专利名称：携带nk4基因的骨髓间充质干细胞的制备方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及医学发明领域，尤其是涉及一种携带NK4基因的骨髓间充质干细胞的 制备方法及其携带NK4基因的骨髓间充质干细胞在治疗胃癌药物中的应用。
背景技术：
我国胃癌年患病率和死亡率为世界平均水平的2倍多，且多数患者确诊时已处于 进展期。虽然早期胃癌的治疗效果较为乐观，但对进展期胃癌而言，大多有淋巴和血行转 移，相当一部分患者确诊时已失去手术时机，化疗及综合治疗策略虽使其疗效有所改善，但 整体疗效欠佳。因此，有必要探索新的治疗方法。肿瘤基因治疗是目前肿瘤新技术的重要研究热点，基因治疗成功的关键之一在于 有效基因载体的选择。目前常用的肿瘤基因治疗导入载体系统有病毒(腺病毒、逆转录病 毒、慢病毒等)和非病毒(脂质体、裸露DNA等)两种。它们各有优点及不足之处，其共同 的缺点之一就是缺乏靶向性，载体的非特异性分布使肿瘤组织内的药物浓度不高，难以达 到满意疗效。因此，寻找高效具有靶向性的基因治疗载体系统是目前亟待解决的问题。间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)，它是来源于中胚层的具有高度 自我更新能力和多向分化潜能的成体干细胞。早期研究显示MSCs在机体内可主动募集至 炎症或受损部位以修复受损组织，随着研究深入，MSCs在体内可趋向肿瘤病灶处，因此提出 MSCs可作为载体携带治疗药物至肿瘤处。骨髓间充质干细胞(Bone-derived mesenchymal stem cells,BMSCs)具有易获得、易培养、低免疫原性、能在宿主体内长期存活、易于外源基 因转染和长期表达等优点。目前多数MSCs基因治疗的研究是以腺病毒为载体将目的基因 导入，转染率较低。有报道指出这是因为MSCs表面低表达柯萨奇腺病毒受体，使腺病毒为 载体时转染率最高仅20%左右。NK4基因具有阻断HGF/c-met信号通路抑制HGF诱导的肿瘤细胞侵袭转移及抑制 肿瘤血管生成的双重作用。有研究显示NK4基因治疗可明显抑制腹腔种植转移及皮下移植 瘤生长，但上述实验均以腺病毒为载体，是瘤体、腹腔局部给药。而临床上进展期胃癌患者 多已发生局部或远处转移，瘤体局部给药难度大；静脉系统给药病毒将直接暴露于血循环 中，通常被大量粘附在血管内皮细胞和血细胞表面或直接被血液中的抗体中和，再者病毒 侵入非肿瘤组织细胞造成病毒被大量损耗而难以到达肿瘤组织。因此，以病毒为载体的局 部及静脉给药方式的NK4基因治疗可能难以达到预期效果。目前尚未见以慢病毒介导NK4基因转染骨髓间充质干细胞(BMSCs)靶向治疗胃癌 的研究。
发明内容
本发明的第一个目的是建立构建NK4-增强型绿色荧光蛋白(enhancedGreen fluorescent protein, EGFP)融合基因重组慢病毒表达载体的方法，它是从肝细胞生长 因子Ofepatocyte Growth Factor, HGF)质粒中克隆NK4基因后，采用In-Fusion技术，将其定向克隆至慢病毒表达载体质粒中，构建了 NK4-EGFP融合基因重组慢病毒载体质粒 (PGC-FU-NK4)，确定正常表达后，将构建的重组的NK4-EGFP慢病毒表达质粒及pHelperl. 0 载体和pHelper2. 0载体三质粒共转染293T细胞，包装生产NK4过表达慢病毒颗粒 (Lenti-NK4)。它解决了以腺病毒为载体将NK4基因导入间充质干细胞转染率较低的问题。本发明的第二个目的是建立能在体外持续稳定表达NK4基因的骨髓间充质干细 胞，即携带NK4基因的骨髓间充质干细胞的制备方法，它是通过慢病毒介导将NK4基因转染 入骨髓间充质干细胞，并确定NK4表达正常。本发明的第三个目的是携带NK4基因的骨髓间充质干细胞在治疗胃癌药物中的 应用，它是将携带NK4的骨髓间充质干细胞通过尾静脉注射入裸鼠体内，治疗裸鼠胃癌皮 下移植瘤，该方法利用了间充质干细胞对肿瘤的趋向性，因此使提高可NK4基因治疗的靶 向性，治疗效果明显，抑瘤率高，实施方法简单，解决了目前NK4基因治疗靶向性差、仅能局 部注射给药等缺点。本发明的第一个目的是这样实现的1、目的基因的获取1. 1NK4 基因片段 a以 HGFcDNA 为模板，聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增 NK4 基因片段a(521bp)。(1)引物名称及序列NK4-Age I-F GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGTGGGTGA CCA AACTCCNK4-mut-R CGAAGGCAAAAAGCTGTGTTCGTGTGGTATCATGG(2) PCR 反应体系 (3)循环条件反应先94°C预变性30s，加入聚合酶；94°C变性30s、6(TC退火30s、 72°C延伸60s，共30个循环，72°C延伸IOmin。
1. 2NK4 基因片段 b(1)引物名称及序列以HGFcDNA为模板，PCR扩增NK4基因片段b (976bp)。NK4-mut-F :CACAGCTTTTTGCCTTCGAGCTATCGGGGTAAAGACCNK4-Age I-R :TCACCATGGTGGCGACCGGGACTATTGTAGGTGTGGTATC(2) PCR 反应体系 (3)循环条件同前反应先94°C预变性30s，加入聚合酶；94°C变性30s、60°C退火 30s、72°C延伸 60s，共 30 个循环，72°C延伸 IOmin01. 3以a+b为模板PCR扩增NK4基因片段c(1)引物名称及序列NK4-Age I-F :GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGTGGGTGACCAA ACTCCNK4-Age I-R :TCACCATGGTGGCGACCGGGACTATTGTAGGTGTGGTATC(2) PCR 反应体系 (3)循环条件同前反应先94°C预变性30s，加入聚合酶；94°C变性30s、60°C退火 30s、72°C延伸 60s，共 30 个循环，72°C延伸 IOmin02. PCR产物回收取10μ 1 PCR扩增产物于1. 5%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下将PCR产物的琼脂糖凝 胶切下，以胶回收试剂盒回收获得人ΝΚ4 cDNA溶液。3. pGC-FU慢病毒表达载体的酶切限制性内切酶AgeI进行酶切，使其线性化。酶切反应体系 反应条件为37°C，Ih ；酶切产物经过0. 75%琼脂糖凝胶电泳后回收，并溶于50 μ 1 灭菌双蒸水中，准备用于构建重组质粒。4.目的基因重组慢病毒质粒的构建用In-Fusion酶将上述处理过的PCR产物与线性化载体进行交换反应重组质粒。 反应条件为 230C，15min,再 42°C，15min。交换反应体系对照 1酶切回收的载体DNA(100ng/μ 1) 2μ 1回收的 PCR 产物(lOOng/μ 1)-10 X In-Fusio 交换酶缓冲液 2 μ 1In-Fusio 交换酶酶0. 5 μ 1dd H2O补至 20 μ 15.感受态细胞制备采用CaCl2法制备Ε. coliDH5a感受态细胞。(1)从37°C培养16h的新鲜平板中挑取一个单菌落，转到一个含有IOOmlLB培养 基的IL烧瓶中。于37°C剧烈振摇培养3h(旋转摇床，300转/min)；
对照2
2μ 1 2μ 1 0. 5μ 1 补至20 μ 1
连接组 2μ 1 2μ 1 1 μ 1 0. 5μ 1 补至20 μ 1
(2)在无菌条件下将细菌转移到一个无菌用冰预冷的50ml聚丙烯管中，在冰上放 置lOmin，使培养物冷却至0°C ；(3)于 40C，4000 转 /min 离心 IOmin,回收细胞；(4)倒出培养液，将管倒置1分钟，使最后残留的痕量培养液流尽；(5)用IOml预冷的0. lmol/L CaCl2重悬每份沉淀，放置于冰浴上；(6) 40C，4000 转 /min 离心 IOmin,回收细胞；(7)倒出培养液，将管倒置lmin，使最后残留的痕量培养液流尽；(8)每50ml初始培养物用2ml预冷的0. lmol/L CaCl2重悬每份细胞沉淀；(9)将细胞分装成小份，放于_70°C冻存。6.转化(1)用冷却的无菌吸头从每种感受态细胞悬液中各取200 μ 1转移到无菌的微量 离心管中，每管加10μ 1连接液，轻轻旋转以混勻内容物，在冰中放置30min ；(2)将管放到42°C的循环水浴中的试管架上，放置90s，勿摇动试管；(3)快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却l-2min ；(4)每管加800 μ ILB培养基，水浴加温至37°C，然后将管转移到37°C摇床上，温育 45min ；(5)将150 μ 1已转化的感受态细胞转移到含20mmol/L MgSO4和AMP抗性(IOOug/ ml)的LB琼脂培养基上；(6)将平板置于室温直至液体被吸收；(7)倒置平皿，于37°C培养16h ；(8)长出的克隆进行后续PCR鉴定和测序。7.阳性克隆的PCR鉴定及测序(1)质粒DNA的提取用碱裂解法，按质粒小量抽提试剂盒说明书操作；(2)以获取的质粒DNA为模版，进行PCR扩增反应。①引物名称及序列EGFP-N-R CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAGNK4-mut-R :CGAAGGCAAAAAGCTGTGTTCGTGTGGTATCATGG②反应体系阴性对照ddH20及空载体自连对照组；阳性对照GAPDH③循环条件 为反应先94°C预变性30s，加入聚合酶；94°C变性30s、6(TC退火30s、72°C延伸30s，共30 个循环；结束前72°C延伸6min。 (3)接种阳性转化子，37°C培养16小时后保存为甘油菌，分装200 μ 1送测序，以确 保所筛选克隆碱基序列完全正确。8.质粒表达检测pGC-FU-NK4转染293Τ细胞，转染24小时后荧光显微镜下观察荧光表达情况观 察；9.质粒大量抽提以Qiagen公司的质粒抽提试剂盒提取pGC-FU_NK4表达载体、p-Helperl. 0和 p-Helper2. 0的质粒DNA，质粒DNA溶于除菌的TE中，以紫外光吸收法测定其浓度及纯度， 保证所提质粒DNA的A260/A280在1. 8 2. 0之间。10.重组慢病毒包装A、细胞转染(1)转染前24h，用0. 25%胰酶消化对数生长期的293T细胞，以含10% FBS的高 糖DMEM细胞培养基调整细胞密度为1. 2X107细胞ΛΟπιΙ，接种于15cm细胞培养皿，37°C、 5% C02培养箱内培养。待细胞密度达70% 80%转染；(2)转染前2h将细胞培养基更换为无血清培养基；(3)向一灭菌离心管中加入所制备的各DNA溶液(pGC_FU载体20 μ g，pHelper 1. O载体15 μ g，pHelper 2. O载体10 μ g)，与Opti-MEM混合均勻，调整总体积为2. 5ml，在 室温下温育5min ；(4)将 Lipofectamine 2000 试剂轻柔摇勻，取 100 μ 1 Lipofectamine2000 试剂在 另一管中与2. 4ml Opti-MEM混合，在室温下温育5min ；(5)把稀释后的DNA与稀释后的Lipofectamine2000进行混合，轻轻地颠倒混勻， 不要振荡；(6)室温孵育20min，以便形成DNA与Lipofectamine2000稀释液的转染复合物；(7)将DNA与Lipofectamine2000混合液转移至293T细胞的培养液中，混勻， 37°C,5% C02细胞培养箱中培养；(8)培养8h后倒去含有转染混和物的培养基，每瓶细胞加入20ml的PBS液，以洗涤残余的转染混和物，弃去；(9)每瓶细胞中加入含10% FBS的高糖DMEM细胞培养基25ml，于37°C，5% C02 培养箱内继续培养48h。B、病毒的收集与浓缩(1)收集转染后48h的293T细胞上清液；(2) 40C，4000g 离心 lOmin，除去细胞碎片；(3)以0. 45 μ m滤器过滤上清液于40ml超速离心管中；(4)把病毒粗提液样品加入到过滤杯中，盖上盖子；将过滤杯插到滤过液收集管 中；(5)4000g离心10_15min，至需要的病毒浓缩体积；(6)离心结束后，取出离心装置，将过滤杯和下面的滤过液收集杯分开；(7)将过滤杯倒扣在样品收集杯上；(8)转速低于lOOOg，离心2min。把过滤杯从样品收集杯上移开，样品收集杯中的 即为病毒浓缩液；(9)将病毒浓缩液移出，分装后保存在病毒管中，-80°C保存；取其中一支进行病 毒生物学滴度测定。所得病毒为携带NK4-EGFP融合基因的重组慢病毒。本发明的第二个目的是这样实现的将携带NK4-EGFP融合基因的慢病毒(Lenti-NK4)转染BMSCs，通过观察荧光及流 式细胞仪检测转染率确定最佳感染复数(Multiplicity ofinfection,M0I)；采用酶联免疫 口及Pti式KEnzyme linked immunosorbent assay,ELISA) ^Western blot^IlJLenti-NK4 转染BMSCs后NK4表达。具体步骤如下1. Lenti-NK4 转染 BMSCs，确定最佳感染 MOI(1)用0. 125%胰酶+0.02% EDTA消化对数生长期的BMSCs，以含10 % FBS的 L-DMEM培养基调整细胞密度为以8X103/Cm2，种植于96孔细胞培养板中，37°C、5% C02培 养箱内培养；(2) 24h后吸去培养液，磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffered Saline, PBS)洗涤细 胞一次，按肌1值为0、1、10、20、50、100加入相应体积的重组慢病毒颗粒(Lenti_NK4)，同时 补充5 μ g/ml的Polybrane及完全培养基至总量为500 μ 1 ；(3)置37°C、5% C02培养箱内培养IOh后，换为正常培养基继续培养，病毒感染 24 120小时及传代后用激光共聚焦显微镜观察GFP表达；感染72h时分别收集各MOI值 的BMSCs的培养上清液，离心后-80°C保存，ELISA法检测培养液中NK4含量。收集细胞 Western blot检测NK4蛋白表达。2.流式细胞仪检测转染率(1)转染 Lenti-NK4 的 BMSCs 长满约 85%时，0. 125%胰酶+0. 02% EDTA 消化，显 微镜下控制消化时间；(2)弃去消化液，以10 % FBS的L-DMEM培养基终止消化，轻轻吹打培养瓶；(3)液体移至离心管，lOOOrpm，离心5min ；(4)弃去培养基，加入PBS重悬细胞沉淀，调整细胞密度为IXlOfVml ；(5)用同时培养的未转染Lenti-NK4的BMSCs设为阴性对照，上机检测转染率。
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采用最佳MOI的Lenti-NK4转入骨髓间充质干细胞，从而获得了能在体外持续、稳 定表达NK4基因的骨髓间充质干细胞。本发明的第三个目的是这样实现的1.慢病毒转染BMSCs(1)用0. 125%胰酶+0.02% EDTA消化对数生长期的BMSCs，以含10 % FBS的 L-DMEM培养基调整细胞密度为以8 X 107cm2，种植于细胞培养板中，37°C,5% C02培养箱内
培养；(2) 24h后吸去培养液，PBS洗涤细胞一次，按MOI为50加入相应体积的Lenti-NK4 同时补充5 μ g/ml的Polybrane及完全培养基；同时设置转染Lenti-GFP(MC)I 50)为阴性 对照，未转染BMSCs做为空白对照；(3)置37°C、5% C02培养箱内培养IOh后，换为正常培养基继续培养至细胞长满 80%，收集细胞备用；2. BMSCs-NK4治疗裸鼠胃癌皮下移植瘤(1)取32只BALB/C(nu/nu)裸鼠，雌雄各半，6 8W，体重15 23g，用胃癌皮下 移植瘤瘤组织块接种至裸鼠右侧腋窝中部外侧皮下；(2)当皮下移植瘤长径约1. 5cm时，随机分为4组，分别在分组后0、7、14、21天给 药；具体分组如下治疗A组尾静脉注射BMSCS-NK4，6 X IO5个/只，0. 2ml细胞悬液；治疗B组尾静脉注射Lenti_NK4，3X IO7TU/只，0. 2ml病毒液；对照C组尾静脉注射BMSCs-GFP，6 X IO5个/只，0. 2ml细胞悬液；对照D组尾静脉注射PBS，0. 2ml/只(3)取对数期生长期的 BMSCs-NK4、BMSCs-GFP 经0. 125%胰酶+0. 02% EDTA 消化， PBS重悬细胞沉淀，制备单细胞悬液；每天观察精神状态、活动及饮食、饮水情况；3-4天称重一次，并用游标卡尺测量 皮下移植瘤的长径(a)、与之相垂直的短径(b)及厚度(c)，瘤体体积(mm3) = π abc/6计 算皮下移植瘤体积，绘制肿瘤生长曲线，计算抑瘤率，抑瘤率(％)=(对照组肿瘤体积-实 验组肿瘤体积)/对照组肿瘤体积X 100 %。28天处死裸鼠，取出瘤体称重。结果发现1、构建的NK4-EGFP融合基因的重组慢病毒表达载体转入293T细胞后可正常表 达；重组慢病毒(Lenti-NK4)滴度为2X108TU/ml ；2、Lenti-NK4转染BMSCs后荧光表达随着时间延长及MOI值增加而增强、增多；携 带NK4基因的BMSCs (BMSCs-NK4)NK4表达正常，NK4分泌量随着MOI值增加而增加，同时也 随感染时间延长而增加，最佳MOI值为50 ；MOI为50时，Lenti_NK4转染BMSCs的转染率达 87. 8% ,Lenti-GFP转染BMSCs的转染率为96. 5%。提示携带NK4的慢病毒能安全、有效地 转染BMSCs，转染后NK4基因可持续稳定表达。3、以BMSCs为载体的NK4基因治疗对胃癌治疗效果(1) BMSCs_NK4对皮下 移植瘤治疗结果显示BMSCs-NK4治疗组瘤体体积均明显小于BMSCs-GFP及PBS组(P < 0. 05) ；BMSCs-NK4 治疗组抑瘤率达 52. 2% (2)BMSCs_NK4 组瘤重 1. 94士0. 67g，明显低于 BMSCs-GFP 组及 PBS 组(P < 0. 05) ； (3)BMSCs_NK4 组坏死评分 3. 63 士 0. 47，明显低于两对照组(P < 0. 05)。BMSCs为载体的NK4基因治疗使肿瘤组织坏死增加，抑制胃癌皮下移植 瘤的生长。从以上实验可得知Balb/C裸鼠动物实验证明BMSCs为载体的NK4基因治疗可明 显抑制胃癌皮下移植瘤的生长，抑瘤率高，实施方法简单，解决了目前NK4基因治疗靶向性 差、仅能局部注射给药等缺点，是一种良好的胃癌基因治疗新方法。
具体实施例方式下面结合实施例作进一步详细说明本发明，但应理解本发明的范围并非仅限于这 些实施例的范围。一种制备NK4-增强型绿色荧光蛋白融合基因重组慢病毒表达载体的方法1、目的基因的获取1. 1NK4 基因片段 a以 HGFcDNA 为模板，聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增 NK4 基因片段a(521bp)。(1)引物名称及序列NK4-Age I-F GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGTGGGTGACC AAACTCCNK4-mu t-R CGAAGGCAAAAAGCTGTGTTCGTGTGGTATCATGG(2) PCR 反应体系 (3)循环条件反应先94°C预变性30s，加入聚合酶；94°C变性30s、60°C退火30s、 72°C延伸60s，共30个循环，72°C延伸IOmin。1.2NK4 基因片段 b(1)引物名称及序列以HGFcDNA为模板，PCR扩增NK4基因片段b (976bp)。NK4-mut-F CACAGCTTTTTGCCTTCGAGCTATCGGGGTAAAGACC
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NK4-AgeI-R TCACCATGGTGGCGACCGGGACTATTGTAGGTGTGGTA TC(2) PCR 反应体系 (3)循环条件同前反应先94°C预变性30s，加入聚合酶；94°C变性30s、60°C退火 30s、72°C延伸 60s，共 30 个循环，72°C延伸 IOmin01. 3以a+b为模板PCR扩增NK4基因片段c(1)引物名称及序列NK4-AgeI-F :GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGTGGGTGACCAA ACTCCNK4-AgeI-R :TCACCATGGTGGCGACCGGGACTATTGTAGGTGTGGTATC(2) PCR 反应体系 (3)循环条件同前反应先94°C预变性30s，加入聚合酶；94°C变性30s、60°C退火 30s、72°C延伸 60s，共 30 个循环，72°C延伸 IOmin02. PCR产物回收取10μ 1 PCR扩增产物于1. 5%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下将PCR产物的琼脂糖凝 胶切下，以胶回收试剂盒回收获得人NK4cDNA溶液。3. pGC-FU慢病毒表达载体的酶切限制性内切酶AgeI进行酶切，使其线性化。酶切反应体系 反应条件为37°C，Ih ；酶切产物经过0. 75%琼脂糖凝胶电泳后回收，并溶于50 μ 1 灭菌双蒸水中，准备用于构建重组质粒。4.目的基因重组慢病毒质粒的构建用In-Fusion酶将上述处理过的PCR产物与线性化载体进行交换反应重组质粒。 反应条件为 230C，15min,再 42°C，15min。交换反应体系对照 1酶切回收的载体DNA(100ng/μ 1) 2μ 1回收的PCR 产物(lOOng/μ 1) -10 X In-Fusio 交换酶缓冲液 2 μ 1In-Fusio 交换BIBI0. 5 μ 1ddH20补至 20 μ 15.感受态细胞制备采用CaCl2法制备Ε. coliDH5a感受态细胞。(1)从37°C培养16h的新鲜平板中挑取一个单菌落，转到一个含有IOOmlLB培养 基的IL烧瓶中。于37°C剧烈振摇培养3h(旋转摇床，300转/min)；(2)在无菌条件下将细菌转移到一个无菌用冰预冷的50ml聚丙烯管中，在冰上放 置lOmin，使培养物冷却至0°C ；(3)于 4°C，4000 转/min 离心 lOmin，回收细胞；(4)倒出培养液，将管倒置1分钟，使最后残留的痕量培养液流尽；0183](5)用IOml预冷的0. lmol/L CaCl2重悬每份沉淀，放置于冰浴上；
0184](6)4°C,4000 转 /min 离心 IOmin,回收细胞；
0185](7)倒出培养液，将管倒置lmin，使最后残留的痕量培养液流尽；
0186](8)每50ml初始培养物用2ml预冷的0. lmol/L CaCl2重悬每份细胞沉淀；
0187](9)将细胞分装成小份，放于-70°C冻存。
0188]6.转化
0189](1)用冷却的无菌吸头从每种感受态细胞悬液中各取200 μ 1转移到无菌的微量 离心管中，每管加10μ 1连接液，轻轻旋转以混勻内容物，在冰中放置30min ；
(2)将管放到42°C的循环水浴中的试管架上，放置90s，勿摇动试管；
(3)快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却l-2min；
⑷每管加800 μ ILB培养基，水浴加温至37°C，然后将管转移到37°C摇床上，温育 (5)将150 μ 1已转化的感受态细胞转移到含20mmol/L MgSO4和AMP抗性(IOOug/
0190]
0191]
0192]
45min
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ml)的LB琼脂培养基上；
0194](6)将平板置于室温直至液体被吸收；
0195](7)倒置平皿，于37°C培养16h ；
0196](8)长出的克隆进行后续PCR鉴定和测序。
0197]7.阳性克隆的PCR鉴定及测序
0198](1)质粒DNA的提取用碱裂解法，按质粒小量抽提试剂盒说明书操作；
0199](2)以获取的质粒DNA为模版，进行PCR扩增反应。
0200]①引物名称及序列
0201]EGFP-N-R CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG
0202]NK4-mut-R :CGAAGGCAAAAAGCTGTGTTCGTGTGGTATCATGG
0203]②反应体系阴性对照ddH20及空载体自连对照组；阳性对照GAPDH③循环条件 为反应先94°C预变性30s，加入聚合酶；94°C变性30s、6(TC退火30s、72°C延伸30s，共30 个循环；结束前72°C延伸6min。
(3)接种阳性转化子，37°C培养16小时后保存为甘油菌，分装200 μ 1送测序，以确 保所筛选克隆碱基序列完全正确。8.质粒表达检测pGC-FU-NK4转染293Τ细胞，转染24小时后荧光显微镜下观察荧光表达情况观 察；9.质粒大量抽提以Qiagen公司的质粒抽提试剂盒提取pGC_FU_NK4表达载体、p-Helperl. 0和 p-Helper2. 0的质粒DNA，质粒DNA溶于除菌的TE中，以紫外光吸收法测定其浓度及纯度， 保证所提质粒DNA的A260/A280在1. 8 2. 0之间。10.重组慢病毒包装A、细胞转染(1)转染前24h，用0. 25%胰酶消化对数生长期的293T细胞，以含10% FBS的高 糖DMEM细胞培养基调整细胞密度为1. 2X107细胞ΛΟπιΙ，接种于15cm细胞培养皿，37°C、 5% C02培养箱内培养。待细胞密度达70% 80%转染；(2)转染前2h将细胞培养基更换为无血清培养基；(3)向一灭菌离心管中加入所制备的各DNA溶液(pGC_FU载体20 μ g，pHelper 1. O载体15 μ g，pHelper 2. O载体10 μ g)，与Opti-MEM混合均勻，调整总体积为2. 5ml，在 室温下温育5min ；(4)将 Lipofectamine 2000 试剂轻柔摇勻，取 100 μ 1 Lipofectamine2000 试剂在 另一管中与2. 4ml Opti-MEM混合，在室温下温育5min ；(5)把稀释后的DNA与稀释后的LipofectamindOOO进行混合，轻轻地颠倒混勻， 不要振荡；(6)室温孵育20min，以便形成DNA与Lipofectamine2000稀释液的转染复合物；(7)将DNA与Lipofectamine2000混合液转移至293T细胞的培养液中，混勻， 37°C,5% C02细胞培养箱中培养；(8)培养8h后倒去含有转染混和物的培养基，每瓶细胞加入20ml的PBS液，以洗 涤残余的转染混和物，弃去；(9)每瓶细胞中加入含10% FBS的H-DMEM细胞培养基25ml，于37°C，5% C02培 养箱内继续培养48h。B、病毒的收集与浓缩(1)收集转染后48h的293T细胞上清液；(2) 40C，4000g 离心 lOmin，除去细胞碎片；
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(3)以0. 45 μ m滤器过滤上清液于40ml超速离心管中；(4)把病毒粗提液样品加入到过滤杯中，盖上盖子；将过滤杯插到滤过液收集管 中；(5)4000g离心10_15min，至需要的病毒浓缩体积；(6)离心结束后，取出离心装置，将过滤杯和下面的滤过液收集杯分开；(7)将过滤杯倒扣在样品收集杯上；(8)转速低于lOOOg，离心2min。把过滤杯从样品收集杯上移开，样品收集杯中的 即为病毒浓缩液；(9)将病毒浓缩液移出，分装后保存在病毒管中，-80°C保存；取其中一支进行病 毒生物学滴度测定。所得病毒为携带NK4-EGFP融合基因的重组慢病毒。一种携带NK4基因的骨髓间充质干细胞的制备方法将携带NK4-EGFP融合基因的慢病毒(Lenti-NK4)转染BMSCs，通过观察荧光及流 式细胞仪检测转染率确定最佳感染复数(Multiplicity ofinfection,M0I)；采用酶联免疫 口及Pti式KEnzyme linked immunosorbent assay,ELISA) ^Western blot^IlJLenti-NK4 转染BMSCs后NK4表达。具体步骤如下1. Lenti-NK4 转染 BMSCs，确定最佳感染 MOI(1)用0. 125%胰酶+0. 02 % EDTA消化对数生长期的BMSCs，以含10 % FBS的 L-DMEM培养基调整细胞密度为以8X103/Cm2，种植于96孔细胞培养板中，37°C、5% C02培 养箱内培养；(2)24h后吸去培养液，？83洗涤细胞一次，按而1值为0、1、10、20、50、100加入相 应体积的重组慢病毒颗粒(Lenti-NK4)，同时补充5μ g/ml的Polybrane及完全培养基至总 量为500μ 1 ；(3)置37°C、5% C02培养箱内培养IOh后，换为正常培养基继续培养，病毒感染 24 120小时及传代后用激光共聚焦显微镜观察GFP表达；感染72h时分别收集各MOI值 的BMSCs的培养上清液，离心后-80°C保存，ELISA法检测培养液中NK4含量。收集细胞 Western blot检测NK4蛋白表达。2.流式细胞仪检测转染率(1)转染 Lenti-NK4 的 BMSCs 长满约 85%时，0. 125%胰酶 +0. 02% EDTA 消化，显 微镜下控制消化时间；(2)弃去消化液，以10 % FBS的L-DMEM培养基终止消化，轻轻吹打培养瓶；(3)液体移至离心管，lOOOrpm，离心5min ；(4)弃去培养基，加入PBS重悬细胞沉淀，调整细胞密度为1 X 106/ml ；(5)用同时培养的未转染Lenti-NK4的BMSCs设为阴性对照，上机检测转染率。采用最佳MOI的Lenti-NK4转入骨髓间充质干细胞，从而获得了能在体外持续、稳 定表达NK4基因的骨髓间充质干细胞。实施例1 用本技术领域公知的方法，以携带NK4基因的骨髓间充质干细胞为原料制成氯化 钠注射溶液，用于靶向治疗胃癌。实施例2
用本技术领域公知的方法，以携带NK4基因的骨髓间充质干细胞为原料制成磷酸 盐缓冲液，用于靶向治疗胃癌。
权利要求
携带NK4基因的骨髓间充质干细胞在治疗胃癌药物中的应用。
2.一种建立构建NK4-增强型绿色荧光蛋白融合基因重组慢病毒表达载体的方法，其 特征在于2.1目的基因的获取 A NK4基因片段a以HGFcDNA为模板，聚合酶链反应扩增NK4基因片段a :521bp ； a引物名称及序列NK4-Age I-F :GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGTGGGTGACCA AACTCC NK4-mut-R CGAAGGCAAAAAGCTGTGTTCGTGTGGTATCATGG b PCR反应体系上游引物NK4-Age I-F0. 4ul下游引物NK4-mut-R0. 4ulIOXbuffer2ulMgCl20. 5ulDNTPs (2. 5mM)0. 8ulpfu polymerase0. 2ulTemplate(lOng/μ 1)IulddH20补至20ulc循环条件反应先94°C预变性30s，加入聚合酶；94°C变性30s、6(TC退火30s、72°C延 伸60s，共30个循环，72°C延伸IOmin ； B NK4基因片段ba引物名称及序列以HGFcDNA为模板，PCR扩增NK4基因片段b :976bp ； NK4-mut-F :CACAGCTTTTTGCCTTCGAGCTATCGGGGTAAAGACC NK4-Age I-R :TCACCATGGTGGCGACCGGGACTATTGTAGGTGTGGT ATC b PCR反应体系上游引物NK4-mut-F0. 4ul下游引物NK4-AgeI-R0. 4ulIOXbuffer2ulMgCl20. 5ul c循环条件同前反应先94°C预变性30s，加入聚合酶；94°C变性30s、6(TC退火30s、 72°C延伸60s，共30个循环，72°C延伸IOmin ； C以a+b为模板PCR扩增NK4基因片段c a引物名称及序列NK4-AgeI-F :GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGTGGGTGAC CAAACTCC NK4-AgeI-R TCACCATGGTGGCGACCGGGACTATTGTAGGTGTGGTATC b PCR反应体系 c循环条件同前反应先94°C预变性30s，加入聚合酶；94°C变性30s、6(TC退火30s、 72°C延伸60s，共30个循环，72°C延伸IOmin ； 2. 2PCR产物回收取10μ 1 PCR扩增产物于1. 5%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下将PCR产物的琼脂糖凝胶切下，以胶回收试剂盒回收获得人NK4cDNA溶液；2. 3pGC-FU慢病毒表达载体的酶切限制性内切酶AgeI进行酶切，使其线性化；酶切反应体系__ 反应条件为37°C，Ih ；酶切产物经过0. 75%琼脂糖凝胶电泳后回收，并溶于50 μ 1灭菌 双蒸水中，准备用于构建重组质粒；`2.4目的基因重组慢病毒质粒的构建用In-Fusion酶将上述处理过的PCR产物与线性化载体进行交换反应重组质粒，反应 条件为 230C，15min,再 42°C，15min ； 交换反应体系对照1酶切回收的载体DNA(100ng/μ 1) 2μ 1 回收的PCR产物(IOOng/ μ 1)-`10 X In-Fusio交换酶缓冲液2 μ 1In-Fusio 交换酶酶0. 5μ1ddH20补至 20 μ 1`2`. 5感受态细胞制备采用CaCl2法制备Ε. coliDH5a感受态细胞 A从37°C培养16h的新鲜平板中挑取一个单菌落，转到一个含有IOOmlLB培养基的IL 烧瓶中，于37°C剧烈振摇培养3h，旋转摇床，300转/min ；B在无菌条件下将细菌转移到一个无菌用冰预冷的50ml聚丙烯管中，在冰上放置 lOmin，使培养物冷却至0°C ；C于4°C，4000转/min离心IOmin,回收细胞；D倒出培养液，将管倒置1分钟，使最后残留的痕量培养液流尽；E用IOml预冷的0. lmol/L CaCl2重悬每份沉淀，放置于冰浴上；F 40C，4000转/min离心IOmin,回收细胞；G倒出培养液，将管倒置lmin，使最后残留的痕量培养液流尽；H每50ml初始培养物用2ml预冷的0. lmol/L CaCl2重悬每份细胞沉淀；I将细胞分装成小份，放于-70°C冻存；`2. 6转化A用冷却的无菌吸头从每种感受态细胞悬液中各取200 μ 1转移到无菌的微量离心管 中，每管加10 μ 1连接液，轻轻旋转以混勻内容物，在冰中放置`30min ； B将管放到42°C的循环水浴中的试管架上，放置90s，勿摇动试管； C快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却l-2min ；D每管加800 μ ILB培养基，水浴加温至37 °C，然后将管转移到37 °C摇床上，温育 45min ；对照22μ 1 2μ 1 0. 5μ 1 补至20 μ 1连接组 2μ 1 2μ 1 1 μ 1 0. 5μ 1 补至20 μ 1E将150 μ 1已转化的感受态细胞转移到含20mmol/L MgSO4和AMP抗性100ug/ml的 LB琼脂培养基上；F将平板置于室温直至液体被吸收； G倒置平皿，于37°C培养16h ； H长出的克隆进行后续PCR鉴定和测序； 2. 7阳性克隆的PCR鉴定及测序A质粒DNA的提取用碱裂解法，按质粒小量抽提试剂盒说明书操作； B以获取的质粒DNA为模版，进行PCR扩增反应； a引物名称及序列 EGFP-N-R CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG NK4-mu t-R :CGAAGGCAAAAAGCTGTGTTCGTGTGGTATCATGG b反应体系阴性对照ddH20及空载体自连对照组；阳性对照GAPDH c循环条件为反应先94°C预变性30s，加入聚合酶；94°C变性30s、6(TC退火30s、72°C 延伸30s，共30个循环；结束前72°C延伸6min ； C接种阳性转化子，37°C培养16小时后保存为甘油菌，分装200 μ 1送测序，以确保所筛 选克隆碱基序列完全正确； 2. 8质粒表达检测PGC-FU-NK4转染293Τ细胞，转染24小时后荧光显微镜下观察荧光表达情况观察； 2. 9质粒大量抽提以Qiagen公司的质粒抽提试剂盒提取pGC_FU_NK4表达载体、p-Helperl. 0和 p-Helper2. 0的质粒DNA，质粒DNA溶于除菌的TE中，以紫外光吸收法测定其浓度及纯度， 保证所提质粒DNA的A260/A280在1. 8 2. 0之间； 2. 10重组慢病毒包装 A、细胞转染a转染前24h，用0. 25%胰酶消化对数生长期的293T细胞，以含10% FBS的高糖DMEM细胞培养基调整细胞密度为1.2X107细胞ΛΟπιΙ，接种于15cm细胞培养皿，37°C、5% C02培养箱内培养，待细胞密度达70% 80%转染；b转染前2h将细胞培养基更换为无血清培养基；c向一灭菌离心管中加入所制备的各DNA溶液pGC-FU载体20 μ g，pHelperl. 0载体 15 μ g，pHelper 2. 0载体10 μ g，与Opti-MEM混合均勻，调整总体积为2. 5ml，在室温下温 育 5min ；d将 Lipofectamine 2000 试剂轻柔摇勻，取 100 μ 1 Lipofectamine2000 试剂在另一管 中与2. 4ml Opti-MEM混合，在室温下温育5min ；e把稀释后的DNA与稀释后的LipofectamindOOO进行混合，轻轻地颠倒混勻，不要振荡；f室温孵育20min，以便形成DNA与LipofectamindOOO稀释液的转染复合物； g将DNA与Lipofectamine2000混合液转移至293T细胞的培养液中，混勻，37°C、5 % C02细胞培养箱中培养；h培养8h后倒去含有转染混和物的培养基，每瓶细胞加入20ml的PBS液，以洗涤残余 的转染混和物，弃去；i每瓶细胞中加入含10% FBS的H-DMEM细胞培养基25ml，于37°C，5 % C02培养箱内 继续培养48h ；B、病毒的收集与浓缩 a收集转染后48h的293T细胞上清液； b4°C，4000g离心lOmin，除去细胞碎片； c以0. 45 μ m滤器过滤上清液于40ml超速离心管中；d把病毒粗提液样品加入到过滤杯中，盖上盖子；将过滤杯插到滤过液收集管中； e4000g离心10-15min，至需要的病毒浓缩体积； f离心结束后，取出离心装置，将过滤杯和下面的滤过液收集杯分开； g将过滤杯倒扣在样品收集杯上；h转速低于lOOOg，离心2min，把过滤杯从样品收集杯上移开，样品收集杯中的即为病毒浓缩液；i将病毒浓缩液移出，分装后保存在病毒管中，-80°C保存；取其中一支进行病毒生物 学滴度测定，所得病毒为携带NK4-EGFP融合基因的重组慢病毒。
3. 一种携带NK4基因的骨髓间充质干细胞的制备方法，其特征在于 将携带NK4-EGFP融合基因的慢病毒(Lenti-NK4)转染BMSCs，通过观察荧光及流 式细胞仪检测转染率确定最佳感染复数；采用酶联免疫吸附试验及Western blot检测 Lenti-NK4转染BMSCs后NK4表达，具体步骤如下 3. ILenti-NK4转染BMSCs，确定最佳感染MOIA用0. 125%胰酶+0. 02% EDTA消化对数生长期的BMSCs，以含10% FBS的L-DMEM培 养基调整细胞密度为以8X103/Cm2，种植于96孔细胞培养板中，37°C、5% C02培养箱内培 养；B 24h后吸去培养液，PBS洗涤细胞一次，按MOI值为0、1、10、20、50、100加入相应体积 的重组慢病毒颗粒(Lenti-NK4)，同时补充5 μ g/ml的Polybrane及完全培养基至总量为 500 μ 1 ；C置37°C、5% C02培养箱内培养IOh后，换为正常培养基继续培养，病毒感染24 120小时及传代后用激光共聚焦显微镜观察GFP表达；感染72h时分别收集各MOI值的BMSCs 的培养上清液，离心后-80°C保存，ELISA法检测培养液中NK4含量；收集细胞Western blot 检测NK4蛋白表达；‘3. 2流式细胞仪检测转染率A转染Lenti-NK4的BMSCs长满约85%时，0. 125%胰酶+0. 02% EDTA消化，显微镜下 控制消化时间；B弃去消化液，以10% FBS的L-DMEM培养基终止消化，轻轻吹打培养瓶； C液体移至离心管，IOOOrpm,离心5min ；D弃去培养基，加入PBS重悬细胞沉淀，调整细胞密度为1 XlO6Ail ； E用同时培养的未转染Lenti-NK4的BMSCs设为阴性对照，上机检测转染率； 采用最佳MOI的Lenti-NK4转入骨髓间充质干细胞，从而获得了能在体外持续、稳定表 达NK4基因的骨髓间充质干细胞。
全文摘要
本发明公开了一种携带NK4基因骨髓间充质干细胞的制备方法及其在治疗胃癌药物中的应用，它是从HGF质粒中调取了NK4基因后，采用In-Fusion技术，将其定向克隆至慢病毒表达载体质粒中，构建了NK4-EGFP融合基因重组慢病毒载体质粒(pGC-FU-NK4)后与pHelper1.0载体和pHelper2.0载体三质粒共转染293T细胞，包装生产NK4过表达慢病毒颗粒(Lenti-NK4)。将携带NK4-EGFP融合基因的慢病毒(Lenti-NK4)转染骨髓间充质干细胞，建立了体外稳定表达NK4基因的骨髓间充质干细胞。Balb/C裸鼠动物实验证明BMSCs为载体的NK4基因治疗可明显抑制胃癌皮下移植瘤的生长，抑瘤率高，是一种良好的胃癌基因治疗方法。
文档编号C12N15/867GK101912618SQ20101024854
公开日2010年12月15日 申请日期2010年8月9日 优先权日2010年8月9日
发明者吕农华, 张焜和, 祝荫, 程明, 罗时文, 谢勇 申请人:祝荫