专利名称：：一种醋糟发酵复合微生物菌剂及其制备方法
技术领域：
：本发明属于有机废弃物农用资源化的微生物技术处理领域，涉及一种能促进醋糟发酵的复合微生物菌剂及其制备方法。
背景技术：
：醋糟是食醋工厂淋醋后的下脚料，由于酸性强、含水量高且含有大量的粗纤维(稻壳)，长期以来没有很好地开发利用，这些下脚料长年废弃堆积，不仅严重污染环境，同时也制约了企业自身的发展。因此，如何对其进行处理并加以利用是目前制醋行业面临的一大难题，也是当地环保部门的工作重点之一。目前，除少量新鲜醋渣直接出售外，大部分醋渣经干燥、粉碎制成醋渣粉干饲料。此法能耗大，产品中粗纤维含量高达36%，粗蛋白质含量仅9%，其饲用价值低，利用效果较差。因此，目前研究的主要内容之一是如何利用微生物发酵，提高醋渣的饲用价值。除此之外，越来越多的研究表明醋糟经发酵后可被利用为食用菌和设施作物的育苗和栽培基质，且效果较好。随着设施园艺的迅速发展和固体栽培基质(尤其是有机基质)需求量的大大增加，该用途已被认为是解决醋糟资源化利用最具发展潜力的重要方式。以上不管对于醋糟作为饲料用途还是栽培基质用途，均需要解决醋糟原料由于含水量高、酸性强而导致的发酵周期长的问题。目前已有针对醋糟原料适宜发酵微生物的筛选及其初步效果诸多报道，但目前大部分仍停留在实验室阶段，且还必须对醋糟的PH和C/N比进行预调节后才能使用。这不但加重了生产负担还提高了投入，很大程度上限制了工业上发酵产品的生产效率。因此，针对这一问题，如何筛选出适合醋糟原料发酵的微生物成为醋糟进一步资源化利用的关键。本发明即从这一基本点出发，进行了醋糟原料适宜发酵微生物的筛选，并通过发酵对比试验，筛选出发酵效率高、同时又能增加其营养价值(包括提高全量养分N、P、K含量和有效成分含量等)的最优组合菌群。
发明内容本发明的目的在于解决现有新鲜醋糟原料发酵难、周期长的技术难点，并提供一种能加快发酵、同时又能增加发酵产物营养含量的发酵菌剂及其制备方法。一种醋糟发酵复合微生物菌剂，由酸热芽孢杆菌(Bacillusacidocaldarius.)、黑根霉菌(Rhizopusstolonifer)和绿色木霉菌(Trichodermaviride)单菌种菌剂按重量比111复合配比而成，其中所述的单菌种菌剂首先分别将三种菌的原种通过一级试管扩繁、二级液体分别培养制成种菌；然后按米糠5060%麸皮5040%的重量百分比把米糠和麸皮混合搅拌均勻成混合物料，按菌种与混合物料110(体积质量比)分别接种培养好的种菌，制成单种菌菌剂。—种醋糟发酵复合微生物菌剂的制备方法，其步骤为1))将上述三种菌的原种分别通过一级试管扩繁、二级液体(PDA培养基)摇床培养48h后制成种菌；2)按下述重量百分比把米糠和麸皮混合搅拌均勻成混合物料，米糠5060%、麸皮5040%；3)将上述培养好的三种种菌分别按110(体积质量比)接种米糠和麸皮的混合物料上，制成单种菌菌剂；4)再将各单种菌菌剂按重量比111混合，包装。本发明具有以下优点1)本方法提供的复合微生物菌剂较其它现有微生物菌剂能提高醋糟堆肥的发酵温度，加速发酵进程，缩短发酵周期；2)本方法提供的菌剂耐酸性强，可适合pH小于5的发酵原料；3)使用本方法提供的复合微生物菌剂时不用调节醋糟原料的pH和C/N比，可缩短生产工艺流程，节省人力物力，提高生产效率；4)使用本方法提供的复合微生物菌剂发酵醋糟，其发酵成品全量养分(氮、磷、钾)含量高，营养好。具体实施例方式1.醋糟发酵单菌株的筛选为了确保筛选出真正适合醋糟原料的微生物，本研究的采用从新鲜醋糟本身和已自然发酵的醋糟原料中进行初步筛选。分别采集新鲜醋糟和已发酵醋糟，按浓度稀释法划线接种在TSA培养基和PDA培养基于28°C进行培养，通过进行多次分离，初步获得13个典型单菌落；通过固体初筛培养基(CMC平板培养基)和液体发酵培养基培养下CMC纤维素酶活力(均为常用方法)的测定，根据分离菌株分解CMC纤维素能力的强弱，对已分离菌株进行进一步的筛选，经多次传代(68代)培养，对已分离菌株进行进一步的筛选，最终筛选出分解纤维素能力比较强的3株菌株，分别编号为0P-2、FMUSL02。经参考《伯杰细菌鉴定手册》和《真菌鉴定手册》进行鉴定，0P-2为酸热芽孢杆菌(BacillusacidocaldariusDarland&Brock1971，9·)，FMl为漂根霉(Rhizopusstolonifer)，SL02为绿木霉(TrichodermaviridePers.exFr.)本实验所用到的培养基马铃薯培养基(简称PDA)和牛肉膏蛋白胨培养基(简称TSA)均为常用配方。固体初筛培养基(CMC平板培养基)配方为CMC_Na15g,MgS04.7H200.5g,NH4N031.0g，KH2P041.0g，琼脂20g，H20IOOOmL0121°C灭菌25min，过夜备用。液体发酵培养基=KH2PO41.0g,MgSO4·7H200.6g，NaCl0.lg，NaNO32.5g，CaCl2O.05g,FeCl30.Olg,醋糟(干燥后)20g,去离子水IOOOmL,pH自然，121°C灭菌25min。2.单个菌种的培养与制备1)斜面培养3种菌分别接斜面，按常规工艺进行培养；2)菌种的培养3种菌的培养均使用常规的PDA培养基(pH自然)，将配制好的培养基高压灭菌后，分别接种3种菌，放入28°C摇床培养箱120转/分，振荡培养48h；3)菌剂的制备将上述培养好的种菌分别按110(体积质量)比附着于米糠-麸皮(米糠5060%、麸皮5040%)混合载体上，制成单菌种的菌剂。3.不同单菌种菌剂进行组合，进行发酵试验对比，遴选最佳菌剂组合将以上筛选出的3个菌种进行完全方案的组合设计，试验共计7个处理(编号为17)，其中编号13为添加单个菌种的菌剂处理，编号47为添加两种或三种菌的复合菌剂处理(各处理所接菌剂组合具体见表1)，按照接种总量相等的原则和各菌剂11的比例进行接种，总接种比例为0.5%(重量比)。各处理(17)所用新鲜醋糟均为5吨，将菌剂与新鲜醋糟混合均勻后进行条垛式堆制发酵，不调节PH和碳氮比(C/N)。以所用的常规发酵菌剂(EM菌剂即EffectiveMicroorganisms菌剂，商品名为有机肥料发酵微生物_堆肥接种剂，购自佛山市碧沃丰生物科技有限公司)为对照处理(简称常规，表1)，先通过添加辅助物石灰、鸡粪调节醋糟的PH(6.0左右)和C/N(251左右)，再进行常规菌剂的接种，接种量为0.5%，所用新鲜醋糟均为5吨，混勻后即进行发酵。发酵过程中，每天10:00左右以用温度计测量堆温(堆肥表面从上至下约IOcm处)，堆肥前期4天翻堆一次，后期7天翻堆一次。每次翻堆混勻物料后四分法取样。通过对比不同处理下发酵温度以及全量养分(N、P、K)含量等指标的变化，以综合评价不同处理的发酵效果。表1单菌种与多菌种的固态发酵试验对比效果<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>注‘‘+”号表示添加相应的菌种。结果表明以同时添加3种菌的复合菌处理7具有更好的发酵效果，温度升高快(较常规处理提前7天升到70°C)，且高温维持时间长的优势，且发酵成品养分含量高，全氮、全磷、全钾含量(总量)可达到4.1%，较常规处理增加24%。4.发酵复合菌剂的培养与制备方法根据筛选结果，发酵效果最好的菌剂为一种复合菌剂，包括3种菌，酸热芽孢杆菌、黑根霉菌和绿木霉菌。该复合菌剂的制备包括以下步骤1)将酸热芽孢杆菌、黑根霉和绿木霉三种菌的原种分别通过一级试管扩繁、二级液体(PDA培养基)放入28°C摇床培养箱(120转/分)培养48h后制成种菌；2)按下述重量百分比把米糠和麸皮混合搅拌均勻成混合物料，米糠5060%、麸皮5040%；3)单种菌菌剂的制备将培养好的种菌分别按110(体积质量比)接种米糠和麸皮的混合载体上，制成单种菌菌剂。4)将分别接有以上3种菌的单种菌菌剂按重量比111混合，即为醋糟发酵的复合菌剂。实施一首先将酸热芽孢杆菌、黑根霉和绿木霉三种菌的原种接斜面，按常规工艺培养进行扩繁；然后进行二级液体(PDA培养基，pH自然)培养，28°C摇床培养箱120转/分下振荡培养48h制成种菌；再将上述培养好的种菌分别按110(体积质量)比附着于米糠-麸皮(各占50%)混合载体上，制成单菌种的菌剂；将接有3个种菌的单种菌菌剂分别按重量比111混合，即为醋糟发酵的复合菌剂。将复合菌剂接于20吨新鲜醋糟进行条垛式堆制发酵，接种比例为0.5%(重量比)，不调节pH和碳氮比(C/N)。试验以所用的常规EM菌剂为对照(简称常规处理)。常规处理先通过添加辅助物石灰、鸡粪调节醋糟的PH(至6.0左右)和C/N(至251左右)，再进行EM菌剂的接种，接种量为0.5%，所用新鲜醋糟为20吨。发酵时气温(上午10:00左右气温23.136.3°C)，发酵过程中，每天1000左右以用温度计测量堆温(堆肥表面从上至下约IOcm处)，堆肥前期4天翻堆一次，后期7天翻堆一次。发酵效果为发酵开始5天后，接该发明菌剂处理发酵温度可达到70.8°C，而常规处理10天后温度升到70°C，接该发明菌剂处理较常规处理提前5天；接该发明菌剂处理发酵周期(从开始到结束发酵)为39天，常规处理为45天，接该发明菌剂处理较常规处理发酵周期缩短6天；接该发明菌剂处理发酵成品养分含量高，全氮、全磷和全钾含量分别为3.2%、0.61%和0.29%，常规处理则分别为2.7%、0.41%和0.17%，接该发明菌剂处理较常规处理全氮、全磷和全钾含量分别提高18.5%、48.8%和70.6%，总全量养分(氮、磷、钾)含量提高25%。实施二首先将将酸热芽孢杆菌、黑根霉和绿木霉三种菌的原种接斜面，按常规工艺培养进行扩繁；然后进行二级液体(PDA培养基，pH自然)培养，28°C摇床培养箱120转/分下振荡培养48h制成种菌；再将上述培养好的种菌分别按110(体积质量)比附着于米糠_麸皮(米糠60%、麸皮40%)混合载体上，制成单菌种的菌剂；将接有3个种菌的单种菌菌剂分别按重量比111混合，即为醋糟发酵的复合菌剂。将复合菌剂接于20吨新鲜醋糟进行条垛式堆制发酵，接种比例为0.7%(重量比)，不调节pH和碳氮比(C/N)。试验以所用的常规EM菌剂为对照(简称常规处理)。常规处理先通过添加辅助物石灰、鸡粪调节醋糟的PH(至6.0左右)和C/N(至251左右)，再进行EM菌剂的接种，接种量为0.7%，所用新鲜醋糟也为20吨。发酵时气温(上午10:00左右气温23.136.3°C)，发酵过程中，每天1000左右以用温度计测量堆温(堆肥表面从上至下约IOcm处)，堆肥前期4天翻堆一次，后期7天翻堆一次。发酵效果为发酵开始4天后，接该发明菌剂处理发酵温度可达到71.2°C，常规处理11天后温度升到70°c以上，接该发明菌剂处理较常规处理提前7天；接该发明菌剂处理发酵周期(从开始到结束发酵)为38天，常规处理为46天，接该发明菌剂处理较常规处理发酵周期缩短8天；接该发明菌剂处理发酵成品全氮、全磷和全钾含量分别为3.4%,0.62%和0.29%，较常规处理则分别提高25.9%、51.2%和70.5%，总全量养分含量提高约30%。从以上2个实施举例及其结果可以看出，该发明菌剂更适合新鲜醋糟(pH为4.5左右)的发酵，不但可以较常规菌剂加快发酵进程，缩短发酵周期，发酵时不需要调节醋糟原料的PH和C/N，工艺简单，节省人力物力，提高生产效率，并且发酵产品全量养分(氮、磷和钾)含量。权利要求一种醋糟发酵复合微生物菌剂，其特征在于由酸热芽孢杆菌(Bacillusacidocaldarius.)、黑根霉菌(Rhizopusstolonifer)和绿色木霉菌(Trichodermaviride)单菌种菌剂按重量比1∶1∶1复合配比而成，其中所述的单菌种菌剂首先分别将三种菌的原种通过一级试管扩繁、二级液体分别培养制成种菌；然后按米糠50～60％∶麸皮50～40％的重量百分比把米糠和麸皮混合搅拌均匀成混合物料，按菌种与混合物料体积与质量比1∶10的比例分别接种培养好的种菌，制成单种菌菌剂。2.一种醋糟发酵复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于其步骤为1))将上述酸热芽孢杆菌(Bacillusacidocaldarius.)、黑根霉菌(Rhizopusstolonifer)和绿色木霉菌(Trichodermaviride)三种菌的原种分别通过一级试管扩繁、二级液体(PDA培养基)摇床培养48h后制成种菌；2)按下述重量百分比把米糠和麸皮混合搅拌均勻成混合物料，米糠5060%、麸皮5040%；3)将上述培养好的三种种菌分别按体积与质量110的比例接种米糠和麸皮的混合物料上，制成单种菌菌剂；4)再将各单种菌菌剂按重量比111混合，包装。全文摘要本发明公开了一种醋糟发酵复合微生物菌剂的制备方法，由酸热芽孢杆菌(Bacillusacidocaldarius.)、黑根霉菌(Rhizopusstolonifer)和绿色木霉菌(Trichodermaviride)单菌种菌剂按重量比1∶1∶1复合配比而成，其中所述的单菌种菌剂首先分别将三种菌的原种通过一级试管扩繁、二级液体分别培养制成种菌；然后按米糠50～60％∶麸皮50～40％的重量百分比把米糠和麸皮混合搅拌均匀成混合物料，按菌种与混合物料体积与质量比1∶10的比例分别接种培养好的种菌，制成单种菌菌剂。本方法提供的复合微生物菌剂较其它现有微生物菌剂能提高醋糟堆肥的发酵温度，加速发酵进程，其发酵成品全量养分(氮、磷、钾)含量高，营养好。文档编号C12R1/885GK101805697SQ201010137319公开日2010年8月18日申请日期2010年4月1日优先权日2010年4月1日发明者吴沿友,孙德民,朱咏莉,李萍萍,杨运克申请人:江苏大学