专利名称：一种提高l-缬氨酸发酵产率和糖酸转化率的方法
一种提高L-缬氨酸发酵产率和糖酸转化率的方法技术领域：
本发明涉及一种提高L-缬氨酸发酵过程糖酸转化率和产率的方法， 属于发酵法生产氨基酸的技术领域。背景技术：
黄色短杆菌是工业发酵生产缬氨酸的常用菌株。在缬氨酸生产菌生 物合成的代谢途径已经清楚的前提下，理论上通过计算可以得出L-缬氨酸生产的得率在 0. 651g L-缬氨酸/g葡萄糖，而目前实际得率仅有约0. 25-0. 35gL_缬氨酸/g葡萄糖，较理 论值有较大的差距，所以仍具有很大的研究空间。但是，提高糖酸转化率相对于提高产率而 言却有相当大的难度。近年来，代谢工程领域的研究结果表明，黄色短杆菌细胞内主要由EMP和HMP途径 进入TCA。研究资料表明，在以葡萄糖为底物发酵时，乙醛酸循环并未出现，而且L-缬氨酸 生产菌黄色短杆菌XV0505菌株是亮氨酸和异亮氨酸双重缺陷突变株，故代谢途径中无亮 氨酸、异亮氨酸和乙醛酸循环。因此，过量碳的溢流会导致有机酸和其他物质的生成。在黄 色短杆菌中，分析葡萄糖在胞内的代谢途径，明显可以看到产物L-缬氨酸的生物合成过程 中，HMP途径所提供的能量是十分重要的，这样代谢流在EMP、TCA和HMP之间的合理分配就 成为提高L-缬氨酸产率和糖酸转化率的前提。
发明内容本发明采用在培养基中添加一定量的柠檬酸或其盐的方法来提高缬 氨酸生产菌L-缬氨酸发酵过程糖酸转化率和产率。本发明采用代谢流量分析方法，定量研究了柠檬酸或柠檬酸盐添加前后黄色短杆 菌XV0505合成L-缬氨酸代谢流量分布的变化。黄色短杆菌细胞内主要由EMP和HMP途径 进入TCA。PEP通过CO2固定反应生成OAA (草酰乙酸)，而OAA是合成L-苏氨酸等杂酸的 前体。添加柠檬酸或盐可以有效减少这一 TCA循环的回补反应，以使更多的PEP参与L-缬 氨酸的合成，同时减少L-苏氨酸等杂酸积累。丙酮酸是L-缬氨酸合成的一个关键节点，丙 酮酸是L-缬氨酸生物合成的直接前体，同时副产物(L-丙氨酸和HAc)的合成和TCA均需要 丙酮酸的直接或间接参与。柠檬酸或柠檬酸盐可以抑制丙酮酸激酶的活性，造成磷酸烯醇 式丙酮酸的积累。磷酸烯醇式丙酮酸是EMP途径限速酶磷酸果糖激酶的抑制剂，所以磷酸 烯醇式丙酮酸的积累降低了磷酸果糖激酶的活性，从而降低了 EMP途径的通量，缓解了 EMP 和TCA之间的代谢溢流，从而减少流向副产物(L-丙氨酸和HAc)的代谢流量，同时，葡萄糖 总通量没有变化，所以更多的葡萄糖进入HMP途径生成了 L-缬氨酸合成所必需的能量。另 外，α-KG以谷氨酸脱氢酶作用生成谷氨酸或以氧化脱羧反应生成琥珀酰辅酶A进而合成 0ΑΑ,而L-谷氨酸为生成L-缬氨酸途径中的转氨作用提供氨基。添加适量柠檬酸钠可以提 高合成谷氨酸的代谢流量，提高由L-谷氨酸生成L-缬氨酸的转液氨平，有利于L-缬氨酸 合成。此方法在不增加额外设备和人力投入的情况下，实现了整个发酵周期的缩短和 L-缬氨酸产量和转化率的大幅提高，适合于工业化生产。本发明的目的是通过如下技术方案实现的本发明提供的一种提高L-缬氨酸发酵过程糖酸转化率和产率的方法，其特征 是在发酵培养基中添加柠檬酸或其盐，使其在培养基中的浓度均为0. 01 10g/L，优选
30. 05 5g/L，更优选0. 1 3g/L。其中所说的柠檬酸盐为柠檬酸钠或柠檬酸钾。根据调整代谢流分配的原理提出了适用于提高缬氨酸生产菌L-缬氨酸发酵过程 中糖酸转化率和产率的方法，它通过添加柠檬酸或柠檬酸盐降低丙酮酸激酶和磷酸果糖激 酶的活力，减弱糖酵解途径通量，降低有机酸的合成，缓解EMP和TCA之间的代谢溢流，使更 多的葡萄糖进入HMP途径生成了 L-缬氨酸合成所必需的能量，从而在糖耗相同的基础上， 合成较多的L-缬氨酸，即提高了糖酸转化率。
具体实施方式下面通过实施例对本发明作进一步的说明，所举之例并不限制本发明的保护范 围实施例1:采用的菌株为谷氨酸棒杆菌或黄色短杆菌；培养基为在现有普遍采用的发酵培养 基[葡萄糖 80. 0，玉米浆 20mL,豆饼水解液 25mL，(NH4) 2S042. 0，K2HPO4 1. 2，MgSO4 · 7H20 0. 4，MnSO4 · 7H20 0. 015，lie 0. 06，Leu 0. 2，Met 0. 5，VB1 0. 3mg，生物素 0. 2mg]中添加 0. lg/L柠檬酸钠；培养方法将菌种接入种子培养基[葡萄糖25.0，玉米浆20mL，豆饼水解 液 15mL，酵母粉 4. 0，尿素 0. 6，K2HPO4 1. 0，MgSO4 · 7H20 0. 4，MnSO4 · 7H20 0. 01，VB1 0. 3mg, 生物素0. 2mg]中，接种量为5%;在32°C、pH为7. 0和溶氧为20%条件下于5L自动控制发 酵罐中培养6h至对数期，按10%的接种量接入含有发酵培养基的5L自动控制发酵罐中， 温度控制在32°C，通入适当空气，调节适当搅拌转速，采用分阶段供氧模式控制溶氧0 IOh为20%，10 32h为5%，通过自动流加液氨控制pH在7. 0 7. 2，通过流加适量泡敌 消泡，并通过流加浓度为800g/L的葡萄糖溶液将残糖控制在1.0%，发酵至32h停止。放罐 时，L-缬氨酸的产量为58. 7g/L，糖酸转化率为26. 9%，分别比对照实验(L-缬氨酸产量为 57. Og/L，糖酸转化率为26. 0% )提高了 3.0%和3.5%。实施例2:采用的菌株为谷氨酸棒杆菌或黄色短杆菌；培养基为在现有普遍采用的发酵培养 基(同实施例1)中添加1. Og/L柠檬酸钠；培养方法同实施例1。放罐时，L-缬氨酸的产量 为60. 5g/L，糖酸转化率为27.9%，分别比对照实验(L-缬氨酸产量为57. Og/L,糖酸转化率 为 26.0%)提高了 6.1%和 7.3%。实施例3:采用的菌株为谷氨酸棒杆菌或黄色短杆菌；培养基为在现有普遍采用的发酵培养 基(同实施例1)中添加3g/L柠檬酸钠；培养方法同实施例1。放罐时，L-缬氨酸的产量为 61. 2g/L，糖酸转化率为28. 3 %，分别比对照实验(L-缬氨酸产量为57. Og/L,糖酸转化率为 26. 0% )提高了 7. 4%和 8. 8%。
权利要求
一种提高L 缬氨酸发酵产率和糖酸转化率的方法，其主要步骤为采用谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌等谷氨酸生产菌经发酵获得L 缬氨酸，其特征在于，在培养基中添加柠檬酸或其盐，使其在培养基中的浓度均为0.01～10g/L。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是其中所说的柠檬酸或其盐的浓度为0.05 5g/L。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征是其中所说的柠檬酸或其盐的浓度为0.1 3g/L。
4.根据权利要求1 3所述的任意一种方法，其特征是其中所说的柠檬酸盐为柠檬 酸钠或柠檬酸钾。
全文摘要
一种提高L-缬氨酸发酵产率和糖酸转化率的方法。本发明涉及一种发酵法制备L-缬氨酸的改进方法。本发明根据调整细胞代谢流分配的原理，采用在培养基中添加柠檬酸或其盐的方法，来有效提高L-缬氨酸发酵过程糖酸转化率和产率。
文档编号C12P13/08GK101979626SQ20101052773
公开日2011年2月23日 申请日期2010年11月2日 优先权日2010年11月2日 公开号201010527736.发明者冯宁, 刘淑云, 徐庆阳, 谢希贤, 陈宁 申请人:天津科技大学