专利名称：：辅助鉴定乳杆菌属菌株的专用引物及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种辅助鉴定乳杆菌属菌株的专用引物及其应用。
背景技术：
：无论是在临床医学还是畜禽水产疾病防治，病原菌侵染肠道都被认为是疾病引发途径之一。随着人们健康意识的提高和致病菌抗药性的增强，生物疗法逐渐取代了传统的化学疗法(如施加抗生素)。服用益生菌-例如乳酸杆菌和双歧杆菌，会有效抑制肠道中病原菌的生长，并且有益于肠道微生态环境。然而要起到益生作用，确定益生菌能紧密地粘附在肠道粘膜上皮细胞是必要前提。有实验将直肠粘膜组织切片，进行活菌培养和RAPD鉴定(Klarin，B.，Johansson,Μ.，Molin，G.，Larsson,Α.，Jeppsson，B.,2005.AdhesionoftheprobioticbacteriumLactobaci1lusplantarum299vontothegutmucosaincriticallyillpatients:arandomisedopentrial.CriticalCare.9,285-293.)。也有实验用扫描电镜技术来研究沙门氏菌和土著菌群粘附粘膜上皮的情况(sSoerjadi,A.，Rufner,R.，Snoeyenbos,G.，Weinack,0.，1982.Adherenceofsalmonellaeandnativegutmicrofloratothegastrointestinalmucosaofchicks.AvianDiseases，576-584.)。但是这些技术手段均存在消耗时间长、劳动强度大、鉴定结果受培养条件等因素的影响、不可避免的偏好性和缺陷性等。
发明内容本发明的目的是提供一种辅助鉴定乳杆菌属菌株的专用引物及其应用。本发明保护引物对甲和引物对乙组成的专用引物；所述引物对甲由序列表的序列13所示DNA(rpoBup-I)和序列表的序列14所示DNA(rpoBdown-I)组成；所述引物对乙由序列表的序列15所示DNA(rpoBup-II)和序列表的序列16所示DNA(rpoBdown-II)组成。所述专用引物可用于辅助鉴定乳杆菌属菌株和/或乳杆菌属菌种。所述专用引物可用于制备辅助鉴定乳杆菌属菌株的试剂盒。本发明还保护一种辅助鉴定乳杆菌属菌株的试剂盒，包括所述专用引物。本发明提供的辅助鉴定乳杆菌属菌株的方法，包括如下步骤用所述专用引物对待测菌株的总DNA进行PCR扩增；如果用引物对甲或引物对乙可以扩增出PCR产物，待测菌株为候选的乳杆菌属菌株；如果用引物对甲和引物对乙都不能扩增出PCR产物，待测菌株为候选的非乳杆菌属菌株。所述PCR产物可为350-450bp的PCR产物，优选为379bp的PCR产物。所述方法还可包括如下步骤㈧或步骤⑶(A)将PCR产物进行测序；根据测序结果辅助确定待测菌株为乳杆菌属的哪个菌株；(B)将PCR产物进行变性梯度凝胶电泳，根据电泳图辅助确定待测菌株为乳杆菌属的哪个菌株。所述待测菌株具体可为如下菌株短乳杆菌(Lactobacillusbrevis)CGMCC1.2028、干酪乳杆菌干酪亚种(Lactobacilluscasei)CGMCC1.2435、干酪乳杆菌干酪亚种(Lactobacilluscasei)ATCC393、德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus)CICC6103、德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus)CICC6097、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)CICC6132、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)CICC6119、嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)JCM1132、植物乳杆菌(Lactobacillusρlantarumsubsp.plantarum)JCM1149>m^H^LIflif(Lactobacillusrhamnosus)CICC6141、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)20300、麦汁生物酸化菌(Lactobacillusamylovorus)JCM1126、约氏乳杆菌(Lactobacillusjohnsonii)466、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)482A、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)布、大肠杆菌(Escherichiacoli)Transl-Tl或枯草杆菌(Bacillussubtilis)CGMCC1.107。所述专用引物可用于辅助鉴定水产动物肠道壁中乳杆菌属菌株的定植能力。常见的水产动物均可，如斑马鱼。本发明提供的专用引物是基于乳杆菌属基因组中的保守区和乳杆菌属不同菌种中的特异区设计的，可以用于辅助鉴定待测菌株是否为乳杆菌属菌株，结合变性梯度凝胶电泳(DGGE)或测序技术，还可以进一步确定待测菌为乳杆菌属中的哪个菌株。采用本发明的专用引物，结合PCR和DGGE可以直接鉴定斑马鱼肠道壁益生菌定植情况，此方法是目前最快速、简便、有效的。图1为步骤三的1的PCR产物的琼脂糖电泳图。图2为步骤三的2的PCR产物的琼脂糖电泳图。图3为rpoB-I为引物的扩增产物的DGGE电泳图。图4为对图3中各个条带进行标记后的电泳图。图5为rpoB-II为引物的扩增产物的DGGE电泳图。图6为用变性梯度凝胶电泳(DGGE)分离鉴定4周的斑马鱼肠道壁益生菌定植情况；1:g+L;2:E1;3:E2;4:E3;5:CI；6=CII；7=CIII；8=PI；9=PII；10=PIII；11CI；12=CII；13=CIII；14=PI；15=PII；161:g+L；17=PIII；18=CI；19=CII；20CIII；21=PI；22=PII；23=PIII；24=CI；25=CII；26=CIII；27=PI；28=PII；29PIII；5-10第一周；11-15,17第二周；18-23第三周；24-29第四周。具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。AB系斑马鱼购自北京市通州区槨县镇观观赏鱼养殖基地。普通粒料购自浙江欣欣饲料股份有限公司，经过粉碎、过筛，制成粒径约为30目的颗粒。实施例1、特异性引物对的获得RNA聚合酶β亚基由rpoB基因编码，该亚基具有RNA聚合酶活性，催化RNA的合成。大多数细菌的rpoB基因高度保守，且为单拷贝(Kapur，V.，Li，L.,Iordanescu,S.,Hamrick,Μ.,ffanger,A.,Kreiswirth,B.,Musser,J.,1994.CharacterizationbyautomatedDNAsequencingofmutationsinthegene(rpoB)encodingtheRNApolymerasebetasubunitinrifampin-resistantMycobacteriumtuberculosisstrainsfromNewYorkCityandTexas.JournalofClinicalMicrobiology.32，1095—1098.)。UigL.brevisCGMCC1.2028(NC_008497.1),L.caseiCGMCC1.2435(NC_008526.1)，L.caseiBL23(NC_010999.1)，L.acidophilusNCFM(NC_006814.1)，L.acidophilusATCC4796(NZ_ACHN00000000),L.plantarumsubsp.plantarumJCMl149(NZ_ACGZ00000000)，L.rhamnosusGG(NC_013198)，L.helveticusDSM20075(NZ_ACLM00000000),LactobacillusjohnsoniiATCC33200(NZ_ACGR00000000),L.crispatusJV-VOl(NZ_ACKR00000000),LsalivariusATCC11741(NZ_ACGT00000000),L.delbrueckiisubsp.bulgaricusCICC6103(NC_008054),L.delbrueckiisubsp.bulgaricusCICC6097(NC_008529),L.reuteriCICC6132(NC_010609),Escherichiacoli0157:H7str.TW14359(NC_013008)，Bacillussubtilissubsp.subtilisstr.168(NC_000964)的rpoB基因，经比对找到它们的保守区域，其保守区并非100%相似，若设计成简并引物，PCR结果呈非单一特异性扩增，这与DGGE对引物的特殊要求相违背，故设计特异性引物对(见表1)。表1特异性引物对<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>实施例2、专用引物在鉴定乳杆菌属菌株中的应用斑马鱼饥饿1周后，饲喂3天普通粒料，挑选规格一致(体重为0.19士0.02g)的鱼种进行实验。一、样本的制备17个实验菌株短乳杆菌(Lactobacillusbrevis)CGMCC1.2028；(1.2028)；干酪乳杆菌干酪亚种(Lactobacilluscasei)CGMCC1.2435；(1.2435)；干酪乳杆菌干酪亚种(Lactobacilluscasei)ATCC393，即LactobacilluscaseiBL23；(BL23)；德氏乳杆菌保力口利亚亚种(Lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus)CICC6103；(6103)；德氏乳杆菌保力口利亚亚种(Lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus)CICC6097；(6097)；罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)CICC6132；(6132)；罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)CICC6119；(6119)；嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)JCM1132；(1132)植物乳杆菌(Lactobacillusρlantarumsubsp.plantarum)JCM1149；(1149)；鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)CICC6141；(6141)；鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)20300；(20300)；麦汁生物酸化菌(Lactobacillusamylovorus)JCM1126；(1126)；约氏乳杆菌(Lactobacillusjohnsonii)466；(466)；布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)482A；(482A)；布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)布；(布)；大肠杆菌(Fscherichiacoli)Transl-Tl(北京全式金生物技术有限公司出售的Transl-TlPhageResistantChemicallyCompetentCell)(G-的代表菌)；(Ε.coli)；枯草杆菌(Bacillussubtilis)CGMCC1.107(G+的代表菌)；(枯草)。将17个实验菌株分别用MRS培养基(见表2)活化，分别用平板菌落计数法和光电比浊计数法(沈萍，范秀容，李广武，1999.微生物学实验.高等教育出版社，北京，PP-92-96.)测菌液浓度。表2MRS培养基(ρΗ6·8)配方酪蛋白胨10.Og牛肉膏10.Og酵母提取物~~5Toi葡萄糖5Toi乙酸钠5Toi柠檬酸二铵吐温80LO^<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>将17种菌液混合，混合液中每种菌株的含量均为IO8个菌体细胞，离心收集菌体；取5条斑马鱼的肠道壁；将菌体与肠道壁混合，作为样本一(g+L)。取5条斑马鱼的肠道壁，混合，作为样本二(gut)。二、提取总DNA分别提取17种菌液、样本一和样本二的总DNA，步骤如下(1)0.2g样本(或Iml菌液)，加入500μ1溶菌酶液(20mMTris,ρΗ8·O；2mMNa2-EDTA；1.2%Triton；终浓度为20mg/ml的溶菌酶)，37°C水浴lh。(2)水浴后12，OOOrpm离心lmin，上清移入新管，沉淀待处理。(3)将步骤⑵的上清加入20μ1RNaseA(16mg/ml)溶液，室温反应2h。(4)再加入20μ1蛋白酶K(20mg/ml)溶液，56°C水浴lh。(5)再加入200μ1的10%SDS，37°C水浴30min。(6)再加入等体积的氯仿，13，OOOrpm离心15min，得到上清A待处理。(7)将步骤(2)的沉淀加入500μ1CTABLysisBuffer(IOOmMTris-HCl；IOOmMNaEDTA；1.5MNaCl；1%cetyltrimethylammoniumbromide；2%SDS,pH8.0),70°C7jC浴4h，每30min摇勻一次。(8)水浴后10，OOOrpm离心18min，上清移入新管.(9)将上清中加入等体积的氯仿，13，OOOrpm离心15min，得到上清B。(10)将步骤(9)的上清B与步骤(6)的上清A混合。(11)在混合物中加入等体积的异丙醇。(12)-20"C，放置30min。(13)12，OOOrpm离心lOmin，弃上清。(14)用70%乙醇洗涤DNA沉淀，真空干燥。(15)加适量无菌水溶解DNA。用TIANGEN普通DNA产物纯化试剂盒(天根生化公司，北京，中国)纯化。三、PCR1、用表1的rpoB-I引物对分别对17种菌株菌液提取的总DNA为模板进行PCR。表3PCR反应体系(50μ1)反应体系生产商体积IOXPCRBuffer(Mg2+Plus)宝生物工程有限公司，大连，中国δΤ~dNTPMixture(各2.5mM)宝生物工程有限公司，大连，中国~rpoBup-1(20μΜ)英骏生物技术公司，上海，中国0.8μ1rpoBdown-I(20μΜ)英骏生物技术公司，上海，中国0.8μ1TaKaRaTaqHS宝生物工程有限公司，大连，中国0.3μ1DNA模板21~ddH2037μ1PCR程序:95°C5min；94°C30s、55°C30s,72°C30s,30个循环；72°CIOmin0将PCR产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳，结果见图1。PCR预期条带约340bp，因为引物带有40bp的GC夹子，所以PCR产物长度约380bp。结果表明，除了6103、6097、6132和6119，其余11个乳杆菌属菌株均得到380bp左右的扩增产物，Ε.coli和枯草没有得到预期条带。将PCR产物进行测序。466的PCR产物的核苷酸序列见序列表的序列2(379bp，其中自5，末端第1至40位核苷酸为上游引物引入的40bp的GC夹子，41至379位核苷酸为339bp的菌株特异性区域)。1132的PCR产物的核苷酸序列见序列表的序列3(379bp，其中自5，末端第1至40位核苷酸为上游引物引入的40bp的GC夹子，41至379位核苷酸为339bp的菌株特异性区域)。布的PCR产物的核苷酸序列见序列表的序列4(379bp，其中自5，末端第1至40位核苷酸为上游引物引入的40bp的GC夹子，41至379位核苷酸为339bp的菌株特异性区域)。482A的PCR产物的核苷酸序列见序列表的序列5(379bp，其中自5’末端第1至40位核苷酸为上游引物引入的40bp的GC夹子，41至379位核苷酸为339bp的菌株特异性区域)。1126的PCR产物的核苷酸序列见序列表的序列6(379bp，其中自5’末端第1至40位核苷酸为上游引物引入的40bp的GC夹子，41至379位核苷酸为339bp的菌株特异性区域)。1.2435的PCR产物的核苷酸序列见序列表的序列7(379bp，其中自5’末端第1至40位核苷酸为上游引物引入的40bp的GC夹子，41至379位核苷酸为339bp的菌株特异性区域)。BL23的PCR产物的核苷酸序列见序列表的序列8(379bp，其中自5’末端第1至40位核苷酸为上游引物引入的40bp的GC夹子，41至379位核苷酸为339bp的菌株特异性区域)。1.2028的PCR产物的核苷酸序列见序列表的序列9(379bp，其中自5’末端第1至40位核苷酸为上游引物引入的40bp的GC夹子，41至379位核苷酸为339bp的菌株特异性区域)。1149的PCR产物的核苷酸序列见序列表的序列10(379bp，其中自5’末端第1至40位核苷酸为上游引物引入的40bp的GC夹子，41至379位核苷酸为339bp的菌株特异性区域)。6141的PCR产物的核苷酸序列见序列表的序列ll(379bp，其中自5’末端第1至40位核苷酸为上游引物引入的40bp的GC夹子，41至379位核苷酸为339bp的菌株特异性区域)。20300的PCR产物的核苷酸序列见序列表的序列12(379bp，其中自5’末端第1至40位核苷酸为上游引物引入的40bp的GC夹子，41至379位核苷酸为339bp的菌株特异性区域)。布与482A的测序结果一致(序列4和序列5相同)，表明两者为同一菌株。2、用表1的rpoB-II引物对分别对4种菌株(6103,6097,6132和6119)的菌液、两种对照菌株的菌液、样本一和样本二中提取的总DNA为模板进行PCR。PCR体系见表4。表4PCR反应体系(50μ1)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>PCR程序:95V5min；94°C30s、55°C30s,72°C30s,30个循环；72°CIOmin0将PCR产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳，结果见图2。PCR预期条带约340bp，因为引物带有40bp的GC夹子，所以PCR产物长度约380bp。结果表明，6103、6097、6132、6119和g+L均得到380bp左右的扩增产物，E.coli、枯草和gut没有得到预期条带。将PCR产物进行测序。6119的PCR产物的核苷酸序列见序列表的序列1(379bp，其中自5’末端第1至339位核苷酸为339bp的菌株特异性区域，340至379位核苷酸为下游引物引入的40bp的GC夹子)。四、变性梯度凝胶电泳(DGGE)将步骤三的1中，具有380bp左右的扩增产物的11个乳杆菌属菌株的PCR产物混合，作为样本“混合PCR-I”。将具有380bp左右的扩增产物的11个乳杆菌属菌株的PCR产物、“混合PCR-I”、步骤三的1中E.coli的PCR产物和枯草的PCR产物进行进行20%-60%变性梯度凝胶电泳(80V，16小时)，见图3。除了E.coli和枯草，11个乳杆菌属菌株各显示1条条带，“混合PCR-I”显示9条条带。图3中，“混合PCR-I”是的11个PCR产物的等量混合，理论上说应与右边的11条泳道一一对应，唯一例外的是1126的条带C14在混合泳道中没有对应，由于C14与C4、C5的迁移率十分接近，且C4、C5间隔较小，所以可能和C4或C5合并在一起没有分开。布与482A为同一菌株，所以在图3中，C3-C12-C13在同一水平线上。分别将11个乳杆菌属菌株的条带、“混合PCR-I”的条带进行编号(C1-C20)，见图4。分别回收20个条带进行测序。ClO和C2的测序结果同序列2。Cll和Cl的测序结果同序列3。C12、C13和C3的测序结果同序列4(或序列5)。C14的测序结果同序列6。C15和C4的测序结果同序列7。C16和C5的测序结果同序列8。C17和C6的测序结果同序列9。C18和C7的测序结果同序列10。C19和C8的测序结果同序列11。C20和C9的测序结果同序列12。将步骤三的2中，具有380bp左右的扩增产物的6103、6097、6132、6119的PCR产物、“g+L”、以及步骤三的2中gut的PCR产物、E.coli的PCR产物和枯草的PCR产物进行进行20%-60%变性梯度凝胶电泳(80V，16小时)，见图5。也许因为混合菌液基因组提取效率存在差别，g+L并不是理想的3条带，而是1条。6103和6097都是德氏乳酸菌保加利亚亚种，其目的rpoB序列本应相差2个碱基，由于这2个碱基在引物的位置，引物都是一样的，所以扩增得到一样的产物。从图3的条带对应结果看，已经达到预期效果。即本发明所扩增的rpoB部分片段具有序列单一性和种属特异性。利用PCR-DGGE的方法，在合适梯度的聚丙烯酰胺胶上可有效的区分各株乳酸杆菌，是快速而简便的。对于rpoB序列未知的菌种只需测序一次，对于序列已知(在GenBank中可查到)的菌种可以免测序，在应用中可节省很多操作。本发明的引物对是基于乳杆菌属基因组中的保守区和乳杆菌属不同菌种中的特异区设计的。以待测菌株的基因组DNA为模板，采用本发明的两对引物进行PCR，可以根据PCR产物辅助鉴定待测菌是否属于乳杆菌属，通过将PCR产物测序，还可以进一步确定待测菌为乳杆菌属中的哪个菌株。实施例3、应用专用引物鉴定乳杆菌属菌株在斑马鱼肠道中的定植性一、PBS和菌剂饲料的制备PBS缓冲液(pH7·4)配方NaCl8gKCl0.2gNa2HPO41.42gKH2PO40.27g加水溶解，定容至1L，灭菌，室温保存"PBS粒”的制备将100mlPBS缓冲液均勻喷洒在IOOg普通粒料上，20°C风干。“LAB粒”的制备分别将15种乳酸菌菌液离心，收集菌体，用PBS重悬、离心，反复洗涤2遍后，均勻喷洒在IOOg普通粒料上，20°C风干，每种乳酸菌浓度约为6XIO7个细胞/克饲料。二、分组饲喂斑马鱼饥饿1周后，饲喂3天普通粒料，挑选规格一致(体重为0.19士0.02g)的鱼种进行实验。实验在室内循环养殖缸(10CmX7CmX7Cm)中进行。随机选取15尾鱼，每5只一缸(E1，E2，E3)，取肠道样(作为初始样本)；剩下的分组如下(每组6个缸，每缸20尾鱼)对照组(Cl，C2，C3，C4，C5，C6)饲喂“PBS粒”，每次的饲喂量为鱼体重的1%)；益生菌组(P1，P2，P3，P4，P5，P6)饲喂“LAB粒”，每次的饲喂量为鱼体重的)。每天投喂2次(09:00和15:00)，每次30分钟，至饱食，每周调整投喂量。缸内保证24h充气，水流速约为lL/min。养殖期间每天监控水质，水温为26.5士2.5°C。每天从06:00到20:00间保持14h光照。养殖周期为4周，每周最后一天的14:00取样。在第二周取样后，进行洗缸换水，下午禁食1次。实验中每周的取样情况如下第一周每缸随机选取4尾鱼，8尾鱼作为1个平行，共3个平行(、)；解剖、保存肠道壁于_20°C；第二周每缸随机选取3尾鱼，6尾鱼作为1个平行，共3个平行；解剖、保存肠道壁于4°C；第三周每缸随机选取3尾鱼，6尾鱼作为1个平行，共3个平行；解剖、保存肠道壁于-20°C；第四周每缸随机选取3尾鱼，6尾鱼作为1个平行，共3个平行；解剖、保存肠道壁于-20°C。每周取样时，Cl和C2作为一个平行(CI)，C3和C5作为一个平行(CII)，C4和C6作为一个平行(CIII)，Pl和P5作为一个平行(PI)，P2和P3作为一个平行(PII)，P4和P6作为一个平行(PIII)。三、斑马鱼肠道壁中益生乳杆菌属菌株定植能力鉴定将步骤二得到的各个样本分别用以下两种方法进行鉴定1、采用本发明的引物对在进行肠道菌群分析时为了避免个体间差异将每个处理组的所有肠道样品混合均勻。总DNA提取、PCR(采用rpoB-I引物对)和变性梯度凝胶电泳方法同实施例2。结果见图6。可以看出，益生菌组的泳道中强带有412、415、416、419、々21。回收信号强的条带进行测序，测序结果A12是L.buchneri布(相对丰度19.52%)，A15是L.brevisCGMCC1.2028(相对丰度20·42%)，A16是L.plantarumsubsp.plantarumJCM1149(相对丰度17.25%)，A19是L.rhamnosusCICC6141(相对丰度15.26%)，A21是L.rhamnosus20300(相对丰度13.21%)。所以采用本发明的引物对作为PCR引物，经过DGGE鉴定，斑马鱼肠道壁可有效定植的益生乳酸菌有L.buchneri布，L.brevisCGMCC1.2028,L.plantarumsubsp.plantarumJCM1149,L.rhamnosusCICC6141,L.rhamnosus20300。2、采用MRS纯培养采用选择性培养基MRS纯培养斑马鱼肠道壁粘附乳酸菌群，对DGGE结果进行验证。纯培养实验的结果78个菌落测序，87.2%为L.plantarumsubsp.ρIantarumJCM1149,6.4%为L.brevisCGMCC1.2028,2.5%为L.delbrueckiisubsp.bulgaricusCICC6097，1.3%为L.reuteriCICC6132，2.5%为L.buchneri布。验证结果说明了，尽管每种菌株所占比例不尽相同，但是确定的斑马鱼肠道优势定植菌均与DGGE鉴定结果一致。权利要求引物对甲和引物对乙组成的专用引物；所述引物对甲由序列表的序列13所示DNA和序列表的序列14所示DNA组成；所述引物对乙由序列表的序列15所示DNA和序列表的序列16所示DNA组成。2.权利要求1所述专用引物在辅助鉴定乳杆菌属菌株和/或乳杆菌属菌种中的应用。3.权利要求1所述专用引物在制备辅助鉴定乳杆菌属菌株的试剂盒中的应用。4.一种辅助鉴定乳杆菌属菌株的试剂盒，包括权利要求1所述专用引物。5.辅助鉴定乳杆菌属菌株的方法，包括如下步骤用权利要求1所述专用引物对待测菌株的总DNA进行PCR扩增；如果用引物对甲或引物对乙可以扩增出PCR产物，待测菌株为候选的乳杆菌属菌株；如果用引物对甲和引物对乙都不能扩增出PCR产物，待测菌株为候选的非乳杆菌属菌株。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于所述PCR产物为350-450bp。7.如权利要求6所述的方法，其特征在于所述PCR产物为379bp。8.如权利要求5至7中任一所述的方法，其特征在于所述方法还包括如下步骤(A)或步骤⑶(A)将PCR产物进行测序；根据测序结果辅助确定待测菌株为乳杆菌属的哪个菌株；(B)将PCR产物进行变性梯度凝胶电泳，根据电泳图辅助确定待测菌株为乳杆菌属的哪个菌株。9.如权利要求5至8中任一所述的方法，其特征在于所述待测菌株为短乳杆菌(Lactobacillusbrevis)CGMCC1·2028、干酪乳杆菌干酪亚种(Lactobacilluscasei)CGMCC1.2435、干酪乳杆菌干酪亚种(Lactobacilluscasei)ATCC393、德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus)CICC6103、德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus)CICC6097、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)CICC6132、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)CICC6119、嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)JCM1132、植物乳杆菌(Lactobacillusplantatumsubsp.plantarum)JCM1149>m^H^LIflif(Lactobacillusrhamnosus)CICC6141、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)20300、麦汁生物酸化菌(Lactobacillusamylovorus)JCM1126、约氏乳杆菌(Lactobacillusjohnsonii)466、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)482A>^ΕξIflif(Lactobacillusbuchneri)布、大肠杆菌(Escherichiacoli)Transl-Tl或枯草杆菌(Bacillussubtilis)CGMCC1.107。10.权利要求1所述专用引物在辅助鉴定水产动物肠道壁中乳杆菌属菌株的定植能力中的应用；所述水产动物优选为斑马鱼。全文摘要本发明公开了一种辅助鉴定乳杆菌属菌株的专用引物及其应用。所述专用引物由引物对甲和引物对乙组成；引物对甲由序列表的序列13和序列14所示DNA组成；引物对乙由序列表的序列15和序列16所示DNA组成。用所述专用引物对待测菌株的总DNA进行PCR扩增；如果用引物对甲或引物对乙可以扩增出PCR产物，待测菌株为候选的乳杆菌属菌株；如果用引物对甲或引物对乙都不能扩增出PCR产物，待测菌株为候选的非乳杆菌属菌株。结合变性梯度凝胶电泳(DGGE)或测序技术，还可以进一步确定待测菌为乳杆菌属中的哪个菌株。采用本发明的专用引物，结合PCR和DGGE可以直接鉴定水产动物肠道壁益生菌定植情况，此方法是目前最快速、简便、有效的。文档编号C12N15/11GK101818147SQ20101017176公开日2010年9月1日申请日期2010年5月7日优先权日2010年5月7日发明者何夙旭,刘玉春,周志刚,姚斌,孟昆,曹雅男,王雯雯,石鹏君申请人:中国农业科学院饲料研究所