专利名称：一株具诱导大豆抗逆的巨大芽孢杆菌及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物农药技术领域，具体涉及一种诱导大豆抗逆的巨大芽孢杆菌及 应用。
背景技术：
东北是我国大豆主产区，低温是降低大豆产量的主要因子。大豆整个生育期的各 个阶段都易出现冷害，从而降低产量和品质，尤其萌发初期对低温敏感。在早春下播种时， 由于低温常容易引起出苗时间延长造成畸形苗，或者种子霉烂变质而丧失发芽能力，造成 大豆减产，为此加强大豆出苗耐低温性的相关研究对大豆生产具有积极的意义。采用施放 烟雾、地膜覆盖、抗寒力强的品种或晚熟品种适时早播等措施可提高植物的抗寒力，但都有 局限性。目前提高大豆抗寒性的方法是使用一些化学物质或者抗寒剂等，这对作物品质和 土壤可能会造成一定的影响。由于人们环境保护意识的提高，而大部分的诱导物对环境无 污染，并且诱导抗性具有广谱、持续时间较长、抗性表达时间和空间的相对可控性等特点。 这些特点决定了植物诱导抗性具有良好的应用前景。利用细菌作为生物防治因子防治植物 病害已成为国内外生物防治研究中的一个热点。PGPR的促生防病研究已成为热点方向之一，其研究主要集中在假单胞菌和芽孢杆 菌类，该类群能够抑制多种植物病害特别是土传病害。作用机理主要包括有效根部定殖、抗 生作用、根际营养竞争、分泌降解病原微生物的酶等。因此，PGI^R制剂在农林牧业、环境保 护等方面具有重大应用潜力和价值。据此本研究旨在提出创新思路，筛选出可诱导大豆产生系统抗性的根际促生菌用 以抵抗低温同时能够抵抗病菌和线虫。该研究将为控制低温冷害提供新思路和新方法，对 农业生产、尤其是大豆生产起到绝对的推动作用，具有重要的理论意义和实际应用价值。
发明内容
本发明的目的是获得一株可诱导大豆在种子萌发和生长期间能抵抗低温和大豆 胞囊线虫病的菌株，将菌株按常规液体发酵培养后，可以用该菌或该菌的代谢产物，开发出 处理大豆种子的种子处理剂，经过处理的大豆种子可以使大豆产生对低温和大豆胞囊线虫 病的抗性。本发明筛选获得的一株细菌菌株是巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium) Sneb69，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址中国.北京市 朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期2010年11月02日；保藏登记入册的编号=CGMCC No. 4296。巨大芽孢杆菌是从大量土壤细菌菌株中筛选出的一株对大豆具有强诱导活性的 细菌菌株。本发明通过研究发现，土壤细菌有很多株细菌都具有一定的活性，从这些细菌中 筛选出一株性状相对较好的菌株巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium) Sneb69进行了进一 步的研究。
本发明还涉及用于诱导大豆种子的细菌代谢物，其是由本发明的细菌菌株巨大芽 孢杆菌(Bacillus megaterium)Sneb69经过常规的液体发酵培养后提取制备的。本发明的细菌菌株巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium) Sneb69是通过试管种培
养后，再经扩大发酵培养来制备，其具体方法如下1.试管种培养培养基配方为牛肉膏蛋白胨(NA)培养基，即成分牛肉浸膏3g，蛋白胨10g，酵母 浸膏lg，蔗糖10g，琼脂20g，加水至IOOOmL02.液体发酵培养其中液体发酵培养基配方为以重量百分比计，含有牛肉浸膏0. 2% -0. 4%、蛋白 胨_2%、酵母浸膏0. 1% -0.5%、蔗糖_2%、余下为蒸馏水，pH为7-9。将试管种接种到250mL三角瓶(每瓶装IOOmL)液体培养基中，25°C 下，摇 床转速以150r · mirT1 200r · mirT1、发酵45-50小时，优选48h。液体发酵的菌种可以通过大型发酵罐进行规模生产，其产品为发酵液或发酵液的 制成品。本发明还涉及一种大豆种子处理剂，其包含有效量的本发明所述的巨大芽孢杆菌 (Bacillus megaterium) Sneb69本身或其代谢物作为有效活性成分。本发明的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium) Sneb69或其代谢物具有对大豆的 诱导活性，可用于大豆的种子处理，处理后的大豆可以在苗期抵御早春低温和大豆胞囊线 虫侵害，解决东北大豆胞囊线虫病为害严重和早春低温的情况。
具体实施例方式为了更详细地进一步阐明而不是为了限制本发明，给出了下列实施例。实施例1 巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium) Sneb69的获得取大豆田的土壤lg，加入无菌水100ml，取200 μ 1，加入冷却至35°C以下的灭菌的 20ml NA液体培养基，25°C下培养待菌落长出后，根据菌落色泽和边缘状态，挑取巨大芽孢 杆菌(Bacillus megaterium)菌落单独保存，进行扩繁和生理生化测定，培养性状符合巨大 芽孢杆菌(Bacillus megaterium)特征的保存备用。实施例2 巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium) Sneb69的培养首先对巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium) Sneb69菌株进行发酵培养，然后对 发酵培养后的代谢产物进行大豆诱导活性试验，确定其对大豆的诱导作用。将巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium) Sneb69的菌体接种到试管琼脂培养基 上，培养基配方为NA培养基，即成分牛肉浸膏3g，蛋白胨10g，酵母浸膏lg，蔗糖10g，琼脂 20g，加水至1000mL。25°C培养10d，获得试管种。再将试管种接种到250mL三角瓶(每瓶装IOOmL)液体培养基中，培养基配方为 以重量百分比计，含有牛肉浸膏0. 2%、蛋白胨1%、酵母浸膏0. 5%、蔗糖1%、余下为蒸馏 7jC, pH为8。在25°C下培养，摇床转速以180r · mirT1、发酵48h，形成的发酵液或发酵液的 制成品可以直接或间接处理大豆种子。被处理的大豆种子可以在早春低温播种种植在土壤 中，并且在大豆苗期时可以抵抗大豆胞囊线虫病的为害。
实施例3 巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium) Sneb69的发酵基本同实施例一，不同之处是将液体培养的菌种接种到1000L的发酵罐进行发 酵，在25°C下培养，pH为8，发酵48h。实施例4 巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium) Sneb69的发酵基本同实施例一，不同之处是液体培养基配方，其配方为以重量百分比计，含有牛肉浸膏0. 3%、蛋白胨1%、酵母浸膏0. 1%、蔗糖2%、余 下为蒸馏水，PH为7。实施例5 巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium) Sneb69发酵产品的使用将发酵液稀释为106cfu/L，按1 50的比例处理包衣大豆种子，晾干后，将处理过 的大豆种子播种在辽宁省康平县，黑龙江省大庆市两地自然发病土壤中，进行5次重复试 验以NA液体培养基处理为对照。试验田为重茬大豆田。35d后从根上胞囊量、土中胞囊量、 根内线虫量三个方面调查发现对大豆胞囊线虫有显著的抑制作用，且在不同地区不同重复 中均保持稳定的抗病能力。(如下表)
权利要求
1.一株处理大豆种子后具有诱导大豆产生抗逆性的细菌菌株，其特征在于该菌株为 巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)Sneb69，已于2010年11月02日保藏在中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 4296。
2.具有诱导大豆产生抗逆性的细菌代谢物，其特征在于，是由权利要求1所述的细菌 菌株经过液体发酵后形成的发酵液制备的，液体发酵培养基配方为以重量百分比计，含有 牛肉浸膏0. 2% -0. 4%、蛋白胨_2%、酵母浸膏0. 1%-0. 5%、蔗糖_2%、余下为蒸 馏水，PH为7-9。
3.权利要求1所述的细菌菌株的液体发酵方法，其特征在于液体发酵培养基配方为 以重量百分比计，含有牛肉浸膏0.2% -0.4%、蛋白胨_2%、酵母浸膏0. 1% -0.5%, 蔗糖-2%、余下为蒸馏水，pH为7-9，发酵温度为2548°C，摇床转速150r · mirT1 200r · mirT1、发酵时间 45_50h。
4.根据权利要求3所述的液体发酵方法，其特征在于所述的发酵时间为48h。
5.具有诱导大豆产生抗逆性的细菌代谢物的制备方法，其特征在于是由权利要 求1所述的细菌菌株经过液体发酵后形成的发酵液制备的，液体发酵培养基配方为以 重量百分比计，含有牛肉浸膏0.2% -0.4%、蛋白胨1(%-2(%、酵母浸膏0.1(%-0.5(%、 蔗糖-2%、余下为蒸馏水，pH为7-9，发酵温度为2548°C，摇床转速150r · mirT1 200r · mirT1、发酵时间 45_50h。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述的发酵时间为48h。
7.一种用于发酵权利要求1所述的细菌菌株的培养基，其特征在于发酵培养 基配方为以重量百分比计，含有牛肉浸膏0.2% -0.4%、蛋白胨1%-2(%、酵母浸膏 0. 1% -0. 5%、蔗糖_2%、余下为蒸馏水。
8.权利要求7所述的培养基，其特征在于培养基的pH为7-9。
9.一种大豆种子处理剂，其特征在于，包含有效量的权利要求1所述的细菌菌株或权 利要求2所述的细菌代谢物作为活性成分，用于诱导大豆产生对低温及大豆胞囊线虫病的 抗性。
10.权利要求1所述的细菌菌株或权利要求2所述的细菌代谢物在诱导大豆抗寒及抗 大豆胞囊线虫病中的应用。
全文摘要
本发明涉及一株处理大豆种子后具诱导大豆抵御早春低温和大豆胞囊线虫病的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)Sneb69的培养方法及其应用，属于微生物农药技术领域。本发明涉及的细菌菌株Sneb69，已于2010年11月02日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.4296。通过液体发酵培养制备，其代谢物处理大豆种子后，大豆能够抵御早春低温和大豆胞囊线虫病。通过该细菌的代谢产物处理后的大豆可以在早春播种，并且在大豆胞囊线虫病发生严重的土壤中也能生长。解决了高纬度地区全年大豆生长的有效积温少，适宜大豆生长的季节短的难题，具良好的应用开发前景。
文档编号C12R1/11GK102108339SQ201010560329
公开日2011年6月29日 申请日期2010年11月26日 优先权日2010年11月26日
发明者朱晓峰, 段玉玺, 王媛媛, 陈立杰, 黄姗姗 申请人:沈阳农业大学