专利名称：一种醛脱氢酶基因、载体、工程菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及来源于酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)菌株中的醛脱氢酶 基因及其重组表达载体、基因工程菌，及其在制备重组醛脱氢酶中的应用。
背景技术：
醛脱氢酶能催化3-羟基丙醛、丙醛和乙醛分别生成3-羟基丙酸、丙酸和乙酸，在 化工领域及人体乙醛代谢中发挥着重要作用。醛脱氢酶广泛存在于植物、动物及微生物中， 其微生物来源主要有酿酒酵母及大肠杆菌。醛脱氢酶是一种复合体，含有三个亚基，分子量 分别为 54KD、49KD 和 12KD。目前不同来源的醛脱氢酶基因已经被克隆和测序，并且实现了在不同宿主中的表 达。然而野生型醛脱氢酶活力较低，限制了其大规模的生产，因此，构建具有工业用途的醛 脱氢酶基因工程菌意义重大。
发明内容
本发明目的是提供一种醛脱氢酶基因及其重组表达载体、基因工程菌，及其在制 备重组醛脱氢酶中的应用。本发明采用的技术方案是一种来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的醛脱氢酶基因，具有SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列。该序列由如下方法获得利用PCR 技术，在弓丨物 1 (ATGTCACACCTTCCTATGACAGTGCC)、弓丨物 2 (GTCCAATTTGGCACGGACCGC)的作用下，以来源于酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae) 菌株中的总基因组DNA为模板，克隆得到约1.5kb的醛脱氢酶的基因片段。将该片段连接 到pMD18-T载体上获得克隆载体pMD18-T-aldH和转化了 pMD18-T_aldH的重组大肠杆菌 JM109/pMD18-T-aldH。对重组质粒进行测序，并利用软件对测序结果进行分析，分析表明该序列含有一 个长为1488bp的开发阅读框。该基因核苷酸序列为(SEQ IDN0!)1ATGTCACACC TTCCTATGAC AGTGCCTATC AAGCTGCCCA ATGGGTTGGA ATATGAGCAA
61CCAACGGGGT TGTTCATCAA CAACAAGTTT GTTCCTTCTA AACAGAACAA GACCTTCGAA
121GTCATTAACC CTTCCAOGGA AGAAGAAATA TGTCATATTT ATGAAGGTAG AGAGGACGAT
181GTGGAAGAGG CCGTGCAGGC CGCOGACCGT GCCTTCTCTA ATGGGTCTTG GAA0GGTATC
241GACCCTATTG ACAGGGGTAA GGCTTTGTAC AGGTTAGCCG AATTAATTGA ACAGGACAAG
301GATGTCATTG CTTCCATOGA GACTTTGGAT AAOGGTAAAG CTATCTCTTC CT0GAGAGGA
361GATGTTGATT TAGTCATCAA CTATTTGAAA TCTTCTGCTG GCTTTGCTGA TAAAATTGAT
421GGTAGAATGA TTGATACTGG TAGAACCCAT TTTTCTTACA CTAAGAGACA GCCTTTGGGT
481GTTTGTGGGC AGATTATTCC TTGGAATTTC CCACTGTTGA TGTGGGCCTG GAAGATTGCC
541CCTGCTTTGGTCAC0GGTAACACOGTCGTG TTGAGGACTGCCGAATCCACCCCATTGTCC
601GCTTTGTATGTGTCTAAATACATCCCACAG G0GGGTATTCCACCTGGTGTGATCAACATT
661GTATC0GGGTTTGGTAAGATTGTGGGTGAG GCCATTACAAACCATCCAAAMTCAMMG
721GTTGCCTTCACAGGGTCCACGGCTAOGGGT AGACACATTTACCAGTCCGCAGC0GCAGGC
781TTGMMMGTGACTTTGGAGCTGGGTGGT AAATCACCAAACATTGTCTTCGCGGACGCC
841GAGTTGAAAAAAGC0GTGCAAAACATTATC CTTGGTATCTACTACAATTCTGGTGAGGTC
901TGTTGTG0GGGTTCAAGGGTGTATGTTGAAGAATCTATTTACGACAAATTCATTGAAGAG
961TTCAAAGCCGCTTCTGAATCCATCAAGGTGGGCGACCCATTCGATGAATCTACTTTCCAA
1021GGTGCACAAACCTCTCAAATGCAACTAAACAAAATCTTGAAATA0GTTGACATTGGTAAG
1081AATGAAGGTGCTACTTTGATTAC0GGTGGTGAAAGATTAGGTAGCAAGGGTTACTTCATT
1141AAGCCAACTGTCTTTGGTGACGTTAAGGAAGACATGAGAATTGTCAAAGAGGAAATCTTT
1201GGCCCTGTTGTCACTGTAACCAAATTCAAATCTGC0GACGAAGTCATTAACATGG0GAAC
1261GATTCTGAATACGGGTTGGCTGCTGGTATTCACACCTCTAATATTAATACCGCCTTAAAA
1321GTGGCTGATAGAGTTAATGCGGGTA0GGTCTGGATAAACACTTATAACGATTTCCACCAC
1381GCAGTTCCTTTCGGTGGGTTCAATGCATCTGGTTTGGGCAGGGAAATGTC TGTTGATGCT
1441TTACAAAACT ACTTGCAAGT TAAAGCGGTC CGTGCCAAAT TGGACATT 利用软件对该基因序列进行分析，并推知其编码的氨基酸序列为(SEQ ID NO 2)MSHLPMTVPIKLPNGLEYEQPTGLFINNKFVPSKQNKTFEVINPSTEEEICHIYEGREDD
VEEAVQAADRAFSNGSffNGIDPIDRGKALYRLAELIEQDKDVIASIETLDNGKAISSSRG
DVDLVINYLKSSAGFADKIDGRMIDTGRTHFSYTKRQPLGVCGQIIPffNFPLLMWAffKIA
PALVTGNTVVLRTAESTPLSALYVSKYIPQAGIPPGVINIVSGFGKIVGEAITNHPKIKK
VAFTGSTATGRHIYQSAAAGLKKVTLELGGKSPNIVFADAELKKAVQNIILGIYYNSGEV
CCAGSRVYVEESIYDKFIEEFKAASESIKVGDPFDESTFQGAQTSQMQLNKILKYVDIGK
NEGATLITGGERLGSKGYFIKPTVFGDVKEDMRIVKEEIFGPVVTVTKFKSADEVINMAN
DSEYGLAAGIHTSNINTALKVADRVNAGTVWINTYNDFHHAVPFGGFNASGLGREMSVDA
LQNYLQVKAVRAKLDI本发明还涉及含有所述醛脱氢酶基因的重组载体，以及利用所述重组载体转化得 到的重组基因工程菌。根据测序结果设计表达引物3 (GTTGTCGACTCACACCTTCCTATGACAGTGCC,下划线部分 为 Sal I 酶切位点)和引物 4 (GTTAAGCTTGTCCAATTTGGCACGGACCGC,下划线部分为 Hind III 酶切位点)，以重组质粒pMD18-T-aldH为模板，通过PCR扩增得到了用于表达的醛脱氢酶基 因。本发明将醛脱氢酶基因同表达载体pET28b连接，构建了含有醛脱氢酶基因的表达重组 质粒pET28b-aldH。将表达重组质粒pET28b-aldH转化至大肠杆菌BL21菌株中，获得含有 表达重组质粒pET28b-aldH的重组大肠杆菌BL21/pET28b-aldH，以重组菌为酶源，进行生 物催化与转化。本发明还涉及所述的醛脱氢酶基因在制备重组醛脱氢酶中的应用。具体的，所述的应用为构建含有所述醛脱氢酶基因的重组载体，将所述重组载体 转化至大肠杆菌中，获得的重组基因工程菌进行诱导培养，培养液分离得到含有重组醛脱 氢酶的菌体细胞。
所述重组醛脱氢酶作为转化用酶，可分别以乙醛、丙醛或3-羟基丙醛为底物，进 行转化反应制备相应的乙酸、丙酸或3-羟基丙酸。本发明的有益效果本发明提供了一种来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株中的醛 脱氢酶基因核苷酸序列；并将该基因与表达载体连接构建的到含该基因的表达重组质粒 pET28b-aldH,再转化至大肠杆菌BL21中，获得含有表达重组质粒pET28b-aldH的重组大肠 杆菌BL21/pET28b-aldH。可应用本发明构建的重组大肠杆菌为酶源进行生物催化与转化， 将乙醛、丙醛或3-羟基丙醛转化为相应的乙酸、丙酸或3-羟基丙酸。
图1为克隆载体pMD18-T_aldH物理图谱；图2为pET28b_aldH重组质粒物理图谱；图3为酸脱氢酶基因PCR扩增argrose电泳图；1 :DL2000DNAMarker ；2 5 利 用引物1和引物2扩增得到的醛脱氢酶基因片段；图4阳性重组质粒pET28b-aldH的酶 切结构图；1 :DL2000DNA Marker ；2 醛脱氢酶基因片段；3 :pET28b_aldH/Sal I 样品；4 pET28b-aldH/HindIII 样品；5 :pET28b_aldH/Sal I and Hind III 样品；6 λ DNA/HindIII DNAMarker0图5为醛脱氢酶酶SDS-PAGE图；1 蛋白分子量Marker ;2 :E. coli BL21;3:未 诱导的 E.coli BL21/pET28b-aldH ；4 0. ImM IPTG 诱导的 E. coli BL21/pET28b_aldH ； 5 0. 5mM IPTG 诱导的 E. coli BL21/pET28b_aldH ；6 =ImM IPTG 诱导的 E. coli BL21/ pET28b-aldH。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此实施例1 用核酸快速提取仪提取酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)菌株(中国普 通微生物保藏管理中心(北京)，编号2. 1543)的总基因组DNA，以该基因组DNA为模板， 在引物 1 (ATGTCACACCTTCCTATGACAGTGCC)、引物 2(GTCCAATTTGGCACGGACCGC)的作用下进行 PCR扩增。PCR反应体系各组分加入量(总体积50 μ L) =IOXPfu DNAPolymerase Buffer 5μ L, IOmM dNTP mixture 1 μ L (20mM)，克隆引物 1、引物 2 各 1 μ L (50 μ Μ)，基因组 DNA 1 μ L，Pfu DNAPolymerase 1 μ L，无核酸水 40 μ L。采用 Biorad 的 PCR 仪，PCR 反应条件为 预变性94°C 5min,然后进入温度循环94°C 30s, 55°C 1. 5min, 72°C 2min,共35个循环，最后 72°C延伸lOmin，终止温度为8°C。取5 μ L用0. 9%琼脂糖凝胶电泳检测。切胶回收该片段 并纯化，利用Taq DNA聚合酶向片段5，端引入碱基Α。在T4DNA连接酶作用下将该片段同 T载体进行连接，得到克隆重组质粒pMD18-T-aldH见图1。将该重组质粒电转化至大肠杆 菌JM109中，利用篮白斑筛选系统进行筛选，随机挑取白色克隆测序，利用软件分析测序结 果，结果表明利用引物1、引物2扩增得到得片段含有一个开放阅读框，长度为1488bp。实施例2 根据实施例1分析结果设计表达引物3和引物4，并分别在引物3和引物4中引入了 Sal I 和 Hind III 限制性酶切位点。在引物 3 (GTTGTCGACTCACACCTTCCTATGACAGTGCC ，下划线部分为Sal I酶切位点)和引物4 (GTTAAGCTTGTCCAATTTGGCACGGACCGC,下划线部 分为Hind III酶切位点)的引发下，利用高保真Pyrobest DNA聚合酶进行扩增，获得长为 1488bp的醛脱氢酶基因片段(SEQ ID NO 1)，测序后利用Sal I和Hind III限制性内切酶 对扩增片段进行处理，并利用T4DNA连接酶将该片段同用相同的限制性内切酶处理的表达 载体pET28b进行连接，构建表达载体pET28b-aldH。将构建的表达载体pET28b-aldH电转 化至大肠杆菌BL21中，涂平板37°C下培养过夜，随机挑取克隆抽提质粒进行酶切鉴定，鉴 定结果见图4。实施例3:将实施例2验证后的含有表达重组质粒pET28b-aldH的重组大肠杆菌BL21/ pET28b-aldH用含有50 μ g/ml卡那霉素抗性的LB液体培养基培养12h，再以接种量接 种到新鲜的含有50 μ g/ml卡那霉素抗性的LB液体培养基中，培养至菌体浓度0D_约0. 6 左右，再向LB液体培养基加入终浓度为0. 5mM的IPTG，诱导培养8h后，4°C、9000rpm离心 8min,收集含有重组醛脱氢酶的菌体细胞。实施例4 以实施例3中获得的含有表达重组质粒pET28b-aldH的重组大肠杆菌BL21/ pET28b-aldH湿菌体超声破碎后(350W，破碎2s，间隔2s，共80次)作为转化用酶，以乙醛 为底物，进行转化反应制备乙酸。转化体系及转化操作如下在50ml转化瓶中加入超声破 碎后的菌体和底物浓度为1 %的IOml反应液，30°C下，150r/min转化lOmin，离心去除菌体， 上清液中即含有乙酸。在340nm处测定醛脱氢酶催化乙醛生成乙酸所用的酶量，酶活定义30°C、每分钟 A340处吸光度值增加0. OOl为1个活力单位(U)。表1 以重组大肠杆菌BL21/pET28b-aldH为酶源测定的醛脱氢酶酶活力测定结果
菌林/质粒酶活(U/mg)
^JpfWBL21O 由上述实验结果可知，将本发明醛脱氢酶基因转化大肠杆菌得到重组大肠杆菌具 有较强产醛脱氢酶能力，可直接以含酶的菌体细胞为酶源进行生物催化或转化反应。醛脱 氢酶酶作为转化用酶，可以分别以乙醛、丙醛或3-羟基丙醛等为底物，进行转化反应制备 相应的乙酸、丙酸或3-羟基丙酸等。
权利要求
一种来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的醛脱氢酶基因，具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
2.如权利要求1所述的醛脱氢酶基因，其特征在于所述醛脱氢酶基因编码SEQID NO 2所示的氨基酸序列。
3.一种含有权利要求1所述醛脱氢酶基因的重组载体。
4.一种用权利要求4所述重组载体转化得到的重组基因工程菌。
5.如权利要求1所述的醛脱氢酶基因在制备重组醛脱氢酶中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述的应用为构建含有所述醛脱氢酶基因 的重组载体，将所述重组载体转化至大肠杆菌中，获得的重组基因工程菌进行诱导培养，培 养液分离得到含有重组醛脱氢酶的菌体细胞。
7.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述重组醛脱氢酶作为转化用酶，分别以乙 醛、丙醛或3-羟基丙醛为底物，进行转化反应制备相应的乙酸、丙酸或3-羟基丙酸。
全文摘要
本发明提供了一种来源于酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)菌株中的醛脱氢酶基因及其重组表达载体、基因工程菌，及其在制备重组醛脱氢酶中的应用。本发明提供了一种来源于酿酒酵母菌株中的醛脱氢酶基因核苷酸序列；并将该基因与表达载体连接构建的到含该基因的表达重组质粒pET28b-aldH，再转化至大肠杆菌BL21中，获得含有表达重组质粒pET28b-aldH的重组大肠杆菌BL21/pET28b-aldH。可应用本发明构建的重组大肠杆菌为酶源进行生物催化与转化，将乙醛、丙醛或3-羟基丙醛转化为相应的乙酸、丙酸或3-羟基丙酸。
文档编号C12N15/63GK101921785SQ20101021757
公开日2010年12月22日 申请日期2010年7月5日 优先权日2010年7月5日
发明者平立英, 柳志强, 沈寅初, 郑裕国 申请人:浙江工业大学