专利名称：一种具有神经退行性疾病防治活性的海洋红树耐盐性内生真菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及海洋微生物的应用及神经退行性疾病防治活性成分的研究，具体的说是一种具有神经退行性疾病防治活性的海洋红树耐盐性内生真菌。
背景技术：
神经退行性疾病是一种临床上的多发病和常见病，包括阿尔茨采默病 (Alzheimer' s disease, AD)、中白金森病(Parkinson ‘ s disease, PD)、亨延顿舞蹈病 (Huntington' s disease, HD)等，主要症状包括进行性记忆和认知功能障碍、运动障碍等等。随着人类社会年龄结构老龄化，神经退行性疾病发病率日趋升高，已成为仅次于心脑血管疾病和肿瘤的第三大世界性健康问题。近年来人们对神经退行性疾病的发病机理进行了大量研究，且对发病机理提出了一些不同的假设，如关键蛋白的缠结及聚集、氧化应激、生物金属离子稳态失衡、线粒体功能衰竭等。然而，神经退行性疾病的发病原因及发生机制目前尚不十分明确。已有研究结果显示，作为一大类蛋白质错误折叠病(分子构象病)，神经退行性疾病相关关键蛋白的聚集沉淀在发病过程中具有重要调节作用，如AD的发病即与Α-beta (beta-amyloid)等关键蛋白的聚集、沉淀、以及寡聚体产生的细胞毒性直接相关，A-beta蛋白的过量表达和聚集、 沉淀可以直接导致线粒体紊乱、氧化应激、神经突触传递中断、轴突运输中断、膜完整性受损破裂等多种AD相关病理变化，而HD的发病与Poly Q的聚集直接相关等。因此，神经退行性疾病相关蛋白的聚集沉淀已成为研究神经退行性疾病发病机理及神经退行性疾病治疗药物和方法最重要的靶标之一。虽然神经退行性疾病相关蛋白通过β片状折叠交联聚集形成不溶性纤维，最终以块状高聚体形式出现并导致神经细胞的死亡。但最近研究结果证明，在形成不溶性纤维过程中产生的可溶性蛋白寡聚体才是真正体现其神经毒性的物质。因此，与研究纤维或块状高聚体的聚集抑制剂相比，探讨如何筛选研究神经退行性疾病相关蛋白寡聚体的聚集抑制剂对于神经退行性疾病防治活性成分研究具有更重要的理论意义和价值。与神经退行性疾病治病机理研究的逐渐深入相比，神经退行性疾病防治药物相关研究及应用则明显滞后，迄今为止临床上尚无针对病因的特效治疗药物。现有药物对神经退行性疾病的病情只有一定的辅助效果，在一定程度上能够延缓病情的恶化，但都不能逆转病情，如抗AD药物为例，现有乙酰胆碱酯酶抑制剂(IChEIs)如tacrine、donepezil, huperzine,ENA-713,fuperdin A等及近几年用于临床的非竞争性NMDA受体拮抗剂盐酸美金刚(memantine)等药物都仅有一定的辅助治疗效果，很多情况下还会引起乙酰胆碱相关不良反应。因此，研究发现新的、特殊生境神经退行性疾病防治药用资源并从中发现结构新颖、作用独特的新型活性成分对于神经退行性疾病先导药物的研究极为重要，是解决神经退行性疾病新药研发的核心手段之一。红树林是介于海洋生态和陆地生态之间的一种非常特殊的生态区域。受红树林高
3度盐责化、土壤的缺氧、高光辐射及周期性的海水浸淹等独特生长环境的影响，极为丰富又极具特色的红树林微生物资源已成为最独特的海洋药用资源之一。自1993年从太平洋紫杉(短叶红豆杉)中分离得到能够产生新型活性物质的内生真菌Taxamyces andrenae后， 红树林植物内生真菌活性物质的研究引起了人们的极大兴趣。目前，国内外已经在红树内生真菌次生代谢产物中分离鉴定了多个结构独特、新颖的化合物，具有抗肿瘤、抗病毒、抗菌等活性。其中从Kandelia candel树皮内生真菌菌体中分离鉴定的sporothrins A和 Xylaria sp.代谢产物Xyloketal A-D对乙酰胆碱酯酶有较强的抑制作用。这就进一步证明红树内生真菌及其代谢物作为神经退行性疾病防治新药研究的资源具有极大的开发前
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发明内容
本发明的主要目的在于提供一种从红树植物黄水皮的根茎部树皮中分离的海洋红树耐盐性内生真菌，该红树内生真菌菌体提取物具有神经退行性疾病防治活性，在 A-beta蛋白聚集的E. coli细胞模型中显示出很好的抗A-beta蛋白聚集活性。本发明所述的海洋红树耐盐性内生真菌经中国科学院微生物研究所鉴定，命名为=Phomopsis occulta，隐藏拟茎点霉QOl 1)微鉴字第019号)，其于2011年2月23日保藏于湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心，即中国典型培养物保藏中心(CCTCC)， 保藏编号为CCTCCM2011044。本申请对其命名为SN3-2。本发明所述的海洋红树耐盐性内生真菌的固体培养特征为PDA固体培养基，25°C暗室培养6天，菌落为白色毛状，边缘整齐，成熟时有青灰色小点；菌丝匍匐状生长，分隔，孢子内生。该菌具有较强的耐盐性在不含有NaCl的PDA培养基上生长良好，在含有1M、2M、 3M NaCl的高盐度PDA培养基上均长势良好，说明该菌具有很强的耐盐性；但该菌不具有嗜盐性，因为在不含NaCl PDA培养基上长势良好。该菌还具有较强的耐渗性本发明所述的海洋红树耐盐性内生真菌在含有2M、3M山梨糖醇(sorbitol)的PDA固体高渗培养基上长势均非常好，且对不同浓度山梨糖醇PDA培养基的长势基本一致，这说明该菌具有较强的山梨糖醇耐渗性。本发明所述的海洋红树耐盐性内生真菌SN3-2在真菌基础培养液中生长良好在不含有NaCl和分别含有1M、2M、3M NaCl的液体培养基中长势良好；该菌在含不同NaCl浓度的培养基中生长的速度不同，随着NaCl浓度的增大，菌的生长速度持续降低，但菌落形态、菌丝和分生孢子等一致。本发明海洋红树耐盐性内生真菌的18srDNA的碱基序列如SEQ ID NO=I所示。从红树根茎部的树皮中分离海洋红树耐盐性内生真菌的方法1、将采集到的红树枝条表面洗净，带入无菌室。将枝条表面用火焰灭菌IOs 15s。用无菌刀将其剪成3cm km的小段，75%酒精消毒10min，0. 1 %的升汞浸泡:3min。 用无菌水洗涤5遍。另设对照组(以最后洗涤的无菌水作为对照)。将枝条小段分别接种于含有浓度IM和3M的NaCl的PDA固体培养基平皿上(每种材料3皿，每皿3段枝条)，放置于25°C恒温箱中培养；2、待长出菌落后，按无菌操作程序挑出菌丝的尖端，接种于PDA固体培养基平皿上，进行菌种的分离纯化，得到红树内生真菌。3、将纯种菌株接入沙氏试管斜面保存。每3个月 4个月转接一次。从本发明所述海洋红树耐盐性内生真菌中分离基因组DNA的方法本发明所述的海洋红树耐盐性内生真菌SN3-2次生代谢产物及菌体提取物具有显著的神经退行性疾病防治活性。以体外A-beta 42聚集模型、Poly Q模型等进行神经退行性疾病关键蛋白聚集抑制活性筛选和研究发现，该菌菌体提取物具有很强的A-beta、 Poly Q聚集抑制作用，显示出较强的神经退行性疾病防治活性。本发明所述的海洋红树耐盐性内生真菌SN3-2菌体提取物中的抗A-beta聚集有效成分具有较好的水溶性，在水溶液、有机溶液、中性条件、弱酸碱条件下都比较稳定，在 70°C处理120min后任然保留95%以上的活性。本发明所述的海洋红树耐盐性内生真菌SN3-2具有较强的抗AD活性，其次生代谢产物中含有大量以A-beta聚集为靶点的抗聚集类抗AD活性物质，具备从中发现新型抗AD 先导药物的巨大潜力，将为新型抗AD药物的研究提供支持。本发明对AD特效药物的研究及我国南海红树资源的深度开发具有极为重要的意义和价值。
图IA和图IB分别为本发明所述海洋红树耐盐性内生真菌SN3-2的菌落形态图和显微结构图，显微放大倍数为1000。图2是为本发明所述海洋红树耐盐性内生真菌SN3-2和部分相关海洋红树耐盐性内生真菌的基因组DNA核酸琼脂糖电泳图，M 分子量为15000bp的核酸Marker，5为SN3-2 基因组DNA，1-4和6分别是部分相关海洋红树耐盐性内生真菌的基因组DNA。图3为本发明所述海洋红树耐盐性内生真菌SN3-2的菌体提取物体外A_beta42 聚集模型研究结果。图4为本发明所述海洋红树耐盐性内生真菌SN3-2的菌体提取物体外Poly Q聚集模型研究结果。
具体实施例方式本发明整体思路包括以下几点从红树枝条中分离海洋红树耐盐性内生真菌；从海洋红树耐盐性内生真菌中分离基因组DNA;从海洋红树耐盐性内生真菌基因组中克隆 ISSrDNA序列；对分离得到的海洋红树耐盐性内生真菌进行耐盐性、嗜盐性和耐渗性进行分析；提取海洋红树耐盐性内生真菌次生代谢物，检测其抗A-beta聚集活性；以上各点皆为单独实施例，以下将结合具体实施例做进一步详细说明。实施例1从红树树皮中分离海洋红树耐盐性内生真菌深圳海域红树植物水黄皮采集的水黄皮靠近根部水面上方树皮样品，在实验室中按照以下条件筛选和培养，即可以得到本专利所述的海洋红树耐盐性内生真菌SN3-2。(一 )培养基及配制(I)PDA固体培养基马铃薯200g洗净去皮，加水800ml，煮沸30min，六层纱布过滤；滤液加入琼脂15g，加入葡萄糖20g、青霉素终浓度为80u/ml、链霉素终浓度为36u/ml。 0. lMPa，121°C灭菌30min，葡萄糖、青霉素、链霉素通过过滤的方式灭菌。
青霉素规格1600u/mg，5g装。配制方法称取500mg溶入IOml水中，配制成青霉素母液，过滤后保存。配制培养基时每升培养基中加入Iml青霉素母液。青霉素终浓度为 80u/ml。硫酸链霉规格为720u/mg，IOg装。配制方法称取500mg溶入IOml水中，配制成
硫酸链霉素母液，过滤后保存。配制培养基时每升培养基中加入Iml硫酸链霉素母液。硫酸链霉素终浓度为36u/ml。(2) PDA固体含盐培养基在PDA固体培养基中加入NaCl，得到含有NaCl浓度为IM 和3M的PDA固体含盐培养基。(3) PDA固体高渗培养基在PDA固体培养基中加入D-sorbitol，得到含sorbitol 浓度为2M，3M，4M的PDA固体高渗培养基。(4)真菌基础培养液蛋白胨(ρ印tone) 0.3%,硫酸铵0.2%，酵母膏0.05%，磷酸二氢钾0. 4%，氯化钙0. 03%，七水硫酸镁0. 03%，葡萄糖10g/L，分别加入不同量的NaCl， 使其NaCl含量分别为0-3M。0. IMPa, 121°C灭菌30min。(5)MS 培养基大量元素母液(20XlL) :33g NH4NO3, 38g KNO3,8. 8g CaCl2 · 2H20，7. 4g MgSO4 · 7Η20，3· 4g ΚΗ2Ρ04。微量元素母液(200X 1L) :4. 46g MnSO4 · H20，1. 72g ZnSO4 · 7H20，0. 005g CoCl2 · 6H20，0. 005g CuSO4 · 5H20,1. 24g H3BO3,0. 05g Na2MO4 · 2H20，0. 166g KI。铁盐母液(200X，1L) :5. 74g FeS04 · 7Η20，7· 46g EDTA0有机物母液QOOX 1L) :0. 2g烟酸，0. 2g盐酸吡哆醇(VB6)，0. 04g盐酸硫胺素，40g 肌醇，0. 8g甘氨酸。 MS生根培养基(IL) :50ml大量元素(20 X)，5ml微量元素(200 X)，5ml有机元素 Q00X)，5ml 铁盐 Q00X)，30g 蔗糖，NAA(0. ang/L)，IOg 琼脂粉，pH 6.0，高压灭菌。( 二 )具体分离方法从深圳海域红树植物水黄皮中采集水黄皮靠近根部水面上方树皮作为分离材料， 将采集到的材料表面洗净，带入无菌室。将枝条表面用火焰灭菌IOs 15s。用无菌刀将其剪成3cm km的小段，75%酒精消毒10min，0. 的升汞浸泡:3min。用无菌水洗涤5遍。 另设对照组(以最后洗涤的无菌水作为对照)。将枝条小段分别接种于含有浓度IM和3M 的NaCl的PDA固体培养基平皿上(每种材料3皿，每皿3段枝条)，放置于25°C恒温箱中培养；待长出菌落后，按无菌操作程序挑出菌丝的尖端，接种于PDA固体培养基平皿上，进行菌种的分离纯化，得到海洋红树耐盐性内生真菌，命名为Phomopsis occulta,隐藏拟茎点霉，本申请简称为SN3-2。将纯种菌株接入沙氏试管斜面保存。每3个月 4个月转接一次。SN3-2为拟茎点霉属(Phomopsis)，25°C暗室，培养7天，观察其形态特征和显微特征，描述详见表1和图1A、图1B。表1本发明所述海洋红树耐盐性内生真菌SN3-2的培养特征菌林PDA培养基培养菌落特征菌丝和分生孢子特征SN3-2菌落为白色毛状，边缘整齐，成熟时有青灰色小点。菌丝匍匐生长，分隔，孢子内生。实施例2海洋红树耐盐性内生真菌耐盐性、嗜盐性和耐渗性分析将分离到的海洋红树耐盐内生真菌菌种分别接种到含NaCl浓度为1M，2M，3M的 PDA固体高盐培养基，在25°C暗室培养，7天后记录其生长状况，见表2。表2海洋红树耐盐性内生真菌对NaCl的耐盐度鉴定结果
权利要求
1.一种具有神经退行性疾病防治活性的海洋红树耐盐性内生真菌，其保藏编号为 CCTCC M2011044。
2.根据权利要求1所述的一种具有神经退行性疾病防治活性的海洋红树耐盐性内生真菌，其特征在于其18srDNA的碱基序列如SEQ ID NO 1所示。
3.从红树树皮中分离海洋红树耐盐性内生真菌的方法，包括以下步骤1)取红树树皮，洗净，带入无菌室灭菌；2)将灭菌红树树皮分别接种于含有浓度IM和3M的NaCl的PDA固体培养基平皿上，放置于25°C恒温箱中培养；3)待长出菌落后，按无菌操作程序挑出菌丝的尖端，接种于PDA固体培养基平皿上，进行菌种的分离纯化，得到海洋红树耐盐性内生真菌。
4.根据权利要求3所述的从红树树皮中分离海洋红树耐盐性内生真菌的方法，其特征在于所述红树树皮为靠近根部水面上方的树皮。
5.根据权利要求3或4所述的从红树树皮中分离海洋红树耐盐性内生真菌的方法，其特征在于所述红树树皮经表面灭菌后用灭菌后，无菌刀将其剪成3cm km的小段，再用酒精和升汞浸泡灭菌。
全文摘要
本发明涉及微生物技术领域，公开了一种从红树树皮中分离的具有神经退行性疾病防治活性的海洋红树耐盐性内生真菌，其保藏编号为CCTCC M2011044。本发明所述的海洋红树耐盐性内生真菌SN3-2次生代谢产物及菌体提取物具有显著的抗AD活性。以E.coli细胞模型进行抗A-beta聚集活性筛选和研究，该菌菌体提取物具有很强的A-beta聚集的抑制作用；以体外A-beta聚集模型进行抗A-beta聚集活性测试，该菌菌体提取物具有较强的抗聚集活性。
文档编号C12R1/645GK102408998SQ20111017776
公开日2012年4月11日 申请日期2011年6月28日 优先权日2011年6月28日
发明者刘昀, 吴海强, 邹永东, 郑易之, 黄健子 申请人:深圳大学