专利名称：用环介导恒温扩增技术检测柯萨奇病毒a16型的引物组及检测体系的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用环介导恒温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)检测肠道病毒的引物组、检测体系、检测方法及用途。
背景技术：
柯萨奇病毒(Coxsackievirus，CV)属于小核糖核酸(RibonucleicAcid, RNA)病 毒科(Picornaviridae)，肠道病毒属(Enterovirus)，是多种人类疾病的致病病原，致病谱 广，可引起呼吸道感染、结膜炎、心肌炎、心肌病及神经系统的疾病，偶尔引起新生儿死亡。 1948年Dolldorf和Sickles在纽约市柯萨奇镇一次脊髓灰质炎病毒(Poliovirus，PV)流 行期间，通过接种乳鼠首次分离出CV。迄今为止，共有30个血清型，分成A、B两组；其中， CVA 组 16 型(CV Group A 16Strain, CVA16)是引起儿童手足口病(Hand，Foot，and Mouth Disease, HFMD)的主要病原之一。肠道病毒的传统检测方法为先将病毒分离培养，然后进 行血清中和试验定型分类，此法繁琐、耗时、费力，虽然多数培养结果可在1周内得到，但中 和试验却十分费时、昂贵，甚至有时无法定型。PCR方法具有快速、敏感性强、特异性高等诸 多优点，已应用于肠道病毒的检测，但由于需要昂贵的仪器设备和较高检测费用，以及对检 测人员较高的技术要求，因而使其不适用于现场快速检测及和基层普及应用。LAMP技术是由Notomi等于2000年发明的一种新型核酸扩增技术，该技术缩短了 核酸扩增时间，提高了扩增效率，并且具有更高的灵敏度、特异性，降低了仪器设备及检测 条件的要求，被公认为具有较强实用性的分子检测技术。目前，LAMP技术已经成功应用于 多种病毒的检测，如SARS冠状病毒、登革热病毒、埃博拉病毒、丙型肝炎病毒等，但尚未见 该方法在柯萨奇病毒A16型检测方面的应用。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供了一种用环介导恒温扩增技术检测 柯萨奇病毒A16型的引物组；本发明的第二个目的是提供一种用环介导恒温扩增技术检测柯萨奇病毒A16型 的检测体系。本发明的第三个目的是提供一种用环介导恒温扩增技术检测柯萨奇病毒A16型 的方法。本发明的第四个目的是提供一种用环介导恒温扩增技术检测柯萨奇病毒A16型 的检测体系的用途。本发明的技术方案概述如下用环介导恒温扩增技术检测柯萨奇病毒A16型的引物组，它由序列表中SEQ ID NO. 1所示核苷酸序列、SEQ ID N0. 2所示核苷酸序列、SEQ ID N0. 3所示核苷酸序列和SEQ IDN0. 4所示核苷酸序列组成。
用环介导恒温扩增技术检测柯萨奇病毒A16型的检测体系，该体系由下述原料组 成IOX 的 ThermoPol 缓冲液 1. 25 μ L ；25mmol/L 的 Mg2+ 0. 5 μ L-1 μ L ；5mol/L 的 Betaine 0. 5 μ L-2 μ L ；10mmol/L 的 dNTP 1 μ L—2 μ L ；10 μ mol/L的序列表中SEQ ID NO. 1所示核苷酸序列0. 25 μ L ；10 μ mol/L的序列表中SEQ ID NO. 2所示核苷酸序列0. 25 μ L ；100 μ mol/L的序列表中SEQ ID N0. 3所示核苷酸序列0. 2 μ L ；100 μ mol/L的序列表中SEQ ID N0. 4所示核苷酸序列0. 2 μ L ；8U/y L 的 Bst 酶 0. 5μ L ；加超纯水至总体积为11 μ L。用环介导恒温扩增技术检测柯萨奇病毒Α16型的方法，它包括下述步骤(1)提取待检测样品中的病毒RNA并逆转录为cDNA ；⑵取1. 5 μ L所述cDNA加入 到11 μ L的用环介导恒温扩增技术检测柯萨奇病毒Α16型的检测体系中，10000转/分钟， 离心30秒；(3)加入20 μ L矿物油，于63°C恒温中进行环介导恒温扩增技术扩增1-1. 5小 时；(4)取出反应管，加入SYBR Green I型核酸染料，若反应液变成绿色，则说明待测样品 中存在柯萨奇病毒A16型，若为桔黄色，则说明待测样品中不存在柯萨奇病毒A16型，所述 用环介导恒温扩增技术检测柯萨奇病毒A16型的检测体系由下述原料组成10 X 的 ThermoPol 缓冲液 1. 25 μ L ；25mmol/L 的 Mg2+ 0. 5 μ L—1 μ L ；5mol/L 的 Betaine 0. 5 μ L-2 μ L ；10mmol/L 的 dNTP 1 μ L_2 μ L ；10 μ mol/L的序列表中SEQ ID NO. 1所示核苷酸序列0. 25 μ L ；10 μ mol/L的序列表中SEQ ID N0. 2所示核苷酸序列0. 25 μ L ；100 μ mol/L的序列表中SEQ ID N0. 3所示核苷酸序列0. 2 μ L ；100 μ mol/L的序列表中SEQ ID N0. 4所示核苷酸序列0. 2 μ L ；8U/y L 的 Bst 酶 0. 5μ L ；加超纯水至总体积为11 μ L。用环介导恒温扩增技术检测柯萨奇病毒Α16型的检测体系的用途。本发明具有下列优点1)高特异性4条引物对靶序列6个特异区域的识别保证了 LAMP扩增的高度特异 性，见图1。2)高灵敏度LAMP灵敏度比聚合酶链式反应(PCR)更高，其所需扩增模板可达IO1 拷贝/反应，见图2。3)鉴定简便扩增结果通过肉眼观测，向反应液中加入SYBR Green I荧光染料 时，若反应液呈绿色，则为阳性；若反应液呈桔黄色，则为阴性反应，见图3。4)操作简单将待测样品和检测试剂混合后，只需放入63°C恒温加热仪器中进行 LAMP反应即可。
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5)快速、高效整个扩增反应只需1-1. 5小时即可完成。本发明的检测体系可以在等温条件下，快速、方便、高效、高特异、高灵敏地检测到 柯萨奇病毒A16型，不需要复杂仪器，为柯萨奇病毒A16型检测提供了新的技术平台，易于 大范围推广应用，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。
图1 柯萨奇病毒A16型LAMP检测体系的特异性。图2 :LAMP(A)、PCR(B)检测柯萨奇病毒A16型的灵敏度比较。图3 本发明检测体系SYBR Green I型荧光检测法检测结果图。
具体实施例方式实施例1 特异性基因组序列查找和LAMP引物设计从GenBank中检索获得柯萨奇病毒A16型基因组序列，通过BLAST软件进行同源 性分析，找到柯萨奇病毒A16型的特异性的保守靶序列，该保守靶序列的DNA序列为GGCGGAAATGCGAGTTGTTTACCTACATGCGCTTTGATGCTGAATTCACATTTGTCGTAGCCAAACCCA ATGGTGAGCTAGTCCCCCAATTACTGCAGTACATGTATGTCCCACCAGGGGCTCCGAAACCTACTTCCAGAGATTCG TTTGCTTGGCAGACTGCCACCAACCCATCTGTGTTTGTGAAAATGACGGACCCALAMP引物设计通过专门的 LAMP 弓I 物软件 Primer design V3 (http //primerexplorer. ip/ elamp3. 0. 0/index. html)设计引物，设计的具体LAMP引物(用环介导恒温扩增技术检测柯 萨奇病毒A16型的引物)为序列名称类型长)
SEQIDΝ0.1F3正向外引物19
SEQIDNO.2B3反向外引物20
SEQIDNO.3FIP正向内引物42
SEQIDNO.4BIP反向内引物40实施例2 检测体系的建立通过设置不同终浓度的Mg2+(2. 5mmol/L,3mmol/L,3. 5mmol/L,4mmol/L,4. 5mmol/ L, 5mmol/L)、dNTP(0. 8mmol/L>lmmol/L、1. 2mmol/L>1. 4mmol/L、1. 6mmol/L>1. 8mmol/L)、 Betaine(0. 2mol/L、0. 4mol/L、0. 6mol/L、0. 8mol/L、lmol/L、l. 2mol/L)和温度(60 °C、 61°C、62°C、63°C、64°C、65°C )，优化得到最佳反应参数，从而建立柯萨奇病毒A16型LAMP检 测体系。优化的检测体系(IlyL)之一种如下10 X 的 ThermoPol 缓冲液 1. 25 μ L ；25mmol/L 的 Mg2+ 0. 75 μ L ；5mol/L 的 Betaine 1. 5 μ L ；IOmmol/L 的 dNTP 1. 5 μ L ；10 μ mol/L的序列表中SEQ ID NO. 1所示核苷酸序列0. 25 μ L ；10 μ mol/L的序列表中SEQ ID N0. 2所示核苷酸序列0. 25 μ L ；100 μ mol/L的序列表中SEQ ID N0. 3所示核苷酸序列0. 2 μ L ；
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100 μ mol/L的序列表中SEQ ID NO. 4所示核苷酸序列0. 2 μ L ；8U/ μ L 的 Bst 酶 0. 5 μ L ；加超纯水至总体积为11 μ L。检测反应条件63°C恒温1小时。注Mg2+终浓度=(母液浓度25mmol/LX0. 75 μ L+ThermoPol 缓冲液中含 20mmol/ LXl. 25μ L)/12. 5μ L实施例3 用环介导恒温扩增技术检测柯萨奇病毒A16型的检测体系，该体系由下 述原料组成10 X 的 ThermoPol 缓冲液 1. 25 μ L ；25mmol/L 的 Mg2+ 0. 75 μ L ；5mol/L 的 Betaine 1. 5 μ L ；IOmmol/L 的 dNTP 1. 5 μ L ；10 μ mol/L的序列表中SEQ ID NO. 1所示核苷酸序列0. 25 μ L ；10 μ mol/L的序列表中SEQ ID N0. 2所示核苷酸序列0. 25 μ L ；100 μ mol/L的序列表中SEQ ID N0. 3所示核苷酸序列0. 2 μ L ；100 μ mol/L的序列表中SEQ ID N0. 4所示核苷酸序列0. 2 μ L ；8U/ μ L 的 Bst 酶 0. 5 μ L ；加超纯水至总体积为11 μ L。检测反应条件63°C恒温1小时。实施例4:用环介导恒温扩增技术检测柯萨奇病毒A16型的检测体系，该体系由下 述原料组成10X 的 ThermoPol 缓冲液 1. 25 μ L ；25mmol/L 的 Mg2+ 0. 5 μ L ；5mol/L 的 Betaine 0. 5 μ L ；IOmmol/L 的 dNTP 1 μ L ；10 μ mol/L的序列表中SEQ ID NO. 1所示核苷酸序列0. 25 μ L ；10 μ mol/L的序列表中SEQ ID N0. 2所示核苷酸序列0. 25 μ L ；100 μ mol/L的序列表中SEQ ID N0. 3所示核苷酸序列0. 2 μ L ；100 μ mol/L的序列表中SEQ ID N0. 4所示核苷酸序列0. 2 μ L ；8U/ μ L 的 Bst 酶 0. 5 μ L ；加超纯水至总体积为11 μ L。实施例5 用环介导恒温扩增技术检测柯萨奇病毒Α16型的检测体系，该体系由下 述原料组成10 X 的 ThermoPol 缓冲液 1. 25 μ L ；25mmol/L 的 Mg2+ 1 μ L ；5mol/L 的 Betaine 2 μ L ；IOmmol/L 的 dNTP 2 μ L ；10 μ mol/L的序列表中SEQ ID NO. 1所示核苷酸序列0. 25 μ L ；10 μ mol/L的序列表中SEQ ID N0. 2所示核苷酸序列0. 25 μ L ；
100 μ mol/L的序列表中SEQ ID NO. 3所示核苷酸序列0. 2 μ L ；100 μ mol/L的序列表中SEQ ID NO. 4所示核苷酸序列0. 2 μ L ；8U/y L 的 Bst 酶 0. 5μ L ；加超纯水至总体积为11 μ L。实施例2-5中，体系为11 μ L，还可以同等倍数扩大或缩小该体系，各组分加入量 也随扩大倍数或缩小倍数同比例扩大或缩小。实施例6 用环介导恒温扩增技术检测柯萨奇病毒Α16型的检测体系的特异性分 析
以肠道病毒71型、柯萨奇Β3、柯萨奇Β5、埃可30、脊髓灰质炎病毒及甲型肝炎病毒 核酸为模板检测体系的特异性。 (1)反应体系(IlyL)配制
6种病 Bst酶
超
纯
100 μmol/L)
L) 0. 5
μ L
水
ThermoPol
缓冲液 (8U/y
(10Χ)
Mg:
2+
Betaine
dNTP
F3/B3
FIP/BIP
(25mmo
(5mol/L) (10m (各 10 μ mol/L)(各
1/L)
mol/L)
1. 25μ L
0.75 μ L 1. 5μ L 1. 5μ L # 0. 25 μ L # 0. 2μ L
μ L
(2) LAMP 扩增 首先配置出IiyL
种用于检测柯萨奇病毒A16型的LAMP检测体系，取1. 5 μ L 制备好的待检测核酸(已预先逆转录为cDNA)加到上述已配制好的用环介导恒温扩增技术 检测柯萨奇病毒A16型的检测体系中，使最终反应体积为12. 5 μ L，10000转/分钟，瞬时离 心30秒，混勻反应液后，加入20 μ L矿物油，放于63°C恒温进行环介导恒温扩增技术扩增1 小时。结果见图1。图1中的各个泳道分别是M DNA Marker;1 肠道病毒柯萨奇A16 ；2-7 分别为肠道病毒71型、柯萨奇B3、柯萨奇B5、埃可30、脊髓灰质炎病毒减毒 株和甲型肝炎病毒减毒株。上述结果表明，柯萨奇病毒A16型LAMP检测法只能扩增柯萨奇病毒A16型而不能 检测到其他非目标病毒核酸，故所建立的LAMP检测方法具有良好的检测特异性。实施例7 用环介导恒温扩增技术检测柯萨奇病毒A16型的检测体系的灵敏度分 析以107_10°拷贝/ μ L的含有柯萨奇病毒Α16型序列的标准质粒为模版，分别进行 LAMP和PCR，比较两种检测方法的灵敏度。结果见图2。
图2㈧是LAMP检测结果，图2⑶是PCR检测结果，两图中的各个泳道分别是M DNA Marker;1-8 分别以107_10°拷贝/μ L的标准质粒为模版；9:阴性对照。以上结果表明，用LAMP体系检测柯萨奇病毒A16型的效果很好，其灵敏度比普通 PCR法高100倍。实施例8 用环介导恒温扩增技术检测柯萨奇病毒A16型的检测体系的SYBR Green I型荧光检测LAMP检测体系和检测过程同实施例7，反应结束后向反应管中加入4. 5 μ L SYBRGreen I型核酸染料，反应液变成绿色，则说明反应成阳性。若为桔黄色，则反应为阴 性，结果见图3。
图3 (A):肉眼观察。图3(B)紫外灯下观察。其中各个泳道分别是M :DNA Marker ；1-8 分别以107_10°拷贝/μ L的标准质粒为模板；9:阴性对照。实施例9 取自实际环境水体样品的用环介导恒温扩增技术检测柯萨奇病毒Α16 型的检测体系检测采集天津地区某处地表水水样1L，浓缩10000倍，抽提浓缩水样的总RNA，随机引 物逆转录为cDNA作为模版备用。检测体系如下。IOX 的 ThermoPol 缓冲液 1. 25 μ L ；25mmol/L 的 Mg2+ 0. 75 μ L ；5mol/L 的 Betaine 1. 5 μ L ；IOmmol/L 的 dNTP 1. 5 μ L ；lOymol/L 的引物 F3 0. 25yL;lOymol/L 的引物 B3 0. 25yL;ΙΟΟμπιοΙ/L 的引物 FIP 0. 2yL;ΙΟΟμπιοΙ/L 的引物 BIP 0. 2yL;8U/y L 的 Bst 酶 0· 5μ L ；加超纯水至总体积为11 μ L。取1. 5 μ L上述eDNA加入到IlyL的用环介导恒温扩增技术检测柯萨奇病毒A16 型的检测体系中，10000转/分钟，离心30秒，加入20 μ L矿物油，于63°C恒温中进行LAMP 扩增1. 5小时，取出反应管，加入5μ L SYBR Green I型核酸染料，反应液变成绿色，说明所 测水样中存在柯萨奇病毒A16型。采用实施例4-5的用环介导恒温扩增技术检测柯萨奇病毒A16型的检测体系对实 施例9同样的实际环境水体样品进行检测，检测步骤也同实施例9，各检测体系的结果也分 别使反应液变成绿色，说明实施例4-5的用环介导恒温扩增技术检测柯萨奇病毒A16型的 检测体系可用于检测柯萨奇病毒A16型。
权利要求
用环介导恒温扩增技术检测柯萨奇病毒A16型的引物组，其特征是它由序列表中SEQID NO.1所示核苷酸序列、SEQ ID NO.2所示核苷酸序列、SEQ ID NO.3所示核苷酸序列和SEQ ID NO.4所示核苷酸序列组成。
2.用环介导恒温扩增技术检测柯萨奇病毒A16型的检测体系，其特征是该体系由下述 原料组成IOX 的 ThermoPol 缓冲液 1. 25 μ L ； 25mmol/L 的 Mg2+ 0. 5 μ L-I μ L ； 5mol/L 的 Betaine 0. 5 μ L-2 μ L ； 10mmol/L 的 dNTP 1 μ L_2 μ L ；10 μ mol/L的序列表中SEQ ID NO. 1所示核苷酸序列0. 25 μ L ； 10 μ mol/L的序列表中SEQ ID NO. 2所示核苷酸序列0. 25 μ L ； 100 μ mol/L的序列表中SEQ ID N0. 3所示核苷酸序列0. 2 μ L ； 100 μ mol/L的序列表中SEQ ID N0. 4所示核苷酸序列0. 2 μ L ； 8U/ μ L 的 Bst 酶 0. 5 μ L ； 加超纯水至总体积为11 μ L。
3.用环介导恒温扩增技术检测柯萨奇病毒Α16型的方法，其特征是它包括下述步骤 (1)提取待检测样品中的病毒RNA并逆转录为cDNA ； (2)取1. 5 μ L所述cDNA加入到IlyL的用环介导恒温扩增技术检测柯萨奇病毒A16型的检测体系中，10000转/分钟，离 心30秒；(3)加入20 μ L矿物油，于63°C恒温中进行环介导恒温扩增技术扩增1-1. 5小时； (4)取出反应管，加入SYBR Green I型核酸染料，若反应液变成绿色，则说明待测样品中存 在柯萨奇病毒A16型，若为桔黄色，则说明待测样品中不存在柯萨奇病毒A16型，所述用环 介导恒温扩增技术检测柯萨奇病毒A16型的检测体系由下述原料组成 10X 的 ThermoPol 缓冲液 1. 25 μ L ； 25mmol/L 的 Mg2+ 0. 5 μ L-I μ L ； 5mol/L 的 Betaine 0. 5 μ L-2 μ L ； 10mmol/L 的 dNTP 1 μ L_2 μ L ；10 μ mol/L的序列表中SEQ ID NO. 1所示核苷酸序列0. 25 μ L ； 10 μ mol/L的序列表中SEQ ID N0. 2所示核苷酸序列0. 25 μ L ； 100 μ mol/L的序列表中SEQ ID N0. 3所示核苷酸序列0. 2 μ L ； 100 μ mol/L的序列表中SEQ ID N0. 4所示核苷酸序列0. 2 μ L ； 8U/ μ L的Bst酶0. 5 μ L ；加超纯水至总体积为11 μ L。
4.用环介导恒温扩增技术检测柯萨奇病毒Α16型的检测体系的用途。
全文摘要
本发明公开了用环介导恒温扩增技术检测柯萨奇病毒A16型的引物组及检测体系，用环介导恒温扩增技术检测柯萨奇病毒A16型的引物组由序列表中SEQ ID NO.1所示核苷酸序列、SEQ ID NO.2所示核苷酸序列、SEQ ID NO.3所示核苷酸序列和SEQ ID NO.4所示核苷酸序列组成。本发明的检测体系可以在等温条件下，快速、方便、高效、高特异、高灵敏地检测到柯萨奇病毒A16型，不需要复杂仪器，为柯萨奇病毒A16型检测提供了新的技术平台。
文档编号C12N15/11GK101892322SQ201010217270
公开日2010年11月24日 申请日期2010年7月5日 优先权日2010年7月5日
发明者孟斌, 尹光雅, 张国辉, 李国良, 王俊虹, 王毅铮, 赵化冰, 赵国平, 赵宏, 高宏生, 黄爱华 申请人:中国人民武装警察部队医学院