专利名称：高血压易感基因AGTR1单核苷酸多态性位点rs388915的检测方法及检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学和医学领域。更具体地，涉及人血管紧张素II-I型受体基 因(AGTRl)的(single nucleotide polymorphism, SNP)位点 rs388915 及其与原发性高血 压相关性的检测。本发明还涉及检测这个SNP位点的方法和试剂盒。
背景技术：
原发性高血压(essential hypertension, EH)是一种多因素、多基因疾病，由环 境与遗传因素共同致病的常见而多发的心血管病症，对人类健康造成了极大的影响。随着 分子医学的发展，目前已经发现的高血压相关基因已经有150余种，但是EH的发病机制仍 然不完全清楚，高血压的早期诊断和预防问题仍然未能完全解决。EH是遗传因子和环境共 同作用的结果，血压的变化30%-60%归因子遗传。由于环境因素是可以控制和确认的，而 对高血压遗传学因素却是固定不变的。因此，对可变因素的控制，如对高血压危险因素的 预防，可以在一定程度上延缓和防止高血压的发病，但是对固定不变的遗传因素的认识不 足却在一定程度上严重影响着对高血压发病、诊断和治疗。因此对高血压遗传学的研究十 分必要(王佐广，温绍君，吴兆苏.高血压、易感基因与单核苷酸多态性[J].高血压杂志， 2001,9 259-264)。近二十余年来，有关高血压治疗的研究更多地集中在对血压的控制和对靶器官的 保护，并已取得突飞猛进的发展。但是，这些手段并不能从根本上控制血压，目前对人类内 源性抗高血压基因的研究还很少，因此，研究内源性抗高血压机制是今后高血压防治研究 的主要方向之一，具有重要的研究价值和应用前景，如果通过调节内源性抗高血压机制治 疗高血压病，将会促进我国生物医疗技术的发展，并为我国每年节省巨大的医疗费用。人血管紧张素II-I型受体是肾素-血管紧张素-醛固酮系统 (Renin-angiotensin-aldosterone system, RASS)的重要组成部分，参与调节血管收缩、水 钠平衡，参与血压控制与调节的各个方面。人体内血管紧张素II和血管紧张素II的1型受 体结合后，可以激活一系列的信号传导通路，最终导致血管收缩、炎症和细胞增殖等生理反 应。因此，编码血管紧张素II-I型受体的人血管紧张素II-I型受体基因(AGTRl)的单核苷 酸多态性改变，可能与人类EH密切相关。AGTRl位于3q21_25，基因全长约60kb，主要分布 在质膜，发挥受体活性，参与G蛋白信号转导，与三磷酸肌醇偶联提高胞浆钙离子浓度等产 生一系列生物学效应。它在人的许多器官中均有表达，如心脏、骨骼肌、脑、肺、肝和肾上腺 等，在心血管系统中是最为重要的受体之一。(张静，赵巍，杨泽.血管紧张素II-I型受体基 因与血管相关代谢性疾病关系的研究进展[J].中国心血管杂志，2007，12:311-313.)。目 ItrSW^if^SM/Jn (Shaoyong Sua, Jianhong Chen, Jiangong Zhao, et al. Angiotensin II type I receptor gene andmyocardial infarction tagging SNPs and hapIotype based association study. TheBeijing atherosclerosis study. Pharmacogenetics，2004，14 673-681.)，由rs388915位点参与、联合多个AGTRl位点组成的单倍体型可能与人类心肌梗死发病有关，但尚无rs388915位点与EH相关的报道。由于EH是多种心、脑血管疾病的重 要病因和危险因素(叶任高，陆再英主编，《内科学》2006年第6版，人民卫生出版社.第三 篇第六章)，而通过单一位点rs388915与人类EH发病关系的研究，可能解释其参与的单倍 体型与包括心肌梗死在内的其他心血管疾病发病的真正病因。综上所述，为了最终实现治疗高血压，本领域迫切需要寻求原发性高血压易感基 因，并开发检测原发性高血压易感基因的方法、试剂盒，以及相关的治疗药物。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测(包括早期诊断)高血压易感基因的方法及检测试剂盒。本发明提供了一种高血压易感性基因的检测方法，即检测AGTRl基因rs388915位 点的基因型，rs388915带有G基因型(尤其是GG基因型)的个体高血压的发病风险显著 高于普通人群。所述的rs388915，位于Mfn2的内含子2中(片段重叠群contig :NT_005612. 16位 置54942902A/G)其中，脱氧核糖核酸(DNA)序列编号rs388915位置基于SEQ IDNO 1/6 ； 引物1基于SEQ ID NO 2/6 ；引物2基于SEQ ID NO 3/6 ；探针1基于SEQID NO 4/6 ；探针 2 基于 SEQ ID NO 5/6 ；扩增产物基于 SEQ ID NO :6/6。具体而言，该方法包括步骤(a)抽提样品的基因组DNA，扩增获得AGTRl基因内含 子2 ； (b)检测步骤(a)产物中单核苷酸多态性位点rs388915的基因型。所述的扩增AGTRl基因内含子2的引物序列如SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3所示。所述的检测rs388915的基因型的探针序列如SEQ ID NO 4和SEQ ID NO 5所示。上述方法中涉及的测序、扩增、抽提基因组DNA等技术均可采用本领域的常规操 作方法。本发明提供了一种检测高血压易感基因的试剂盒，它含有与位点rs388915结合 的探针。在本发明的一个实施例中，与位点rs388915结合的探针的序列如SEQ ID NO :4和 SEQ ID NO 5 所示。上述试剂盒还可以包括特异性扩增AGTRl基因内含子2中包含rs388915位点的 区域的引物。在本发明的一个实施例中，与特异性扩增AGTRl基因内含子2中包含rs388915位 点的区域的引物的序列如SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :3所示。本发明经过多年研究，首次证明了 AGTRl基因单核苷酸多态性位点rs388915(位 于AGTRl内含子2中，片段重叠群contig :NT_005612. 16位置54942902A/G)与高血压密切 相关，而且发现了它的新功能AGTR1基因单核苷酸多态性位点rs388915位于AGTR1，内含 子2中(片段重叠群contig :NT_005612. 16位置54942902A/G)基因型的改变将导致高血 压的发病风险升高，其中关联研究结果显示，在AGTRl基因rs388915A — G在病例和对照组 中的分布存在显著性差异(P < 0. 05)，该SNP多态性可改变转录因子结合位点。在此基础 上完成了本发明。本发明提供了一种对个体的高血压易感性进行诊断的方法，它包括步骤检测该个体的AGTRl基因rs388915位点的基因型，以此判断该个体患高血压的发病风险是否高于 普通人群。在一优选例中，所述的差异是选自rs388915的单核苷酸多态性。rs388915位于 Mfn2,内含子2中(片段重叠群contig :NT_005612. 16位置54942902A/G)。其中，脱氧核 糖核酸(DNA)序列编号rs388915位置基于SEQ ID NO :1/6。本发明提供了一种检测样品是否存在AGTRl基因的单核苷酸多态性的方法，包括 步骤(a)用AGTRl基因内含子2特异性引物扩增样品的基因组DNA，得到扩增产物；和(b)检测扩增产物中单核苷酸多态性位点rs388915的基因型。AGTRl 基因 rs388915 位点的详细序列可参见网址 http //www, ncbi. nlm. nih. gov/中登录号为rs388915的核苷酸序列，也可参见SEQ ID NO 1。本发明对AGTRl基因中的内含子2中(片段重叠群contig :NT_005612. 16位置 54942902A/G)区域进行了测序。AGTRl基因rs388915位点的多态性可应用于高血压的个性化治疗。在使用本发明 AGTRl基因rs388915位点的多态性时，还可同时使用其他治疗高血压的药剂。本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效的AGTRl蛋白以及药学上可接 受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、 及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例 如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊 之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊在无 菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天0.1微克/千克体重-约10毫 克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。使用药物组合物时，是将安全有效量的AGTRl或其拮抗剂、激动剂施用于普哺乳 动物，其中该安全有效剂量通常至少约0. 1微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约 10毫克/千克体重，较佳地该剂量是约0. 1微克/千克体重-约100毫克/千克体重。当 然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内。检测AGTRl基因的rs388915的基因型也可用于辅助诊断高血压。检测可以针对 基因组DNA，也可针对AGTRl基因的扩增片段。AGTRl基因的rs388915的基因型分析可用 已有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变，等等。本发明提供了一种检测原发性高血压易感性基因的方法，它包括检测人血管紧张 素II-I型受体基因(AGTRl)的rs388915位点的基因型，rs388915带有G基因型的个体， 高血压的易感性显著高于普通人群。本发明还公开了相应的检测试剂盒，该试剂盒含有扩 增rs388915位点的引物，还可以包括扩增AGTRl基因第2号内含子区域的引物。利用本发 明检测rs388915位点的基因型，方法简单易行，快速高效，成本低廉，为高血压的诊断和治 疗提供了一个简捷的新途径。
图1是一份样本基因组DNA质量的检测结果示意。图2是测序结果截图。显示了 rs388915的一种SNP基因型的测序结果。rs388915位于AGTRl的内含子2中(片段重叠群contig :ΝΤ_005612· 16位置54942902A/G)。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件如 Sambrook 等人，分子克隆；实验室手册(New York Co Id Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1荧光PCR检测一、实验材料7900HT荧光定量PCR仪购自美国ABI公司，聚合酶链反应液(TaqMan EXPressMaster Mix)由美国应用生物系统公司(ABI)定制合成。二、引物及探针设计与合成以AGTRl基因内含子2的部分序列为模板，使用Primer ExpressTM 2. O软件分析 TaqMan引物和探针位点，并由美国应用生物系统公司(ABI)定制合成。检测用引物AGTRl 基因 rs388915 上游引物序列5' -TTTCTTCCACTTCTAGCACCA-3 ‘ (SEQ ID NO 2)AGTRl 基因 Ts3889I5 下游引物序列5' -ATGGATCTGGAGGTGCTATGAG-3‘ (SEQ ID NO 3)荧光探针AGTRl 基因 rs388915 荧光探针 1 :5' -VIC-AATTTGCTCGCAGGGAAA-TAMRA-3 ‘ (SEQ ID N04)AGTRl 基因 rs388915 荧光探针 2:5' -FAM-AATTTGCTCACAGGGAAA-TAMRA-3 ‘ (SEQ ID N05)三、样本检测实验共检测910例高血压病例和496例正常对照人群，每例收集血样标本约2ml， 用酚/氯仿抽屉基因组DNA，抽提结果用微量紫外/可见光分光光度计(INFINIGEN公司) 检测。按如下体系进行荧光PCR扩增，最后用SDS 2. 3扫描并聚类分析 四、检测结果；基因组DNA抽提的检测结果所有样本的基因组DNA符合检测要求(260/280 > 1. 8，浓度> lOng/ul，如图1所 示样本1175号的检测结果)。AGTRl基因rs388915位点基因型的检测结果
挑选上述高血压实施例2用测序法检测原发性高血压易感基因AGTRl的rs388915位点， 病例-对照组样本各10例进行测序判断rs388915的基因型。一、实验方法PCR测序引物仍采用上述荧光PCR用引物，扩增的产物经纯化后直接测序。测序的 仪器是ABI公司的3130x1遗传分析仪，用sequence analysis 5. 2分析软件进行分析，结 果用chromas也可以查看。二、实验结果测序结果截图如图2所示。最终，20例的测序结果与7900荧光PCR的基因型分析结果完全一致。三、AGTRl基因rs388915基因型和高血压易感的关联分析AGTRl基因rs388915在高血压病人和对照中分布的比较采用RxCx2检验.用SPSS
软件进行统计分析，检测结果及SPSS软件分析结果如下表所示 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用傲参考，就如同每一篇文献被单独引 用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲述内容之后，本领域技术人员可以 对本发明做各种改动或修改，这些形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
一种高血压易感性基因的检测方法，其特征在于，检测AGTR1基因rs388915位点的基因型，rs388915带有G基因型的个体高血压的发病风险显著高于普通人群。
2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，rs388915位点位于AGTRl基因内含子 2内。
3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，该方法包括步骤(a)抽提样品的基因组DNA，扩增获得AGTRl基因内含子2中包含rs388915位点的区域；(b)检测步骤(a)产物中单核苷酸多态性位点rs388915的基因型。
4.如权利要求3所述的检测方法，其特征在于，扩增AGTRl基因内含子2中包含 rs388915位点的区域的引物序列如SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3所示。
5.如权利要求3所述的检测方法，其特征在于，检测rs388915的基因型的探针序列如 SEQ ID NO 4 和 SEQ ID NO 5 所示。
6.一种检测高血压易感基因的试剂盒，其特征在于，它含有与位点rs388915结合的探针。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，与位点rs388915结合的探针的序列如SEQ ID NO 4 和 SEQ ID NO 5 所示。
8.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，它还包括特异性扩增AGTRl基因内含子2 中包含rs388915位点的区域的引物。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，特异性扩增AGTRl基因内含子2中包含 rs388915位点的区域的引物的序列如SEQ ID NO 2禾口 SEQ ID N0:3所示。全文摘要
本发明属于分子生物学和医学领域，涉及一种检测高血压易感性基因的方法及其检测试剂盒。本发明提供了一种检测原发性高血压易感性基因的方法，它包括检测人血管紧张素II-1型受体基因(AGTR1)rs388915位点的蒸因型，rs388915带有G基因型的个体，高血压的易感性显著高于普通人群。本发明还公开了相应的检测试剂盒，该试剂盒含有扩增rs388915位点的引物，还可以包括扩增AGTR1基因第2号内含子内包含rs388915位点的区域的引物。利用本发明检测rs388915位点的基因型，方法简单易行，快速高效，成本低廉，为高血压的诊断和治疗提供了一个简捷的新途径。
文档编号C12Q1/68GK101886129SQ20101021754
公开日2010年11月17日 申请日期2010年6月30日 优先权日2010年6月30日
发明者严山, 刘洁琳, 刘阔, 刘雅, 吴海, 孙海霞, 李志忠, 李瑶, 楼煜清, 温绍君, 王佐广, 谢毅, 郭艳红, 顾伟 申请人:首都医科大学附属北京安贞医院;复旦大学