI :1/18 1/57)。在移植后M周时，与投入的 34KSL细胞相比，在用PTN处理的后代中的CRU频度增长为4倍(在13个中有1个，95 % CI 1/6 1/30 相比于在 52 个中有 1 个，95% CI :1/25 1/106)。为了确认PTN导致具有连续粒子数再增能力的长期粒子数再增HSC的扩增，进行了第二代移植。重要的是，移植了在M周时收获自用PTN处理的34_KSL细胞初代受体的 BM的第二代⑶45. 2+小鼠与移植了收获自34—KSL细胞组或单独TSF培养组中的初代小鼠的BM的第二代小鼠相比，显示出移植后12周时> 10倍高的⑶45. 1+细胞植入水平(分别为P = 0. 003和P = 0. 02 ；图6G)；移植了来自于初代小鼠(其移植了用PTN处理的34—KSL 细胞)的BM的第二代小鼠在12周时还显示出常规的多谱系分化(图6G和图6H)。综上， 这些数据说明，用PTN处理足以在培养液中引发LT-HSC的明显扩增，并且LT-HSC的这种扩增不会改变它们的多谱系分化的潜能。PTN信号的抑制阻断了由EC介导的HSC扩增为了进一步测试PTN在BM HSC扩增中的功能，进行了检查以确认PTN信号的定向抑制是否能阻断试管中由EC介导的HSC扩增。将C57B16 BM 34—KSL细胞置于具有 HUBEC+TSF的非接触式培养液中共7天，并用阻断式抗PTN抗体(50 μ g/mL)或同种型IgG 进行处理。使用0日34—KSL细胞或它们的用HUBEC+TSF或HUBEC+TSF+抗PTN培养的后代进行竞争性粒子数再增分析，以比较每一组中的HSC频度。移植了用HUBEC+TSF培养的30 个34KSL(CD45. 1+)BM细胞后代的C57B16 (CD45. 2+)小鼠与移植了相同剂量的0日CD34KSL 细胞的小鼠相比，显示出在移植后12周时PB中供体CD45. 1+细胞粒子数再增为大约3倍高的水平(平均值45. 2% vs. 17. 2%, P = O. 03，图10A)。相反，移植了用HUBEC+TSF+抗 PTN培养的相同剂量34_KSL细胞后代的小鼠与移植了 HUBEC+TSF培养液的后代的小鼠相比，在12周时(平均值1. 1% vs. 45. 2%,P = 0. 004)和整个M周内都显示出供体CD45. I+ 细胞和多谱系粒子数再增的显著下降(图IOA 图10C)。对η = 81的移植小鼠的泊松统计分析表明，HUBEC+TSF后代中的12周CRU频度为在6个细胞中有1个(95%，CI :1/3 1/13)，而0日34—KSLBM细胞为在19个细胞中有1个(95%,CI :1/10 1/3 。与之相比， HUBEC+TSF+抗PTN中的CRU频度为在41个细胞中有1个(Cl :1/23 1/87)，显示出对应于PTN信号的抑制的HSC含量下降为1/7。由PTN介导的表型HSC的扩增取决于PI3-激酶/Akt信号为了确定PTN介导HSC扩增的潜在机制，进行了检查以确认PTN是否会改变已知受 ΚΡΤΡβ/ζ 影响的途径(Meng et al, Proc Natl Acad Sci U S A 97 :2603-8(2000), Stoica et al, J Biol Chem 276:16772-9(2001)，Landgraf et al, J Biol Chem 283 25036-45(2008), Deuel et al, Arch Biochem Biophys 397:162-71 (2002))。标准的 PTN信号通过RPTP β / ζ的连接和灭活而产生(Meng et al, Proc Natl Acad Sci U S A 97 J603-8 QOOO))，后者能促进几种细胞内基质的酪氨酸磷酸化，包括Akt和β -连环蛋白(Souttou et al, J Biol Chem 272:19588-93(1997)，Gu et al, FEBS Lett 581 382-8(2007))。由于已证实PTN通过PI 3-激酶/Akt途径的活化在造血系统之外介导有丝分裂效应(Souttou et al, J Biol Chem272 19588-93 (1997))，所以进行一项测试来确认由PTN引发的HSC扩增是否通过该途径的活化而产生。使用具有和不具有lOOng/mL PTN 的TSF，在存在和不存在10 μ M渥曼青霉素——一种PI 3-激酶抑制剂——的情况下处理BM 34KSL 细胞(Souttou et al, J Biol Chem 272:19588-93(1997))。与只具有 TSF+PTN 的培养液相比，在TSF+PTN中添加渥曼青霉素导致总细胞扩增降至1/3. 4，而BM KSL细胞扩增降至1/8. 1 (分别为P = 0. 02和P = 0. 02 ；图7A)。与单独用TSF处理相比，用TSF加PTN 处理BM HSC显示出磷酸化Akt——一种PI 3-激酶的目标——的水平增长至3. 8倍(P = 0. 03)；渥曼青霉素的添加消除了 PTN处理对HSC中磷酸化Akt水平的这种影响(P = 0. 04， 图7A)。这些数据证实，PI 3-激酶/Akt信号途径参与介导由PTN引发的HSC的增殖，并且暗示出PI 3-k/Akt途径的活化促成了所观察到的HSC扩增。有趣的是，PTN处理引发HSC 自我更新的其他两种调控子——HES-I和GFI-I——的上调(Kunisato et al，. Blood 101
1777-83(2003)，Hock et a,Nature 431 :1002-7(2004))(图 7B)。由于已证实HES-1-其
介导Notch信号——引发致白血病作用中的PI 3-激酶/Akt信号(Palomero et al,Cell Cycle 7 :965_7(K2008))，所以通过HES-1的引发和PI 3-激酶/Akt信号的下游活化，这会提高PTN引发HSC扩增的可能性。根据该模型，现已发现PTEN——一种PTN和PI 3-激酶
/Akt 途径的负调控子(Carracedo et al, Oncogene 27 :5527-41 (2008))-的表达在 PTN
曝光后在HSC中下调。值得注意的是，用PTN处理的34_KSL细胞显示出β-连环蛋白的活化形式没有增加(数据未示出)，后者是RPTPii/ζ的下游目标和HSC自我更新的正调控子。此外，当来自于β -连环蛋白+ (LoxP，LoxP ；Vav-cre)小鼠的BM KSL细胞用TSF+PTN 处理时，在来自于β-连环蛋白+小鼠的BM KSL细胞和来自于野生型动物的细胞之间没有发现BM KSL细胞在培养液中扩增方面的区别(图11)。综上，这些数据暗示，PI 3-激酶/Akt途径的活化在介导由PTN引发的HSC扩增中起到了重要作用，并且这些效果可通过 HES-I的引发而介导。PTN全身给药引发了 HSC的体内再生由于PTN的添加足以引发HSC的试管内扩增，所以进行一项测试来确认PTN的给药是否能提高受伤后BM HSC的体内再生。对于这些实验，对小鼠每日进行700cGyTBI的辐射——已证实该辐射会导致BM HSC含量> 20倍的减少(Salter et al, Blood 113 2104-7 (2009))，然后使其腹腔内接受2 μ g的PTN或盐水，共进行7天。有趣的是，与对照相比，PTN给药导致在日期+7那一天总BM细胞增加至2. 3倍(P = 0. 02)，而初代BM KSL 细胞增加至5. 6倍(P = 0. 02)(图8A)。PTN处理同样导致功能性BM干细胞/祖细胞库的明显增加，体现在BM集落形成细胞(CFC)增加至2. 9倍，并且更为重要的是，长期培养起始细胞(LTC-IC)增长至11倍，后者大量含有用于HSC (分别为P = O. 003和P = 0. 003 ；图 8B和图8C)。这些结果表明，使用PTN进行的全身处理引发了受伤后体内BM HSC的再生和血细胞生成。总之，PTN是一种18-kD的肝素结合生长因子，其能引起神经元的有丝分裂(Meng et al, Proc Natl Acad Sci U S A 97 :2603-8(2000), Stoica et al, J Biol Chem 276 16772-9 (2001), Landgraf et al, J Biol Chem 283 :25036-45 Q008))，具有血管生成活性(angiogenic activity)(Perez-Pinera et al,Curr Opin Hematol 15 :210-4(2008),Yeh et al, J Neurosci 18 :3699-707 (1998))，能起原癌基因的作用(Chang et al, Proc Natl Acad Sci U S A 104 10888-93 Q007))，但之前并未被描述为具有造血作用。前述结论表明，PTN是一种HSC的分泌生长因子，并且PTN的添加足以引发LT-HSC的有效扩增，正如初代和第二代竞争性粒子数再增分析所表明的那样。此外，已证实PTN的全身给药导致全身照射后BM HSC在体内的11倍扩增。因此，PTN不仅仅是HSC自我更新的可溶性调控子，其还是HSC再生——一种非常不典型的过程——的可溶性调控子。由于BMHSC表达RPTP β / ζ而且试管内研究表明了 PTN对HSC的直接影响，所以建议PTN直接作用于BM HSC以引发BM HSC的体内再生。但是，检查PTN给药对于BM微环境的影响是重要的。已证实PTN 具有血管生成活性(Perez-Pinera et al, Curr Opin Hematol 15 :210-4(2008), Yeh et al, J Neurosci 18 :3699-707 (1998))，并且已表明BM血管内皮细胞可调节受伤后的造血功能重建(Salter et al, Blood 113 :2104-7(2009), Hooper et al, Cell Stem Cell 4 ^3-74 0009))。因此，有理由认为PTN通过BM血管恢复的提高而可能间接地有助于BM HSC 的再生。由于对能调节BM HSC体内再生的外部信号或微环境信号知之甚少(Congdon et al, Stem Cells 26 :1202-1(^2008))，所有PTN引发BM HSC体内再生的论证对于理解该过程有着根本的重要性。进而，由于PTN是一种能引发BM HSC体内再生的可溶性生长因子， 所以其与先前所描述的引发HSC自我更新的方法相比是独特的(Reya，et al,Nature 423 409-14(2003),Hackney et al，Proc Natl Acad Sci U S A 99 :13061-6 (2002),Antonchuk et al, Cell 109 :39-45(2002)) 还证实了 PTN引发BM HSC中的PI3-激酶/Akt信号，而对PI3-激酶/Akt信号的抑制阻碍了培养液中BM KSL细胞由PTN引发的增殖和扩增。PTN还引发HES-I的表达，后者是Notch信号的下游介质并且是PI3-激酶/Akt信号的正调控子(Kunisato et al,. Blood 101 :1777-83(2003), Palomero et al, Cell Cycle 7 :965_7(K2008))，这暗示了 PTN 通过 Notch信号的活化而引发HSC扩增的可能性。相反，^iang等人最近报道了 PTEN——一种 PI3-激酶/Akt信号的负调控子——的缺失与12周时小鼠体内CRU的耗尽有关Ghang et al,Nature 441 :518-22(2006))；此外，Fox03a——一种负向调控HSC循环的转录因子并且由Akt来抑制——的缺失与小鼠体内LT-HSC的耗尽有关(Miyamoto et al，Cell Stem Cell 1 :101-12(2007))。因此，重要的是需要确认由PTN介导的HSC扩增是否依赖于PI3-激酶 /Akt信号，或者由PTN介导的HSC扩增是否与可选的自我更新途径(例如经由HES-I引发的Notch信号)有关。对于干细胞生物学的研究已经获得了关于调控HSC自我更新和分化的内部途径和外部途径的很多信息(Zon, Nature 453 :306-13 (2008)，Orkin et al, SnapShot hematopoiesis. Cell 132 :712(2008), Kiel et al, Nat Rev Immunol 8 :290-301(2008), Blank et al, Blood 111 :492-503 (2008) , Adams et al, Nat Biotechnol 25: 238-243Q007))。但是，对于能引发HSC体外扩增或HSC体内再生的可溶性生长因子或细胞因子的成功研发仍然是难以实现的目标(Blank et al, Blood 111 =492-503 (2008), Adams et al, Nat Biotechnol 25 :238-243 (2007)) 本文证明了 PTN 是 HSC 的可溶性生长因子， 其引发受伤后的LT-HSC体外扩增以及HSC体内再生。因此，PTN对于人HSC的体外扩增以及对于在接受了骨髓病性化学疗法和放射疗法的患者体内引发造血功能再生有着独特的潜能。实施例3将骨髓谱系负(lin-)祖细胞置于培养液中7天，该培养液具有20ng/mL的促血小板生成素(TPO)、120ng/mL的干细胞因子(SCF)或50ng/mL的Flt_3配体，或所有这三种细胞因子的组合(TSF)，并且具有和不具有lOOng/mL的多效生长因子(PTN)。单独的促血小板生成素以及单独的Fit-3配体均不能在培养液中供养能存活的BM祖细胞(图12A)。 SCF+/-PTN在培养液中供养了 BM祖细胞的适度扩增，但TSF组合在扩增BM祖细胞方面优于所有接受测试的单独细胞因子(P = 0.04，0.02，0.02)，并且当TSF与PTN组合时，这种37 倍的扩增提高到了 49倍(图12B)。综上，这些数据表明，TSF+PTN是在培养液中扩增造血祖细胞的最佳组合。上面列举的所有文献和其他信息来源均整体以参照方式并入于此。表1由HUBEC过表达的基因
权利要求
1.一种增强造血干细胞(HSC)在试管内扩增的方法，包括在足以增强所述扩增的量的多效生长因子(PTN)的存在下培养HSC。
2.如权利要求1的方法，其中所述方法包括在PTN以及从促血小板生成素、干细胞因子 (SCF)和Flt-3配体中选出的至少一种的存在下培养所述HSC。
3.如权利要求2的方法，其中所述方法包括在PTN、促血小板生成素、SCF和Flt-3配体的存在下培养所述HSC。
4.如权利要求1的方法，其中所述HSC为哺乳动物HSC。
5.如权利要求4的方法，其中所述哺乳动物HSC为人HSC。
6.如权利要求1的方法，其中所述HSC来自于脐带血。
7.如权利要求1的方法，其中所述PTN为人PTN。
8.如权利要求1的方法，其中所述PTN为重组哺乳动物PTN。
9.一种恢复造血功能的方法，包括用在PTN的存在下在试管中扩增的HSC对有此需求的哺乳动物对象给药，其中所述HSC以足以恢复所述功能的量来给药。
10.如权利要求9的方法，其中所述对象为人对象。
11.如权利要求9的方法，其中所述HSC为自体HSC。
12.如权利要求9的方法，其中用所述扩增的HSC对所述对象给药以促进化学疗法或放射疗法后血液功能的恢复。
13.如权利要求12的方法，其中所述方法包括i)在所述化学疗法或放射疗法之前从所述对象获得骨髓样本， )在PTN的存在下从所述骨髓样本扩增出HSC，并且iii)在所述化学疗法或放射疗法之后用所述扩增的HSC对所述对象给药，从而促进所述血液功能的恢复。
14.如权利要求9的方法，其中所述HSC是在PTN以及从促血小板生成素、SCF和Flt-3 配体中选出的至少一种的存在下扩增的。
15.如权利要求14的方法，其中所述HSC是在PTN、促血小板生成素、SCF和Flt_3配体的存在下扩增的。
16.一种恢复造血功能的方法，包括用足以恢复所述功能的量的PTN对有此需求的哺乳动物对象给药。
17.如权利要求16的方法，其中所述对象为人，而所述PTN为人PTN。
18.如权利要求16的方法，其中使用包含编码PTN的序列的表达构建体来给药，所述给药在所述序列能被表达并且所述造血功能能被恢复的条件下进行。
19.如权利要求18的方法，其中所述序列可操作地与启动子连接。
20.如权利要求18的方法，其中所述序列存在于病毒载体中。
21.一种刺激接受了化学疗法或放射疗法的哺乳动物的造血功能恢复的方法，包括用足以实现所述刺激的量的PTN对所述哺乳动物给药。
22.如权利要求21的方法，其中所述PTN通过皮下给药或通过腹腔内给药。
23.一种促进接受了化学疗法或放射疗法的哺乳动物的血液功能恢复的方法，包括使用PTN和粒细胞集落刺激因子以足以实现所述促进的量对所述哺乳动物给药。
全文摘要
本发明总体而言涉及干细胞，并且具体而言涉及一种造血干细胞(HSC)生长因子以及使用它的方法。
文档编号C12N5/071GK102224240SQ200980146958
公开日2011年10月19日 申请日期2009年9月28日 优先权日2008年9月26日
发明者希瑟·辛伯格, 约翰·P·舒特 申请人:杜克大学