专利名称：Hiv病毒耐药性单核苷酸多态性检测装置的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及一种确定基因单碱基突变的装置，尤其涉及一种检测单核苷酸多 态性的装置，及时了解患者体内HIV病毒耐药性状况，为改变诊疗方案和药物组合提供依 据。
背景技术：
人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)是导致获得性免疫缺 Pg^E (Acquired immunodeficiency syndrome，AID)白勺_帛#。 g HIV
的潜伏期一般为1-12年，平均潜伏期为7-8年，极少数可以达到15年。个体在感染病毒 后的几周内会出现发热、肌关节痛、皮疹和头痛等症状，然后大部分个体进入无症状的病毒 潜伏期，不易引起关注。此外，病毒的潜伏期时间较长，是的该疾病在全球范围内迅速传播， 对该病毒的检测(现代检验医学杂志[J]，2004，19 (6)，64-67 ；卫生职业教育[J]，2008，20， 149-151 ；中国国境卫生检疫杂志[J]，2009，32 (4)，285-292)，以及对由其引起的疾病进行 诊断和治疗已成为临床医学、免疫学和病毒学等多学科研究的热点。HIV病毒属于逆转录病毒，具有高度遗传变异性，致使多种HIV抗病毒治疗药物都 无法取得良好效果。及时了解患者的HIV耐药性，对医治艾滋病患者十分重要，对这个艾滋 病疫情控制意义重大(全国免疫学与分子生物学技术新进展研讨会，362-365)。中国发明专利ZL200510132118. 0公开了一种检测HIV对逆转录酶抑制剂抗性的 基因芯片，使用自动点样仪将96个探针点于由四个阵区组成的玻片上而成。在检测之前， 首先得到待检样品的cDNA，进行PCR扩增后，利用随机引物和荧光素Cy5-dCTP对纯化片段 进行标记。标记产物烘干后与杂交液混勻，变性后加在基因芯片的探针阵列上进行杂交。之 后按照离子强度由高到低的顺序对芯片进行清洗。利用生物芯片专用的扫描仪读取芯片上 的荧光信号并利用相应的生物芯片数据分析软件对结果进行分析，根据对每一个位点设计 的不同探针的荧光数据的比值来确定不同位点核苷酸的种类。通过对14个位点核苷酸的 判断，就可以达到对HIV进行耐药性位点突变情况检测，从而完成其耐药性检测。该发明的 技术方案对HIV病毒耐药性检测的时间较长，且步骤多，分析过程需要依赖专门的软件，应 用的通用性不高。中国发明专利申请200880008644. 8公开了一种检测HIV耐药变异体的系统和方 法。该方法适用于通过单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)来检测 和分析HIV病毒耐药性相关的序列变异体。从HIV样品群中各RNA分子生成复数个cDNA 种类，并扩增出数个第一扩增子，由第一扩增子产生复数个第二扩增子，在单个仪器上平行 测定来自至少100个固定化群的基本相同拷贝的核酸序列组合物，检测该至少100个固定 化群的核酸序列组合物中以5%或更低频率出现的一个或更多个序列变异体，并将此与HIV 耐药性变异相关联。该发明中并没有提供一种便于应用此方法的检测装置。在当前的研究性实验室或医院临床检测室中，尚没有一种针对HIV耐药性检测的 装置，以简化检测过程，便于结果判断，减少检测时间和提高检测效率。
实用新型内容本实用新型的目的在于提供一种HIV病毒耐药性单核苷酸多态性检测装置，包括 多个检测单元，在生物检测器的配合下，直接判断与HIV病毒耐药性相关的序列变异体，以 简化检测过程，便于结果判断，减少检测时间和提高检测效率。单核苷酸多态性主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序 列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种。占所有已知多态性的90%以上。SNP 在人类基因组中广泛存在，平均每500 1000个碱基对中就有1个，估计其总数可达300 万个甚至更多。SNP所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异，这种变异可由单个碱基的转 换(transition)或颠换(transversion)所引起，也可由碱基的插入或缺失所致。本实用新型提供的一种HIV病毒耐药性单核苷酸多态性检测装置，包括对照部件 和检测部件。对照部件上结合有能与含有突变位点的待检核酸分子互补结合的阳性对照核 酸分子，或能与不含突变位点的待检核酸分子互补结合的阴性对照核酸分子。检测部件包 括若干个检测单元，每个检测单元上结合有单一的探针分子，探测分子能与待检核酸分子 上单碱基突变位点互补结合。检测单元的数量与单核苷酸多态性所具有的等位数的整数倍 相一致。在使用本实用新型装置对待检核酸分子进行检测前，需要对待检核酸分子进行标 记，如但不仅限于，荧光素、同位素、化学发光基团或磁性材料等。本实用新型优先选择磁 性材料对待检核酸分子进行检测，如同本领域技术人员所熟知的，磁性材料标记核酸分子 的方法通常是在对HIV病毒cDNA扩增过程中引入能与磁性材料结合的一段核酸序列，中国 发明专利申请200880008644. 8中就具体公开了这类标记方法。已有多项技术公开了用于检测HIV病毒耐药性单核苷酸多态性的探针分子，如 中国发明专利申请200510132118. 0和200880008644. 8所记载的内容，或参考已公开的各 类HIV病毒基因突变位点和抗病毒药物关系的现有技术，如但不仅限于，期刊、会议报告、 网站或公开的专利申请等文献，借助于各种计算机软件，本领域技术人员能设计出其它探 针分子。在检测过程中，对PCR扩增后的HIV病毒cDNA进行标记，然后把含有待检标记核 酸分子的溶液由本实用新型检测装置的进口端加入，在出口端施加作用力(如抽气机)或 在进口端施加作用力(如液体泵)，使待检标记分子依次经过结合有阴性对照核酸分子的 对照部件、检测部件和结合有阳性对照核酸分子的对照部件，然后用检测器对各个检测单 元进行探测。当探测到某个或某几个检测芯片单元有响应时，表明待检核酸分子在该检测 单元的位点上存在碱基突变，通过与已知抗药性序列比对就能获得HIV病毒抗药性的信 肩、ο本实用新型提供的HIV病毒耐药性单核苷酸多态性检测装置，适用于二等位多态 性，三等位多态性和四等位多态性的SNP，尤其适用于二等位多态性的SNP。另一种HIV病毒耐药性单核苷酸多态性检测装置，包括第一对照部件，其上固定阴性对照核酸分子，用于与未发生突变的待检标记核酸 分子互补结合；第二对照部件，其上固定阳性对照核酸分子，用于与发生突变的待检标记核酸分
4子互补结合；检测部件，位于第一对照部件和第二对照部件之间，用于单核苷酸多态性的检测。在组成检测部件的各个检测单元上设有微通道，微通道是平均径宽小于 400 μ m的腔体。本实用新型检测单元上的微通道的平均径宽选择20-200 μ m,优先选择 50-180 μ m,更优先选择70-150 μ m,这些平均径宽如但不仅限于，70 μ m、75 μ m、80 μ m、 75μπι、90μπι、95μπι、100μπι、105μπι、110μπι、115μπι、120μπι、125μπι、130μπι、135μπι、 140 μ m、145 μ m或150 μ m。本实用新型中，当微通道为槽型时，径宽应理解为微通道两侧槽 内壁之间的宽度；当微通道为圆形截面的管道时，径宽应理解为微通道圆形截面的直径。为使待检标记核酸分子与探针分子互补结合，本实用新型微通道至少包括一段折 线段或曲线段。微通道的总长度大于2000 μ m,优先选择5000-8000 μ m。本实用新型提供的检测单元还包括盖片，盖于检测芯片单元的主体上。盖片的材 质优先选择疏水性材质，如聚二甲基硅氧烷(polyWimethylsiloxane)，PDMS)。本实用新型的对照部件和检测单元优先选择本领域常用的检测芯片形式，其各自 的结构可以相同或不同。检测部件则是包括若干个检测芯片单元的集合。另一种HIV病毒耐药性单核苷酸多态性检测装置，包括阴性对照检测芯片、阳性 对照检测芯片和检测部件。阴性对照检测芯片与检测装置的进口端连接，阳性对照检测芯 片与检测装置的出口端连接，检测部件设于阴性对照检测芯片和阳性对照检测芯片之间。阴性对照检测芯片，其上固定有无法与待检标记核酸分子互补结合的核酸分子， 用于判断待检标记核酸分子存在突变位点。阳性对照检测芯片，其上固定有能完全与待检标记核酸分子互补结合的核酸分 子，用于判断待检标记核酸分子的核酸序列。检测部件包括1个以上的检测芯片单元，每个芯片单元上结合有一种分子探针。 其中，检测部件中所含的检测芯片单元的数量根据SNP等位数量(如2、3或4)决定，本实 用新型优先选择二等位多态性的SNP。为此，检测部件中含有2的整数倍个检测芯片单元， 其倍数即为待检标记核酸分子上的碱基突变数。整数为正整数，如但不仅限于，1、2、3、4、 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14和15等。当待检标记核酸分子上的碱基突变数为1时，检测 部件包括2个检测芯片单元；当待检标记核酸分子上的碱基突变数为2时，检测部件包括4 个检测芯片单元；当待检标记核酸分子上的碱基突变数为10时，检测部件包括20个检测芯 片单元。本实用新型优先选择，磁性纳米材料对PCR扩增后的HIV病毒cDNA进行标记，再 把含有待检标记核酸分子的溶液由本实用新型检测装置的进口端加入，在出口端施加作用 力(如抽气机)使待检标记分子依次经过阴性对照检测芯片、检测部件和阳性对照检测芯 片，然后用磁感应检测器对各个检测芯片单元进行探测。当探测到某个或某几个检测芯片 单元有磁感应时，表明待检核酸分子在该检测芯片单元的位点上存在碱基突变。本实用新型提及的“突变”包括单个碱基的转换或颠换，也包括碱基的插入或缺 失。本实用新型提及的“待检标记核酸分子”是将待检核酸分子进行磁性材料标记而 得。“待检核酸分子”来自于“受试者”的血液、分泌物、组织液、体外培养液或组织等。本实用新型提及的“病患”、“患者”和“受试者”指人、野生动物和家畜(Livestock)。野生动物为自然状态下未经人工驯化的动物。家畜是为了提供食物来源而 人工饲养的动物，如猴、猿、狗、鼠、仓鼠、猪、兔、奶牛、水牛、公牛、绵羊和山羊等。给予诊断 的“受试者”优先选择哺乳动物，尤其是人。本实用新型技术方案实现的有益效果本实用新型提供的HIV病毒耐药性单核苷酸多态性检测装置，在每个检测单元上 结合单一的探针分子，待检标记核酸分子分别与探针分子结合，再使用磁感应检测器感应 检测单元的磁性，就能直接判断待检核酸分子的突变位点，实现对HIV病毒耐药性相关的 序列变异体的直接判断，简化了检测过程，使结果判断更方便，减少了检测时间，还提高了 检测效率。本实用新型检测装置可以根据实际检测需要，增加或减少一个或几个检测单元， 提高了检测装置的应用性。
图1为本实用新型检测装置一实施例的结构示意图；图2为图1中检测芯片单元的放大结构示意图；图3为本实用新型检测装置另一实施例的结构示意图。
具体实施方式
以下结合附图详细描述本实用新型的技术方案。本实用新型实施例仅用以说明本 实用新型的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本实用新型进行了详细说明，本领 域的普通技术人员应当理解，可以对实用新型的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱 离本实用新型技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本实用新型的权利要求范围中。图1为本实用新型HIV病毒耐药性单核苷酸多态性检测装置一实施例的结构示意 图，如图1所示，该检测装置，包括阴性对照检测芯片1、检测部件2和阳性对照检测芯片3。阴性对照检测芯片1设于检测装置的进口端4，阳性对照检测芯片3设于检测装置 的出口端5，检测部件2包括两个检测芯片单元21，22，检测芯片单元21，22的结构相同。阴性对照检测芯片1、检测芯片单元21，22和阳性对照检测芯片3互相之间通过通 道6依次连接。图2为图1中检测芯片单元21的放大结构示意图，如图2所述，检测芯片单元21 设有入口 201、出口 202和微通道203，检测芯片单元21还包括由PDMS制成的盖片204盖于 微通道203上。微通道203包括折线段211，212，213，214，215。折线段的增加能延长待检 标记核酸分子在微通道203当中的滞留时间，使探针分子与待检标记核酸分子充分结合。本实施例中，阴性对照核酸分子固定于阴性对照检测芯片1上，阳性对照核酸分 子固定于阳性对照检测芯片3上，一对SNP探针分子分别固定在检测芯片单元21，22上。磁性纳米材料对PCR扩增后的HIV病毒cDNA进行标记，再把含有待检标记核酸分 子的溶液由本实例的检测装置的进口端111加入，出口端112与抽气机连接，使待检标记分 子依次经过阴性对照检测芯片1、检测芯片单元21、检测芯片单元22和阳性对照检测芯片 3。然后用磁感应检测器对各个检测芯片单元进行探测。若探测到待检标记核酸分子若与阴性对照检测芯片1上的核酸结合，表明待检标记核酸分子来源的HIV病毒不具有抗药性；若待检标记核酸分子与检测芯片单元21，22有 结合，表明待检标记核酸分子来源的HIV病毒存在位点突变，具有抗药性，若待检标记核酸 分子与阳性对照检测芯片3上的核酸结合，表明待检标记核酸分子具有1个位点的碱基 突变，通过已知的药物和核酸分子序列的关系就能确定该HIV病毒对哪一种药物具有抗药 性。图3为本实用新型HIV病毒耐药性单核苷酸多态性检测装置另一实施例的结构示 意图，如图3所示，该检测装置，包括阴性对照检测芯片1、检测部件2和阳性对照检测芯片 3。阴性对照检测芯片1设于检测装置的进口端4，阳性对照检测芯片3设于检测装置 的出口端5，检测部件2包括两个检测芯片单元21，22，23，24，检测芯片单元21，22，23，24 的结构相同。阴性对照检测芯片1、检测芯片单元21，22，23，24和阳性对照检测芯片3互相之间 通过通道6依次连接。本实施例中，阴性对照核酸分子固定于阴性对照检测芯片1上，阳性对照核酸分 子固定于阳性对照检测芯片3上，一对SNP探针分子分别固定在检测芯片单元21，23上，不 同位点的另一对SNP探针分子分别固定在检测芯片单元22，24上。磁性纳米材料对PCR扩增后的HIV病毒cDNA进行标记，再把含有待检标记核酸分 子的溶液由本实例的检测装置的进口端111加入，出口端112与抽气机连接，使待检标记分 子依次经过阴性对照检测芯片1、检测芯片单元21、检测芯片单元22和阳性对照检测芯片 3。然后用磁感应检测器对各个检测芯片单元进行探测。若探测到待检标记核酸分子若与阴性对照检测芯片1上的核酸结合，表明待检标 记核酸分子来源的HIV病毒不具有抗药性；若待检标记核酸分子与检测芯片单元21，23有 结合，表明待检标记核酸分子来源的HIV病毒存在该位点有突变，若若待检标记核酸分子 与检测芯片单元22，24有结合，表明待检标记核酸分子来源的HIV病毒还在该位点有突变， 若待检标记核酸分子与阳性对照检测芯片3上的核酸结合，表明待检标记核酸分子具有2 个位点的碱基突变，通过已知的药物和核酸分子序列的关系就能确定该HIV病毒对哪一种 药物具有抗药性。
权利要求一种HIV病毒耐药性单核苷酸多态性检测装置，其特征在于包括第一对照部件，其上固定阴性对照核酸分子，用于与未发生突变的待检标记核酸分子互补结合；第二对照部件，其上固定阳性对照核酸分子，用于与发生突变的待检标记核酸分子互补结合；检测部件，用于单核苷酸多态性的检测；所述检测部件位于所述第一对照部件和所述第二对照部件之间。
2.根据权利要求1所述的HIV病毒耐药性单核苷酸多态性检测装置，其特征在于所述 检测装置还包括进口端，所述进口端与所述第一部件连接。1
3.根据权利要求1所述的HIV病毒耐药性单核苷酸多态性检测装置，其特征在于所述 检测装置还包括出口端，所述进口端与所述第二部件连接。
4.根据权利要求1所述的HIV病毒耐药性单核苷酸多态性检测装置，其特征在于所述 检测部件包括1个以上的检测单元，所述检测单元设有微通道。
5.根据权利要求4所述的HIV病毒耐药性单核苷酸多态性检测装置，其特征在于所述 微通道的平均径宽为20-200 μ m。
6.根据权利要求4所述的HIV病毒耐药性单核苷酸多态性检测装置，其特征在于所述 微通道的平均径宽为50-180 μ m。
7.根据权利要求4所述的HIV病毒耐药性单核苷酸多态性检测装置，其特征在于所述 微通道的平均径宽为70-150 μ m。
8.根据权利要求4所述的HIV病毒耐药性单核苷酸多态性检测装置，其特征在于所 述微通道的平均径宽选自于 70μπι、75μπι、80μπι、75μπι、90μπι、95μπι、100μπι、105μπι、 110 μ m、115 μ m、120 μ m、125 μ m、130 μ m、135 μ m、140 μ m、145 μ m 或 150 μ m。
9.根据权利要求4所述的HIV病毒耐药性单核苷酸多态性检测装置，其特征在于所述 检测单元还包括疏水性材质制成的盖板盖于所述检测单元主体。
10.一种HIV病毒耐药性单核苷酸多态性检测装置，其特征在于包括设于所述检测装 置上的进口端、设于所述检测装置上的出口端、阴性对照检测芯片、阳性对照检测芯片和检 测部件；所述阴性对照检测芯片与所述检测装置的进口端连接，所述阳性对照检测芯片与 所述检测装置的出口端连接，所述检测部件设于所述阴性对照检测芯片和所述阳性对照检 测芯片之间；所述检测部件包括2的整数倍个检测单元。
专利摘要一种HIV病毒耐药性单核苷酸多态性检测装置，包括对照部件和检测部件。对照部件上结合有阳性对照核酸分子或阴性对照核酸分子。检测部件包括若干个检测单元，每个检测单元上结合有单一的探针分子，探测分子能与待检核酸分子上单碱基突变位点互补结合。本实用新型在每个检测单元上结合单一的探针分子，待检标记核酸分子分别与探针分子结合，再使用磁感应检测器感应检测单元的磁性，就能直接判断待检核酸分子的突变位点，实现对HIV病毒耐药性相关的序列变异体的直接判断，简化了检测过程，使结果判断更方便，减少了检测时间，还提高了检测效率。
文档编号C12Q1/70GK201756553SQ20102029400
公开日2011年3月9日 申请日期2010年8月17日 优先权日2010年8月17日
发明者崔大祥, 王贤松 申请人:上海交通大学;苏州康立达纳米生物工程有限公司