专利名称：黄素结合型葡萄糖脱氢酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及以黄素化合物为辅酶的新的黄素结合型葡萄糖脱氢酶及其制造法。
背景技术：
血中葡萄糖浓度(血糖值)是糖尿病的重要标记。作为用于糖尿病患者管理自己血糖值的装置，正在广泛利用使用了电化学生物传感器的自我血糖监测(Self Monitoring of Blood Glucose =SMBG)仪器。SMBG仪器中所用的生物传感器一直以来使用的是葡萄糖氧化酶(GOD)等以葡萄糖为底物的酶。然而，GOD具有以氧为电子受体的特性，因此使用了 GOD的SMBG仪器中，可能发生测定样品中的溶解氧对测定值产生影响、无法获得准确测定值的情况。另一方面作为以葡萄糖为底物但并非以氧为电子受体的其它酶，已知有各种葡萄糖脱氢酶(以下记为GDH)。具体而言，已发现以烟酰胺二核苷酸(NAD)、烟酰胺二核苷酸磷酸(NADP)为辅酶的类型的GDH (NAD⑵-GDH)、以吡咯喹啉醌(PQQ)为辅酶的 ⑶H(PQQ-GDH)，并已用于SMBG仪器的生物传感器中。然而，NAD(P)-GDH存在缺乏酶稳定性且必须添加辅酶的问题，另外PQQ-GDH底物特异性低，除与作为测定对象的葡萄糖作用以外，还与麦芽糖、D-半乳糖和D-木糖等糖化合物作用，因此存在测定样品中的葡萄糖以外的糖化合物影响测定值而无法获得准确测定值的问题。近年来，报告了如下例子在使用以PQQ-GDH作为生物传感器的SMBG仪器测定接受输液给药的糖尿病患者的血糖值时，PQQ-GDH还与输液中所含的麦芽糖作用，获得高于实际血糖值的测定值，基于该值进行处置，而导致患者发生低血糖症等。另外，已经明确在正在实施半乳糖负荷试验和木糖吸收试验的患者中也可能发生上述情况(例如参照非专利文献1)。基于该情况，日本厚生劳动省医药食品局为了调查当葡萄糖溶液中添加有各糖类时对血糖测定值的影响而进行了交差反应性试验，结果在添加600mg/dL的麦芽糖、300mg/ dL的D-半乳糖、或200mg/dL的D-木糖的情况下，使用PQQ-GDH法的血糖测定试剂盒的测定值显示出比实际葡萄糖浓度高约2. 5 3倍的值。S卩，已经明确待测试样中可能存在的麦芽糖、D-半乳糖、D-木糖导致测定值变得不准确，迫切希望开发出一种不受这类会导致测定误差的糖化合物的影响、能够特异性测定葡萄糖的底物特异性高的GDH。在上述这样的背景之下，已经着眼于利用上述以外辅酶的类型的⑶H。例如非专利文献2 5中虽然没有关于底物特异性的详细记载，但存在对来源于米曲霉的GDH的报告。在专利文献1 3中公开了以来源于曲霉属的黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)为辅酶的葡萄糖脱氢酶(FAD-GDH)，专利文献4中公开了使对D-木糖的作用性降低的来源于曲霉属的 FAD-GDH。专利文献1 4中虽已记载了对于D-葡萄糖外的1种或多种糖化合物的反应性低的FAD-GDH，但具有对麦芽糖、D-半乳糖、D-木糖中的任一者反应性都足够低的特性的黄素结合型GDH尚且未知。另外，在存在D-葡萄糖、麦芽糖、D-半乳糖、D-木糖的条件下能够不受上述糖化合物的影响而准确测定葡萄糖浓度的黄素结合型GDH也是未知的。
专利文献1 日本特开2007-289148号公报专利文献2 国际公开第04/058958号小册子专利文献3 国际公开第07/139013小册子专利文献4 日本特开2008-237210号公报非专利文献1 医薬品·医療用具等安全性情報206号(Pharmaceuticals and Medical Devices Safety Information No. 206)、2004 年 10 月、日本厚生劳动省医药食品
局非专利文献 2 :Studies on the glucose dehydrogenase of Aspergillus oryzae.I.Induction of its synthesis by p-benzoquinone and hydroquinone, T. C. Bak, and R. Sato, Biochim. Biophys. Acta,139,265-276(1967).非专利文献 3 :Studies on the glucose dehydrogenase of Aspergillus oryzae. II. Purification and physical and chemical properties, T. C. Bak, Biochim. Biophys. Acta,139，277-293(1967) ·非专利文献 4 :Studies on the glucose dehydrogenase of Aspergillus oryzae.III. General enzymatic properties, T.C.Bak, Biochim. Biophys. Acta,146, 317-327(1967).非专利文献 5 :Studies on the glucose dehydrogenase of Aspergillus oryzae. IV. Histidyl residue as an active site, T. C. Bak, and R. Sato, Biochim. Biophys. Acta,146，328-335(1967).
发明内容
发明要解决的问题本发明的课题在于提供对D-葡萄糖特异性高、即使在D-葡萄糖以外的糖化合物共存的条件下也能准确测定D-葡萄糖量的新的GDH。用于解决问题的方案为了解决上述课题，本发明人等反复进行了深入研究，对生产能够准确测定葡萄糖量的新的GDH的微生物实施筛选，结果从属于毛霉亚门的菌株中发现一种新的GDH，该 GDH具有GDH活性，对葡萄糖特异性高，即使在葡萄糖以外的糖化合物共存的条件下进行测定时也能够准确测定葡萄糖。并且，对上述的新的GDH进行纯化并确定其各种性质，确认其为新的黄素结合型GDH，实际实施在麦芽糖、D-半乳糖、D-木糖存在下的D-葡萄糖的测定， 并获得了该新的GDH的氨基酸序列和编码其的基因序列信息，从而完成了本发明。即，本发明如下所述。(1)黄素结合型⑶H，其具有以下⑴ (iii)的性质(i)作用在电子受体存在下显示⑶H活性；(ii)分子量蛋白质的多肽链部分的分子量为约SOkDa ；(iii)底物特异性与对D-葡萄糖的反应性相比，对麦芽糖、D-半乳糖和D-木糖的反应性低。(2)根据上述(1)所述的黄素结合型⑶H，在设对D-葡萄糖的反应性为100%时， 对麦芽糖、D-半乳糖和D-木糖的反应性均为2%以下。
(3)根据上述⑴或(2)所述的黄素结合型GDH，设不存在以下(a) (c)时对 D-葡萄糖的反应性为100%，在存在以下(a) (c)的糖化合物中的1种以上时对D-葡萄糖的反应性为96% 104%，(a)麦芽糖，(b) D-半乳糖，(c) D-木糖。(4)根据上述⑴ (3)中任意一项所述的黄素结合型⑶H，其最适pH为pH6. 5 7. 0，最适温度为37 40°C，稳定pH范围为pH3. 5 7. 0，在40°C热处理15分钟后具有 80%以上的残存活性。(5)根据上述(1) (4)中任意一项所述的黄素结合型GDH，其来源于被分类为毛霉亚门、优选毛霉纲、更优选毛霉目、进一步优选毛霉科的微生物。(6)根据上述(5)所述的黄素结合型GDH，其来源于被分类为毛霉(Mucor)属的微生物。(7)上述(1) (6)中任意一项所述的黄素结合型GDH的制造方法，其特征在于， 在培养基中培养被分类为毛霉(Mucor)属的微生物，从该微生物菌体采集黄素结合型GDH。(8)根据上述(7)所述的黄素结合型GDH的制造方法，微生物为选自普雷恩毛霉 (Mucor prainii)、爪卩圭毛霉(Mucor javanicus)、卷枝毛霉原变型(Mucor circinelloides f. circinelloides)中的1种以上微生物。(9)根据上述(1) (6)中任意一项所述的黄素结合型GDH，其特征在于，其具有 序列号1或序列号3所示的氨基酸序列、或与该氨基酸序列80%以上同源的氨基酸序列、或在该氨基酸序列中缺失、置换或添加1个或多个氨基酸而成的氨基酸序列。(10)由选自以下的㈧ (E)组成的组中的任意一个DNA构成的黄素结合型⑶H 基因(A)编码序列号1所示的氨基酸序列的DNA ；(B)由序列号2所示的碱基序列构成的DNA ；(C)编码序列号3所示的氨基酸序列的DNA ；(D)由序列号4所示的碱基序列构成的DNA ；(E)具有与序列号2或序列号4所示的碱基序列80%以上同源的碱基序列且编码具有黄素结合型GDH酶活性的蛋白质的DNA。(11)重组体DNA，其特征在于，其是在载体DNA中插入上述(10)所述的黄素结合型⑶H基因而成的。(12)导入有上述(11)所述的重组体DNA的转化体。(13)与对D-葡萄糖的反应性相比，对麦芽糖、D-半乳糖、D-木糖的反应性低的黄素结合型GDH的制造方法，其特征在于，培养含有上述(10)所述的黄素结合型GDH基因或上述(11)所述的重组体DNA且具有生产黄素结合型⑶H能力的微生物，从该培养物采集黄素结合型⑶H。发明的效果根据本发明的黄素结合型GDH，能够准确测定D-葡萄糖量，而不会受待测试样所含的麦芽糖、D-半乳糖、D-木糖等糖化合物的影响。从而即使对于正接受含有麦芽糖的输液给药的患者、正在实施半乳糖负荷试验和木糖吸收试验的患者的试样也能准确测定血糖值。
图1是表示本发明的黄素结合型GDH的吸收光谱的图。图2是表示本发明的黄素结合型⑶H的最适pH的图。图3是表示本发明的黄素结合型⑶H的最适温度的图。图4是表示本发明的黄素结合型GDH的热稳定性的图。图5是表示本发明的黄素结合型GDH的pH稳定性的图。图6是本发明的黄素结合型⑶H的SDS-聚丙烯酰胺电泳结果。图7是表示使用本发明的黄素结合型GDH测得的、D-葡萄糖量的测定结果的图。
具体实施例方式(黄素结合型⑶H的底物特异性)本发明的黄素结合型GDH，其特征在于，底物特异性优异，对D-葡萄糖的选择性极高。具体而言，本发明的黄素结合型GDH对麦芽糖、D-半乳糖、D-木糖的反应性极低。具体而言，特征在于，在设对D-葡萄糖的反应性为100%时，对麦芽糖、D-半乳糖和D-木糖的反应性均为2%以下。本发明的黄素结合型GDH由于具有如此高的底物特异性，因此即使对于正接受含有麦芽糖的输液给药的患者、正在实施半乳糖负荷试验和木糖吸收试验的患者的试样，也能准确测定D-葡萄糖量，而不会受待测试样所含的麦芽糖、D-半乳糖、D-木糖等糖化合物的影响。如上所述，本发明的黄素结合型GDH，其特征在于，在使用麦芽糖、D-半乳糖、D-木糖等糖化合物代替D-葡萄糖作为底物进行测定时的测定值非常低，进而即使在混杂有麦芽糖、D-半乳糖、D-木糖等糖化合物的条件下也能准确测定葡萄糖测定值。具体而言，其特征在于，将不存在上述混杂糖化合物的条件下对D-葡萄糖的反应性设为100%时，存在作为混杂糖化合物的选自麦芽糖、D-半乳糖、D-木糖中的1种以上时的测定值为96% 103%，即使作为混杂糖化合物的麦芽糖、D-半乳糖和D-木糖这3种同时存在时测定值也为96% 104%。在使用具有这种特性的黄素结合型GDH的情况下，即使是待测试样中存在麦芽糖、D-半乳糖、D-木糖的情况下也能够准确测定葡萄糖量，故而优选。(本发明的黄素结合型GDH的酶化学特征)作为本发明的黄素结合型GDH的优选的酶的例子可列举出具有以下酶化学特征的酶。(1)作用在电子受体存在下显示⑶H活性(2)分子量蛋白质的多肽链部分的分子量为约SOkDa(3)底物特异性与对D-葡萄糖的反应性相比，对麦芽糖、D-半乳糖、D-木糖的反应性低(4)最适 pH :pH6. 5 7. 0(5)最适温度37 40°C(6)稳定 pH 范围:pH3. 5 7. 0
(7)热稳定性在40°C热处理15分钟后具有80%以上的残存活性(8)以黄素化合物为辅酶(9) Km值对D-葡萄糖的Km值为26 33mM只要是具有上述这样的酶化学特征的GDH，则能够准确测定D-葡萄糖量，而不会受待测试样所含的麦芽糖、D-半乳糖、D-木糖等糖化合物的影响。另外，由于能够在用于血糖值的测定等临床诊断的合适PH范围、温度范围内良好作用，因此能够适合用于诊断用测定试剂等用途。此外，上述各种性质参数为典型的例子，在规定的测定条件下进行D-葡萄糖的测定时，在能够实现本发明效果的范围内，上述参数中具有可允许的变动幅度。例如稳定PH 范围、最适PH范围、最适温度范围等参数在包含规定的测定条件的范围内既可以比上述典型的范围稍宽，相反也可以比上述典型的范围稍窄，只要在测定条件下确保充分的活性和/ 或稳定性即可。通常Km值越小则底物特异性越好，但作为本发明的酶，只要在规定的测定条件下具有实质上能够实现充分选择底物的范围的值即可。上述各种酶化学性质可通过使用用于鉴定酶的各种性质的公知手法、例如以下实施例所述的方法进行调查。酶的各种性质可在生产本发明的黄素结合型GDH的微生物的培养液、纯化工序过程中的某个阶段进行某种程度地调查，更详细而言，可使用纯化酶进行调查。纯化酶是指被分离为实质不含该酶以外的成分、特别是该酶以外的蛋白质(混杂蛋白质)的状态的酶。具体而言，例如以重量换算，混杂蛋白质的含量小于全体的约20%、 优选小于约10%、更优选小于约5%、进一步优选小于约1%。此外，本说明书中后述的 "Mp⑶H”、“Mj⑶H”和“Mc⑶H”只要未特别限定则指纯化酶。本发明的黄素结合型GDH所利用的电子受体没有特别限定，例如可使用作为适合用于血糖值测定的试剂成分而公知的任意电子受体。本发明的黄素结合型GDH所利用的辅酶的特征在于，其为黄素化合物。黄素化合物可列举例如黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)、黄素单核苷酸(FMN)等。作为本发明的黄素结合型GDH的优选的酶的例子，可列举出用SDS-聚丙烯酰胺电泳测定时蛋白质的多肽链部分的分子量为约SOkDa的黄素结合型GDH。此外，考虑到本发明的黄素结合型GDH中结合有糖链，在未进行除去糖链的操作的情况下，具有用SDS-聚丙烯酰胺电泳测定时测得的分子量比该数值大的倾向。作为本发明的黄素结合型GDH的优选的酶的例子，可列举出对D-葡萄糖的Km值为26 33mM的黄素结合型⑶H。(黄素结合型GDH的作用原理和活性测定法)本发明的黄素结合型GDH在电子受体存在下催化将葡萄糖的羟基氧化而生成葡糖酸-S -内酯的反应。因此，可利用该原理，通过使用例如吩嗪硫酸甲酯(PMS)和2，6- 二氯靛酚(DCIP) 作为电子受体的以下测定体系，测得本发明的黄素结合型GDH的活性。(反应1)D-葡萄糖+PMS (氧化型)— D-葡糖酸-δ -内酉旨+PMS (还原型)(反应2)PMS (还原型)+DCIP (氧化型)
— PMS+DCIP (还原型)首先，在(反应1)中随着葡萄糖的氧化而生成PMS(还原型)。通过随后进行的 (反应幻，在氧化PMS的同时，DCIP被还原，因此可由600nm的波长的吸光度变化量测定氧化型DCIP的消失。具体而言，在本发明中，黄素结合型GDH的活性可按照下述步骤进行测定。将 1. 79mL IOOmM 磷酸缓冲液(ρΗ7. 0)、0. 08mL 1. 25M D-葡萄糖溶液和 0. OlmL 20mM DCIP 溶液混合，于37°C保温5分钟。接着，添加0.02mL 20mM PM S溶液和0. ImL酶样品溶液，开始反应。测定反应开始时的吸光度和经时性的吸光度，求出随酶反应的进行600nm处吸光度的每分钟减少量(ΔΑ600)，按照下式计算黄素结合型GDH活性。此时，黄素结合型GDH活性是将37°C下存在浓度50mM的D-葡萄糖时1分钟内还原1 μ mol的DCIP的酶量定义为IU。[数学式1]
权利要求
1.黄素结合型葡萄糖脱氢酶，其具有以下(i) (iii)的性质(i)作用在电子受体存在下显示葡萄糖脱氢酶活性；( )分子量蛋白质的多肽链部分的分子量为约SOkDa ；(iii)底物特异性与对D-葡萄糖的反应性相比，对麦芽糖、D-半乳糖和D-木糖的反应性低。
2.根据权利要求1所述的黄素结合型葡萄糖脱氢酶，在设对D-葡萄糖的反应性为 100%时，对麦芽糖、D-半乳糖和D-木糖的反应性均为2%以下。
3.根据权利要求1或2所述的黄素结合型葡萄糖脱氢酶，设不存在以下(a) (c)时对D-葡萄糖的反应性为100%，在存在以下(a) (c)的糖化合物中的1种以上时对D-葡萄糖的反应性为96% 104%，(a)麦芽糖，(b)D-半乳糖，(c)D-木糖。
4.根据权利要求1 3中任意一项所述的黄素结合型葡萄糖脱氢酶，其最适pH为 pH6. 5 7. 0，最适温度为37 40°C，稳定pH范围为pH3. 5 7. 0，在40°C热处理15分钟后具有80%以上的残存活性。
5.根据权利要求1 4中任意一项所述的黄素结合型葡萄糖脱氢酶，其来源于被分类为毛霉亚门、优选毛霉纲、更优选毛霉目、进一步优选毛霉科的微生物。
6.根据权利要求5所述的黄素结合型葡萄糖脱氢酶，其来源于被分类为毛霉(Mucor) 属的微生物。
7.权利要求1 6中任意一项所述的黄素结合型葡萄糖脱氢酶的制造方法，其特征在于，在培养基中培养被分类为毛霉(Mucor)属的微生物，从该微生物菌体采集黄素结合型葡萄糖脱氢酶。
8.根据权利要求7所述的黄素结合型葡萄糖脱氢酶的制造方法，微生物为选自于普雷恩毛霉(Mucor prainii)、爪哇毛霉(Mucor javanicus)、卷枝毛霉原变型(Mucor circinelloides f. circinelloides)中的 1 种以上微生物。
9.根据权利要求1 6中任意一项所述的黄素结合型葡萄糖脱氢酶，其特征在于，其具有序列号1或序列号3所示的氨基酸序列、或与该氨基酸序列80%以上同源的氨基酸序列、或在该氨基酸序列中缺失、置换或添加1个或多个氨基酸而成的氨基酸序列。
10.由选自以下的㈧ (E)组成的组中的任意一个DNA构成的黄素结合型葡萄糖脱氢酶基因(A)编码序列号1所示的氨基酸序列的DNA；(B)由序列号2所示的碱基序列构成的DNA;(C)编码序列号3所示的氨基酸序列的DNA；(D)由序列号4所示的碱基序列构成的DNA;(E)具有与序列号2或序列号4所示的碱基序列80%以上同源的碱基序列且编码具有黄素结合型葡萄糖脱氢酶酶活性的蛋白质的DNA。
11.重组体DNA，其特征在于，其是在载体DNA中插入权利要求10所述的黄素结合型葡萄糖脱氢酶基因而成的。
12.导入有权利要求11所述的重组体DNA的转化体。
13.与对D-葡萄糖的反应性相比，对麦芽糖、D-半乳糖、D-木糖的反应性低的黄素结合型葡萄糖脱氢酶的制造方法，其特征在于，培养含有权利要求10所述的黄素结合型葡萄糖脱氢酶基因或权利要求11所述的重组体DNA且具有生产黄素结合型葡萄糖脱氢酶能力的微生物，从该培养物采集黄素结合型葡萄糖脱氢酶。
全文摘要
本发明提供一种对D-葡萄糖的底物特异性高的黄素结合型葡萄糖脱氢酶。一种属于毛霉(Mucor)属的微生物来源的、新的黄素结合型葡萄糖脱氢酶，特征在于，与对D-葡萄糖的反应性相比，对麦芽糖、D-半乳糖、D-木糖的反应性低，不易受上述糖化合物的影响。该酶不易受溶解氧的影响，即使在试样中存在葡萄糖以外的糖化合物的情况下也能准确测定葡萄糖量。
文档编号C12N15/09GK102292439SQ20108000494
公开日2011年12月21日 申请日期2010年4月19日 优先权日2009年6月4日
发明者一柳敦, 吉村太郎, 市川惠一, 田岛辽子 申请人:龟甲万株式会社