专利名称：一种抗神经退行性疾病活性物质的制备方法
技术领域：
本发明涉及天然产物技术领域，尤其涉及一种从红树耐盐内生真菌中提取具有显著抗神经退行性疾病活性物质的方法。
背景技术：
神经退行性疾病包括阿尔茨采默病(Alzheimer，s disease，AD)、帕金森病 (Parkinson' s disease，PD)、亨廷顿舞蹈病(Huntington，s disease，HD)等，是一种临床上的多发病和常见病，主要症状包括进行性记忆和认知功能障碍、运动障碍等等。一旦发病，会给患者、家庭及社会造成极大的精神和经济负担。随着人类社会年龄结构老龄化，神经退行性疾病发病率日趋升高，已成为仅次于心脑血管疾病和肿瘤的第三大世界性健康问题。近年来人们对神经退行性疾病的发病机理进行了大量研究，也对其发病机理提出了一些不同的假设，如关键蛋白的缠结及聚集、氧化应激、生物金属离子稳态失衡、线粒体功能衰竭、遗传因素等。然而，神经退行性疾病的发病原因及发生机制目前尚不十分明确。 已有研究结果显示，神经退行性疾病相关关键蛋白的聚集沉淀在发病过程中具有重要调节作用，如AD的发病即与Αβ (beta-amyloid)等关键蛋白的聚集、沉淀、以及寡聚体产生的细胞毒性直接相关，Αβ蛋白的过量表达和聚集、沉淀可以直接导致线粒体紊乱、氧化应激、神经突触传递中断、轴突运输中断、膜完整性受损破裂等多种AD相关病理变化，而HD的发病与Poly Q的聚集直接相关等。因此，神经退行性疾病相关蛋白的聚集沉淀已成为研究神经退行性疾病发病机理及抗神经退行性疾病药物最重要的靶标之一。虽然神经退行性疾病相关蛋白通过β片状折叠交联聚集形成不溶性纤维，最终以块状高聚体形式出现并导致神经细胞的死亡。但最近研究结果证明，在形成不溶性纤维过程中产生的可溶性蛋白寡聚体才是真正体现其神经毒性的物质。因此，与研究纤维或块状高聚体的聚集抑制剂相比，探讨如何筛选研究神经退行性疾病相关蛋白寡聚体的聚集抑制剂对于抗神经退行性疾病活性成分研究具有更重要的理论意义和价值。与神经退行性疾病治病机理研究的慢慢深入相比，抗神经退行性疾病药物相关研究则明显滞后，迄今为止临床上尚无针对病因的特效治疗药物。现有药物对神经退行性疾病的病情只有一定的辅助效果，在一定程度上能够延缓病情的恶化，但都不能逆转病情，如抗AD药物为例，现有乙酰胆碱酯酶抑制剂(IChEIs)如tacrine、don印ezil、huperzine、 ENA-713、fuperdin A等及近几年用于临床的非竞争性NMDA受体拮抗剂盐酸美金刚 (memantine)等药物都仅有一定的辅助治疗效果，很多情况下还会引起乙酰胆碱相关不良反应。因此，研究发现新的、特殊生境抗神经退行性疾病药用资源并从中发现结构新颖、作用独特的新型活性成分对于抗神经退行性疾病先导药物的研究极为重要，是解决神经退行性疾病新药研发的核心手段之一。红树林是介于海洋生态和陆地生态之间的一种非常特殊的生态区域。受红树林高度盐责化、土壤的缺氧、高光辐射及周期性的海水浸淹等独特生长环境的影响，极为丰富又极具特色的红树林微生物资源已成为最独特的海洋药用资源之一。自1993年从太平洋紫杉(短叶红豆杉)中分离得到能够产生新型活性物质的内生真菌Taxamyces andrenae后， 红树林植物内生真菌活性物质的研究引起了人们的极大兴趣。目前，国内外已经在红树内生真菌次生代谢产物中分离鉴定了多个结构独特、新颖的化合物，在肿瘤、病毒、抗菌等重大疾病防治方面都有较大的应用前景。其中从Kandelia candel树皮内生真菌菌体中分离鉴定的sporothrinsA和Xylaria sp.代谢产物Xyloketal A-D对乙酰胆碱酯酶有较强的抑制作用。这就进一步证明红树内生真菌及其代谢物作为抗神经退行性疾病新药研究的资源具有极大的开发价值。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种从红树耐盐内生真菌中提取制备具有显著抗神经退行性疾病活性物质的制备方法，提取制备所得组分具有较强的神经退行性疾病关键蛋白聚集抑制活性。本发明所述的红树耐盐性内生真菌已经中国科学院微生物研究所鉴定为 Phomopsis occulta,隐藏拟茎点霉，其于2011年2月23日保藏于湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心，即中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC M2011044。 本实验室对其命名为SN3-2。为达到上述目的，本发明采用如下技术方案一种抗神经退行性疾病活性物质的制备方法，包括以下步骤1)红树耐盐内生真菌在含有0-3M NaCl的基础培养液中发酵，过滤，收集菌体；2)菌体低温、真空干燥；3)菌体用甲醇浸取；4)甲醇浸取液低温蒸除甲醇后用水和正丁醇分配萃取；5)水相部分浓缩后用Diaion-20树脂柱层析，以水和甲醇为流动相，采用梯度洗脱，以-60%甲醇含量的流动相洗脱，得到具有抗神经退行性疾病活性的流分。所述步骤2、具体为菌体在40°C恒温真空干燥箱内减压低温干燥M小时。所述步骤3)具体为干燥后菌体用甲醇浸泡，超声15分钟，浸渍3天，重复3次， 过滤合并提取液，45 V减压蒸除甲醇得菌体提取物水溶液。所述步骤4)具体为菌体提取物水溶液中加入两倍体积的纯净水，然后用4/3总体积的正丁醇进行萃取，重复4次，正丁醇部分水洗1次，合并各水相部分，45°C减压浓缩至总体积500毫升，得菌体水溶性提取物。本发明的第二目的在于提供一种抗神经退行性疾病活性物质，其由上述方法制备而成。利用本发明所述方法制备的的抗神经退行性疾病活性物质，以体外Αβ 42聚集模型、Poly Q聚集模型进行神经退行性疾病关键蛋白聚集抑制活性筛选和研究，该活性物质具有很强的聚集抑制作用。利用本发明所述方法制备的抗神经退行性疾病活性物质的有效成分具有较好的水溶性，在水溶液、有机溶液、中性条件、弱酸碱条件下都比较稳定，在70°C处理120min后仍然保留95%以上的活性。
本发明所述的红树耐盐性内生真菌Wiomopsis occulta具有较强的抗神经退行性疾病，其次生代谢产物中含有大量以神经退行性疾病关键蛋白Ai3 42、Poly Q等的聚集为靶点的抗聚集类活性成分，具备从中发现新型抗神经退行性疾病先导药物的巨大潜力，将为新型抗神经退行性疾病药物的研究提供支持。本发明所述方法及其产物对抗神经退行性疾病特效药物的研究及我国南海红树资源的深度开发具有极为重要的意义和价值。
图1为本发明所述活性物质体外A β 42聚集模型研究结果。图2为本发明所述活性物质体外Poly Q聚集模型研究结果。
具体实施例方式本发明整体思路包括以下几点1)红树耐盐内生真菌发酵；幻从发酵菌体中提取抗神经退行性疾病活性物质；幻检测活性物质对神经退行性疾病关键蛋白聚集抑制的活性；以上各点皆为单独实施例，以下将结合具体实施例做进一步详细说明。实施例1红树耐盐内生真菌发酵(一 )培养基及配制基础培养液蛋白胨(ρ印tone) 0.3%，硫酸铵0.2%，酵母膏0.05%，磷酸二氢钾 0. 4%，氯化钙0. 03%，七水硫酸镁0. 03%，葡萄糖10g/L，分别加入不同量的NaCl，使其 NaCl 含量分别为 0-3M。0. IMPa, 121°C灭菌 30min。(二)发酵本发明所述红树耐盐性内生真菌SN3-2分别转接到含0、1、2、3M NaCl的真菌基础培养液中，各50L，进行胁迫培养，25°C静置发酵40天，得到发酵液。实施例2本发明所述红树耐盐内生真菌抗神经退行性疾病活性物质制备方法(1)实施例1得到的发酵液以9层纱布减压抽滤，收集菌体；(2)菌体在40°C恒温真空干燥箱内减压低温干燥M小时；(3)干燥后菌体用3L甲醇浸泡，超声15分钟，浸渍3天，重复3次，过滤合并提取液，45°C减压整除甲醇得菌体提取物水溶液；(4)菌体提取物水溶液中加入两倍体积的纯净水，然后用4/3总体积的正丁醇进行萃取，重复4次，正丁醇部分水洗1次，合并各水相部分，45°C减压浓缩至总体积500毫升，得菌体水溶性提取物；(5)装填Diaion-20树脂层析柱，柱体积为300毫升，用菌体水溶性提取物以每小时2倍柱体积的速度上样，然后以水和甲醇为流动相组成开始柱层析洗脱，流动相组成为 0%甲醇-60%甲醇所得流分具有较高的神经退行性疾病关键蛋白聚集抑制活性。实施例3本发明所述红树耐盐内生真菌抗神经退行性疾病活性的体外A β 42聚集模型筛选研究ThT分析使用合成A β 42多肽，37°C静置2小时，加入终浓度100 μ g/mL各样品，用荧光酶标仪测试反应体系的荧光强度，激发波长为444nm，发射波长为485nm。以DMSO为阴性对照，EGCG为阳性对照，根据体系荧光强度的差异即可判断组分对A-beta聚集的抑制活性。实验结果参见图1。实验结果说明多个样品相对荧光强度较低，对A_beta42聚集具有显著抑制作用，部分样品抑制作用强于阳性对照样品EGCG或与之接近。实施例4本发明所述红树耐盐内生真菌抗神经退行性疾病活性的体外Poly Q聚集模型筛选研究ThT分析使用纯化Poly Q蛋白，37°C静置2小时，加入终浓度100 μ g/mL各样品， 用荧光酶标仪测试反应体系的荧光强度，激发波长为444nm，发射波长为485nm。以DMSO为阴性对照，EGCG为阳性对照，根据体系荧光强度的差异即可判断组分对Poly Q聚集的抑制活性。实验结果参见图2。实验结果说明多个样品相对荧光强度较低，对Poly Q聚集具有显著抑制作用，部分样品抑制作用与阳性对照样品EGCG接近。
权利要求
1.一种抗神经退行性疾病活性物质的制备方法，包括以下步骤1)红树耐盐内生真菌在含有0-3MNaCl的基础培养液中发酵，过滤，收集菌体；2)菌体低温、真空干燥；3)菌体用甲醇浸取；4)甲醇浸取液低温蒸除甲醇后用水和正丁醇分配萃取；5)水相部分浓缩后用Diaion-20树脂柱层析，以水和甲醇为流动相，采用梯度洗脱，以 1% -60%甲醇含量的流动相洗脱，得到具有抗神经退行性疾病活性的流分。
2.根据权利要求1所述的一种抗神经退行性疾病活性物质的制备方法，其特征在于 所述红树耐盐内生真菌的保藏编号为CCTCC M2011044。
3.根据权利要求1或2所述的一种抗神经退行性疾病活性物质的制备方法，其特征在于，所述步骤2、具体为菌体在40°C恒温真空干燥箱内减压低温干燥M小时。
4.根据权利要求1或2所述的一种抗神经退行性疾病活性物质的制备方法，其特征在于，所述步骤幻具体为干燥后菌体用甲醇浸泡，超声15分钟，浸渍3天，重复3次，过滤合并提取液，45 °C减压蒸除甲醇得菌体提取物水溶液。
5.根据权利要求1或2所述的一种抗神经退行性疾病活性物质的制备方法，其特征在于，所述步骤4)具体为菌体提取物水溶液中加入两倍体积的纯净水，然后用4/3总体积的正丁醇进行萃取，重复4次，正丁醇部分水洗1次，合并各水相部分，45°C减压浓缩至总体积 500毫升，得菌体水溶性提取物。
6.权利要求1-5任一项所述方法制备的抗神经退行性疾病活性物质。
全文摘要
本发明涉及天然产物技术领域，尤其涉及一种从红树耐盐内生真菌中提取具有抗神经退行性疾病活性物质的方法。包括以下步骤1)红树耐盐内生真菌发酵培养，过滤，收集菌体；2)菌体低温、真空干燥；3)菌体用甲醇浸取；4)甲醇浸取液低温蒸除甲醇后用水和正丁醇分配萃取；5)水相部分浓缩后用Diaion-20树脂柱层析，以水和甲醇为流动相，采用梯度洗脱，得到具有显著抗神经退行性疾病活性的流分。以体外Aβ42聚集模型、Poly Q聚集模型进行抗神经退行性疾病活性筛选和研究，该活性物质具有很强的神经退行性疾病关键蛋白聚集抑制作用。
文档编号C12N1/14GK102309528SQ201110177790
公开日2012年1月11日 申请日期2011年6月28日 优先权日2011年6月28日
发明者吴海强, 郑易之, 黄健子 申请人:深圳大学