专利名称：米糠基质纳豆芽孢杆菌与酵母菌复合菌剂的固态发酵方法
技术领域：
本发明涉及以米糠为基质纳豆芽孢杆菌与酵母菌复合饲用菌剂的固态发酵方法， 属于生物工程技术领域。
背景技术：
益生菌剂是在微生态学理论指导下，从人类、动物、植物体内分离的有益微生物， 经培养、发酵、干燥等工艺制成的活菌制剂。目前国际上允许直接饲用的微生物菌种达42种(美国食品与药物管理局，美国饲料协会，1989)，我国农业部1999年公布允许使用的饲料级微生物添加剂菌种有12种， 包括干酪乳杆菌U. casei )、植物乳杆菌(I. plan tarum)、粪链球菌、S. faecal is)、屎链球菌、S. /aeci腫)、乳酸片球菌(P. acii/ihciici)、枯草芽孢杆菌(汉subtilis)、咏H 孢杆菌(M.ο )、嗜酸乳杆菌U. acidophilus )、乳链球菌(Ζ. Iac tis)、啤酒酵母(5 cererisiae )、产朊假丝酵母、C. utiHs)、沼泽红假单胞菌ijl palustris)。芽孢杆菌属于需氧芽孢杆菌中的不致病菌，以内孢子的形式少量存在于动物肠道中。和常用的乳酸菌等益生菌相比，芽孢杆菌具有以下优点和特点①耐高温、耐酸碱、耐压，能够耐受颗粒饲科加工的影响；②在贮藏过程以孢子形式存在，不消耗饲料中的营养成分，可以保持饲料的质量；③进入肠道后，在肠道上部迅速复活，复活率接近100 芽孢杆菌能够产生蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶以及多种氨基酸；⑤芽孢杆菌可以消耗大量的氧，维持肠道厌氧环境，抑制致病菌的生长，维持肠道正常生态平衡⑥具有平衡和稳定乳酸杆菌的作用。饲用酵母菌对动物体的主要作用①促生长特性。酵母细胞富含蛋白质、核酸、维生素和多种酶，具有提供养分、增加饲料适口性，加强消化吸收等功能，并可提高动物对磷的利用率。酵母营养丰富，可以部分或者全部替代饲料中的鱼粉；②改善肠道微生态环境。 酵母菌是肠道中有益微生物，研究发现饲料中添加酵母可促进瘤胃微生物的生长和活性， 使厌氧菌总数上升、纤维素发酵菌数量明显上升；③促进动物体免疫功能，增强抗病力。酵母细胞壁的主要成分甘露聚糖、葡聚糖可直接和肠道病原体结合，中和肠道中毒素。酵母中的甘露聚糖可以和肠道病原菌的纤毛结合，阻止病原菌在肠道粘膜中的定植。纳豆芽孢杆菌属细菌科、芽孢杆菌属，其原始菌株与枯草芽孢杆菌相同，是枯草芽孢杆菌的一个亚种。纳豆芽孢杆菌营养细胞呈杆状，两端钝圆，单生或成短链，可运动G+，芽孢中央生，不膨大。菌落扩展、表面干燥，浅白或微带白色。纳豆芽孢杆菌可产生许多抗菌素，如杆菌肽、多粘菌素、2，6_吡啶二羧酸等，有抑制沙门氏菌、伤寒菌和痢疾菌等致病菌效果，还可以清除葡萄球菌肠毒素。纳豆芽孢杆菌具有很强的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶活性，能降解植物性饲料中某复杂的碳水化合物，从而提高饲料的转化率并增加饲料原料的可利用种类。固态发酵技术历史悠久，广泛用于生产酿造食品，如酒、酱油和醋。20世纪90年代以来，由于能源危机与环境问题，固态发酵技术以其特有的优点再次引起人们的兴趣。与液态发酵相比固态发酵有如下优点一是培养基简单且来源广泛，多为便宜的天然基质或工业生产的下脚料，如稻草、糠、薯类、醋糟等；二是投资少，能耗低，技术简单；三是产物的产率较高；四是不需要废水处理，环境污染较少，后处理加工方便；五是发酵过程一般不需要严格的无菌操作；六是通气一般可由气体扩散或间歇通风完成，不需要连续通风，空气一般也不需严格的无菌空气等。米糠是稻谷在碾米过程中产生的副产品，是糙米碾白过程中被碾下的皮层及少量米胚和碎米的混合物。约占整个糙米的8 % 12 %。米糠是一种可再生的、廉价的、数量巨大的低值生物质原料。米糠中含有淀粉、纤维素、蛋白质、脂肪、糖类、维生素和矿物质等。 水稻是我国第一大粮食品种，每年生产约1.85亿吨，占全国粮食总产量的42 %。我国现年产米糠约1000万吨左右，是一种量大的可再生资源。目前，国内外对纳豆芽孢杆菌的研究开发主要是纳豆生理保健功能、纳豆激酶发酵及益生菌剂等方面。现有纳豆芽孢杆菌益生菌剂的研究报道和专利技术，是以纳豆芽孢杆菌单一菌株经液态发酵或固态发酵后干燥制得。由于单一菌种微生态菌菌剂含有的益生素较少，作用效果有限。
发明内容
本发明的目的在于本发明的目的是提供以米糠为基质纳豆芽孢杆菌与酿酒酵母复合饲用菌剂的固态发酵方法。复合饲用菌剂用于饲料添加剂。本发明方法包括以下步骤
1、发酵培养基制备选用米糠和豆粕为主要原料，按照发酵培养基配方称量，培养基成分按重量百分比组成为米糠85 % 95 %、豆粕2 % 10 %、葡萄糖1 % 5 %，余量为水，使之保持物料充分润湿，无结团，并用NaOH溶液调节物料pH值至6.0 6.5，灭菌2、固态发酵发酵菌种接种比例纳豆芽孢杆菌种子液酿酒酵母种子液按重量配比为5 7:5 3，接种量按重量百分比为5 % 10 %，发酵温度30 37 °C，发酵时间4 6天，发酵期间通入充足的无菌空气，满足菌种生长需要；在此条件下发酵，获得复合菌剂；
3、复合菌剂干燥、包装。本发明方法中纳豆芽孢杆菌种子液制备方法为斜面菌种活化传代两次，以提高菌种活力；一级种子培养用接种针从斜面取ι环纳豆芽孢杆菌，接入装有30 mL牛肉膏蛋白栋培养基的250 mL三角瓶中，在37 °C, 140 r/min的条件下振荡培养12 16 h ； 生产菌种培养纳豆芽孢杆菌菌种扩大培养以牛肉膏蛋白栋培养基，培养基按重量百分比组成为牛肉膏0.5 %，蛋白胨1.0 %，NaCl 0.5 %，葡萄糖0.5 %，pH值7. 2，在37 "C, 140 r/min条件下振荡培养12 16 h或通气搅拌培养12 16 h ；酵母种子液制备方法为斜面菌种活化传代两次，以提高菌种活力；用接种针从斜面取1环酿酒酵母，接入装有30 mL PDA培养基的250 mL三角瓶中，在观°C, 170 r/min的条件下振荡培养12 16 h;酿酒酵母菌种扩大培养以马铃薯为培养基，酿酒酵母培养基按重量百分比组成为去皮马铃薯20 %，葡萄糖2 %，pH值6.0 6. 5，在28 °C, 170 r/min条件下振荡培养12 16 h或通气搅拌培养12 16 h，备用；菌种制备需无杂菌，菌种活力良好。
本发明发酵培养基制备过程中灭菌方法为采用固态发酵罐发酵，发酵培养基实罐灭菌；采用箱式发酵，箱式发酵容器和发酵培养基单独灭菌，灭菌条件为115 125 "C /20 40 min，冷却至 30 37 "C。本发明采用固态发酵罐发酵或箱式发酵，固态发酵罐装料量控制50% 70%，发酵培养基实罐灭菌；箱式发酵物料厚度控制5 12cm，箱式发酵容器需进行灭菌，发酵培养基单独灭菌。本发明复合饲用菌剂活菌计数方法为纳豆芽孢杆菌的计数培养基为牛肉膏蛋白胨培养基，稀释涂布后于37 V恒温培养培养M 36 h后计数；酿酒酵母的计数培养基为马铃薯培养基培养基，稀释涂布后于观"C恒温培养M 36 h后计数。发酵结束后，发酵产品在45 55 °C下真空干燥至含水量低于10 %，包装。纳豆芽孢杆菌数和酿酒酵母菌数存活率> 50 %，在低温干燥下贮藏。本发明所述米糠原料选择全脂或脱脂米糠。本发明所述复合菌剂的活菌计数方法采用稀释平皿涂布计数法，发酵产品中纳豆芽孢杆菌数》109cfu/g，芽孢数》IO9 cfu/g，酿酒酵母数> IO9 cfu/g，混合发酵后发酵产物中的蛋白酶活力> 3000 u/g;产品中可溶性蛋白含量为发酵前的2倍，粗蛋白含量比发酵前增加2.0 %以上。本发明复合益生菌剂具有协同作用，能更好的产生效果。与现有的纳豆芽孢杆菌活菌制剂的专利技术相比，采用稻谷加工副产品——米糠为主要基质，纳豆芽孢杆菌与酿酒酵母双菌种固态混合发酵技术，克服了纳豆芽孢杆菌单一菌种制剂的缺陷，并有利于稻谷加工副产品的综合利用。本发明复合菌剂活性菌数高、成本低，工艺简单、投资少、能耗低，不产生废水、环境污染少、后处理加工方便等特点。本发明的目的是提供以米糠为基质纳豆芽孢杆菌与酿酒酵母复合饲用菌剂的固态发酵方法。本发明的以米糠为基质纳豆芽孢杆菌与酿酒酵母复合饲用菌剂的固态发酵方法， 其主要优点是
1、益生效果好。纳豆芽孢杆菌与酿酒酵母双菌种复合菌剂，具有两种微生物所具有的生理功能，并具有协同作用，作为饲料添加剂，能产生更好的益生效果。2、生产成本低。以稻谷加工副产品——米糠作为发酵的主要基质，利于米糠的综合利用，能大幅度降低生产成本，并充分利用米糠中的营养成分。采用固态发酵方法，生产工艺简单，能耗少。3、产品中营养物质更丰富，饲料的利用率提高。发酵后产品中粗蛋白、可溶性蛋白等营养成分含量增加，产品中含有蛋白酶等水解酶系，有利于饲料中营养物质的消化吸收。
具体实施例方式以下结合实施例对本发明进行详细说明。实施例1
(一)发酵培养基制备选用全脂米糠、豆粕原料应干燥无结块、无霉变、无变质、质地均勻。米糠90 kg、豆粕8 kg、葡萄糖^cg,加水60kg，保持物料充分润湿，无结团，并用1 N NaOH调节物料pH值6.0 6. 5 ；采用固态发酵罐发酵，发酵培养基实罐灭菌，灭菌条件为115 125 0C /20 40 min，冷却至30 37 °C。备用。或采用箱式发酵，发酵培养基单独灭菌，灭菌条件为115 125 0C /20 40 min，冷却至30 37 °C。备用。(二)菌种制备生产菌种斜面活化传代两次，提高菌种活力。一级种子培养用接种针从斜面取1环纳豆芽孢杆菌，接入装有30 mL牛肉膏蛋白栋培养基的250 mL三角瓶中，在37 140 r/min的条件下振荡培养12 16 h。啤酒酵母用接种针从斜面取 1环酿酒酵母，接入装有30 mL PDA培养基的250 mL三角瓶中，在观°C, 170 r/min的条件下振荡培养12 16 h。生产菌种培养纳豆芽孢杆菌菌种扩大培养以牛肉膏蛋白栋培养基(牛肉膏0.5 %，蛋白胨1.0 %，NaCl 0.5 %，葡萄糖0.5 %，pH值7. 2)，在37 °C, 140 r/min条件下振荡培养12 16 h或通气搅拌培养12 16 h ；酿酒酵母菌种扩大培养以马铃薯为培养基(去皮马铃薯20 %，葡萄糖2 %，pH值自然。)，在28 170 r/min 条件下振荡培养12 16 h或通气搅拌培养12 16 h。备用。菌种制备需保证明无杂菌，菌种活力良好。(三)固态发酵方法采用固态发酵罐发酵或箱式发酵。固态发酵罐装料量控制 50% 70%，发酵培养实罐灭菌。箱式发酵物料厚度控制5 12cm，箱式发酵容器需进行灭菌，发酵培养基单独灭菌。发酵菌种接种比例，纳豆芽孢杆菌种子液酿酒酵母种子液 =5:5，接种量11. ^ig,发酵温度30 37 °C，发酵时间4 6天，发酵期间通入充足的无菌空气，满足菌种生长需要。在此条件下发酵后，采用稀释平皿涂布计数法，纳豆芽孢杆菌的计数培养基为牛肉膏蛋白胨培养基，稀释涂布后于37 V恒温培养培养M 36 h 后计数；酿酒酵母的计数培养基为马铃薯培养基培养基，稀释涂布后于观"C恒温培养 M 36 h后计数。发酵产品中纳豆芽孢杆菌数彡109cfu/g，芽孢数彡IO9 cfu/g，酿酒酵母数> IO9 cfu/g，混合发酵后发酵产物中的蛋白酶活力> 3000 u/g。产品中可溶性蛋白含量为发酵前的2倍，粗蛋白含量比发酵前增加2.0 %以上。(四)复合菌剂干燥、包装发酵结束后，发酵产品在45 55°C下真空干燥(真空度为0.095 MPa)至含水量低于10 %，包装。纳豆芽孢杆菌数和酿酒酵母菌数存活率彡 50 %，在低温干燥下贮藏，具有良好的贮藏稳定性。实施例2
发酵培养基制备选用脱脂米糠、豆粕原料应干燥无结块、无霉变、无变质、质地均勻。 米糠85 kg、豆粕10 kg、葡萄糖^g，加水60kg。固态发酵方法中发酵菌种接种比例，纳豆芽孢杆菌种子液酿酒酵母种子液=7:3，接种量8. 0kg，其它步骤及工艺参数同实施例1。实施例3
(一)发酵培养基制备选用全脂米糠、豆粕原料应干燥无结块、无霉变、无变质、质地均勻。米糠95 kg、豆粕10 kg、葡萄糖^g，加水90kg，保持物料充分润湿，无结团，并用1 N NaOH调节物料pH值6.0 6. 5 ；采用固态发酵罐发酵，发酵培养基实罐灭菌，灭菌条件为 125 V / 40 min，冷却至37 °C，备用。(二)菌种制备生产菌种斜面活化传代两次，提高菌种活力。一级种子培养用接种针从斜面取ι环纳豆芽孢杆菌，接入装有30 mL牛肉膏蛋白栋培养基的250 mL三角瓶中，在37 140 r/min的条件下振荡培养12 16 h。啤酒酵母用接种针从斜面取 1环酿酒酵母，接入装有30 mL PDA培养基的250 mL三角瓶中，在观°C, 170 r/min的条件下振荡培养16 h。生产菌种培养纳豆芽孢杆菌菌种扩大培养以牛肉膏蛋白栋培养基 (牛肉膏 0.5 %，蛋白胨 1.0 %，NaCl 0.5 %，葡萄糖 0.5 %，pH 值 7. 2)，在 37 "C, 140 r/min条件下振荡培养12 h;酿酒酵母菌种扩大培养以马铃薯为培养基(去皮马铃薯20 %， 葡萄糖2 %，pH值自然)，在28 170 r/min条件下通气搅拌培养15 h。备用。菌种制备需保证明无杂菌，菌种活力良好。(三)固态发酵方法固态发酵罐装料量控制50% 70%，发酵培养基按照具体实施例1实罐灭菌。发酵菌种接种比例，纳豆芽孢杆菌种子液酿酒酵母种子液=2:1，接种量按重量百分比为10 %，发酵温度30 37 °C，发酵时间3天，发酵期间通入充足的无菌空气，满足菌种生长需要。在此条件下发酵后，采用稀释平皿涂布计数法，纳豆芽孢杆菌的计数培养基为牛肉膏蛋白胨培养基，稀释涂布后于37 V恒温培养培养M 36 h后计数；酿酒酵母的计数培养基为马铃薯培养基培养基，稀释涂布后于观"C恒温培养M 36 h后计数。发酵产品中纳豆芽孢杆菌数彡109cfu/g，芽孢数彡IO9 cfu/g，酿酒酵母数>109 cfu/g，混合发酵后发酵产物中的蛋白酶活力> 3000 u/g。产品中可溶性蛋白含量为发酵前的2倍，粗蛋白含量比发酵前增加2.0 %以上。(四)复合菌剂干燥、包装发酵结束后，发酵产品在45 55°C下真空干燥(真空度为0.095 MPa)至含水量低于10 %，包装。纳豆芽孢杆菌数和酿酒酵母菌数存活率彡 50 %，在低温干燥下贮藏，具有良好的贮藏稳定性。实施例4
(一)发酵培养基制备选用全脂米糠、豆粕原料应干燥无结块、无霉变、无变质、质地均勻。米糠85 kg、豆粕6 kg、葡萄糖3kg，加水70kg，保持物料充分润湿，无结团，并用1 N NaOH调节物料pH值6.0 6. 5 ；采用箱式发酵，发酵培养基单独灭菌，灭菌条件为120 0C / 30 min，冷却至30 °C，备用。(二)菌种制备生产菌种斜面活化传代两次，提高菌种活力。一级种子培养用接种针从斜面取1环纳豆芽孢杆菌，接入装有30 mL牛肉膏蛋白栋培养基的250 mL三角瓶中，在37 140 r/min的条件下振荡培养13 h。啤酒酵母用接种针从斜面取1环酿酒酵母，接入装有30 mL PDA培养基的250 mL三角瓶中，在观°C, 170 r/min的条件下通气搅拌培养14 h。生产菌种培养纳豆芽孢杆菌菌种扩大培养以牛肉膏蛋白栋培养基 (牛肉膏 0.5 %，蛋白胨 1.0 %，NaCl 0.5 %，葡萄糖 0.5 %，pH 值 7. 2)，在 37 "C, 140 r/ min条件下振荡培养16 h;酿酒酵母菌种扩大培养以马铃薯为培养基(去皮马铃薯20 %， 葡萄糖2 %，pH值自然。)，在观170 r/min条件下振荡培养13 h，备用。菌种制备需保证明无杂菌，菌种活力良好。(三)固态发酵方法采用固态发酵罐发酵或箱式发酵。固态发酵罐装料量控制 50%，发酵培养基实罐灭菌。箱式发酵物料厚度控制10cm，箱式发酵容器需进行灭菌，发酵培养基单独灭菌。发酵菌种接种比例，纳豆芽孢杆菌种子液酿酒酵母种子液=5:3，接种量按重量百分比为5 %，发酵温度30 37 °C，发酵时间4天，发酵期间通入充足的无菌空气，满足菌种生长需要。在此条件下发酵后，采用稀释平皿涂布计数法，纳豆芽孢杆菌的计数培养基为牛肉膏蛋白胨培养基，稀释涂布后于37 V恒温培养培养M 36 h后计数；酿酒酵母的计数培养基为马铃薯培养基培养基，稀释涂布后于观"C恒温培养M 36 h后计数。发酵产品中纳豆芽孢杆菌数彡IO9 cfu/g，芽孢数彡IO9 cfu/g，酿酒酵母数>109 cfu/g，混合发酵后发酵产物中的蛋白酶活力> 3000 u/g。产品中可溶性蛋白含量为发酵前的2倍，粗蛋白含量比发酵前增加2.0 %以上。
(四)复合菌剂干燥、包装发酵结束后，发酵产品在45 55°C下真空干燥(真空度为0.095 MPa)至含水量低于10 %，包装。纳豆芽孢杆菌数和酿酒酵母菌数存活率彡 50 %，在低温干燥下贮藏，具有良好的贮藏稳定性。实施例5
(一)发酵培养基制备选用脱脂米糠、豆粕原料。米糠85 kg、豆粕2 kg、葡萄糖lkg， 加水80kg，保持物料充分润湿，无结团，并用1 N NaOH调节物料pH值6. 0 6. 5 ；采用箱式发酵，发酵培养基单独灭菌，灭菌条件为115 125 0C /20 40 min，冷却至30
37 O ο ^^ ο(二)菌种制备生产菌种斜面活化传代两次，提高菌种活力。一级种子培养用接种针从斜面取1环纳豆芽孢杆菌，接入装有30 mL牛肉膏蛋白栋培养基的250 mL三角瓶中，在37 140 r/min的条件下振荡培养14 h。啤酒酵母用接种针从斜面取1环酿酒酵母，接入装有30 mL PDA培养基的250 mL三角瓶中，在观°C, 170 r/min的条件下振荡培养16 h。生产菌种培养纳豆芽孢杆菌菌种扩大培养以牛肉膏蛋白栋培养基(牛肉膏 0.5 %，蛋白胨 1.0 %，NaCl 0.5 %，葡萄糖 0.5 %，pH 值 7. 2)，在 37 "C, 140 r/min 条件下通气搅拌培养1 ;酿酒酵母菌种扩大培养以马铃薯为培养基(去皮马铃薯20 %， 葡萄糖2 %，pH值自然。)，在28 170 r/min条件下振荡培养16 h，备用。菌种制备需保证明无杂菌，菌种活力良好。(三)固态发酵方法采用固态发酵罐发酵或箱式发酵。固态发酵罐装料量控制 60%，发酵培养基实罐灭菌。箱式发酵物料厚度控制10cm，箱式发酵容器需进行灭菌，发酵培养基单独灭菌。发酵菌种接种比例，纳豆芽孢杆菌种子液酿酒酵母种子液=4:3，按重量百分比为8 %，发酵温度30 37 °C，发酵时间5天，发酵期间通入充足的无菌空气，满足菌种生长需要。在此条件下发酵后，采用稀释平皿涂布计数法，纳豆芽孢杆菌的计数培养基为牛肉膏蛋白胨培养基，稀释涂布后于37 V恒温培养培养观h后计数；酿酒酵母的计数培养基为马铃薯培养基培养基，稀释涂布后于观"C恒温培养M h后计数。发酵产品中纳豆芽孢杆菌数彡109cfu/g，芽孢数彡IO9 cfu/g，酿酒酵母数彡IO9 cfu/g，混合发酵后发酵产物中的蛋白酶活力> 3000 u/g。产品中可溶性蛋白含量为发酵前的2倍，粗蛋白含量比发酵前增加2.0 %以上。(四)复合菌剂干燥、包装发酵结束后，发酵产品在45 55°C下真空干燥(真空度为0.095 MPa)至含水量低于10 %，包装。纳豆芽孢杆菌数和酿酒酵母菌数存活率彡 50 %，在低温干燥下贮藏，具有良好的贮藏稳定性。实施例6:
(一)发酵培养基制备选用全脂米糠、豆粕原料应干燥无结块、无霉变、无变质、质地均勻。米糠88 kg、豆粕6 kg、葡萄糖4kg，加水70kg，保持物料充分润湿，无结团，并用1 N NaOH调节物料pH值6.0 6. 5 ；采用箱式发酵，发酵培养基单独灭菌，灭菌条件为115 "C /20 min，冷却至30 37 "C。备用。(二)菌种制备生产菌种斜面活化传代两次，提高菌种活力。一级种子培养用接种针从斜面取1环纳豆芽孢杆菌，接入装有30 mL牛肉膏蛋白栋培养基的250 mL三角瓶中，在37 140 r/min的条件下振荡培养13h。啤酒酵母用接种针从斜面取1环酿酒酵母，接入装有30 mL PDA培养基的250 mL三角瓶中，在观°C, 170 r/min的条件下振荡培养15 h。生产菌种培养纳豆芽孢杆菌菌种扩大培养以牛肉膏蛋白栋培养基(牛肉膏 0.5 %，蛋白胨 1.0 %, NaCl 0.5 %，葡萄糖 0.5 %，pH 值 7. 2)，在 37 "C, 140 r/min 条件下振荡培养14 h;酿酒酵母菌种扩大培养以马铃薯为培养基(去皮马铃薯20 %，葡萄糖 2 %，pH值自然。)，在28 170 r/min条件下振荡培养15 h。备用。菌种制备需保证明无杂菌，菌种活力良好。(三)固态发酵方法采用固态发酵罐发酵或箱式发酵。固态发酵罐装料量控制 55%，发酵培养实罐灭菌。箱式发酵物料厚度控制5cm，箱式发酵容器需进行灭菌，发酵培养基单独灭菌。发酵菌种接种比例，纳豆芽孢杆菌种子液酿酒酵母种子液=5:4，接种量按重量百分比为9 %，发酵温度35°C，发酵时间6天，发酵期间通入充足的无菌空气，满足菌种生长需要。在此条件下发酵后，采用稀释平皿涂布计数法，纳豆芽孢杆菌的计数培养基为牛肉膏蛋白胨培养基，稀释涂布后于37 V恒温培养培养30 h后计数；酿酒酵母的计数培养基为马铃薯培养基培养基，稀释涂布后于观"C恒温培养观h后计数。发酵产品中纳豆芽孢杆菌数》109cfu/g，芽孢数》IO9 cfu/g，酿酒酵母数> IO9 cfu/g，混合发酵后发酵产物中的蛋白酶活力> 3000 u/g。产品中可溶性蛋白含量为发酵前的2倍，粗蛋白含量比发酵前增加2.0 %以上。(四)复合菌剂干燥、包装发酵结束后，发酵产品在45 55°C下真空干燥(真空度为0.095 MPa)至含水量低于10 %，包装。纳豆芽孢杆菌数和酿酒酵母菌数存活率彡 50 %，在低温干燥下贮藏，具有良好的贮藏稳定性。
权利要求
1. 一种以米糠为基质纳豆芽孢杆菌与酵母菌复合饲用菌剂的固态发酵方法，其特征在于包括以下步骤1. 1发酵培养基制备选用米糠和豆粕为主要原料，按照发酵培养基配方称量，培养基成分按重量百分比组成为米糠85 % 95 %、豆粕2 % 10 %、葡萄糖1 % 5 %，余量为水，使之保持物料充分润湿，无结团，并用NaOH溶液调节物料pH值至6.0 6.5，灭菌备用；1.2固态发酵发酵菌种接种比例纳豆芽孢杆菌种子液酿酒酵母种子液按重量配比为5 7:5 3，接种量按重量百分比为5 % 10 %，发酵温度30 37 °C，发酵期间通入充足的无菌空气，满足菌种生长需要；在此条件下发酵，获得复合菌剂；1.3:复合菌剂干燥、包装。
2.根据权利要求1所述的以米糠为基质纳豆芽孢杆菌与酵母菌复合饲用菌剂的固态发酵方法，其特征在于纳豆芽孢杆菌种子液制备方法为斜面菌种活化传代两次，以提高菌种活力；一级种子培养用接种针从斜面取1环纳豆芽孢杆菌，接入装有30 mL牛肉膏蛋白栋培养基的250 mL三角瓶中，在37 °C, 140 r/min的条件下振荡培养12 16 h ； 生产菌种培养纳豆芽孢杆菌菌种扩大培养以牛肉膏蛋白栋培养基，培养基按重量百分比组成为牛肉膏0.5 %，蛋白胨1.0 %，NaCl 0.5 %，葡萄糖0.5 %，pH值7. 2，在37 "C, 140 r/min条件下振荡培养12 16 h或通气搅拌培养12 16 h ；酵母种子液制备方法为斜面菌种活化传代两次，以提高菌种活力；用接种针从斜面取1环酿酒酵母，接入装有30 mL PDA培养基的250 mL三角瓶中，在观°C, 170 r/min的条件下振荡培养12 16 h;酿酒酵母菌种扩大培养以马铃薯为培养基，酿酒酵母培养基按重量百分比组成为去皮马铃薯20 %，葡萄糖2 %，pH值6.0 6. 5，在28 °C, 170 r/min条件下振荡培养12 16 h或通气搅拌培养12 16 h，备用。
3.根据权利要求1所述的以米糠为基质纳豆芽孢杆菌与酵母菌复合饲用菌剂的固态发酵方法，其特征在于发酵培养基制备过程中灭菌方法为采用固态发酵罐发酵，发酵培养基实罐灭菌；或采用箱式发酵，箱式发酵容器和发酵培养基单独灭菌，灭菌条件为115 125 "C /20 40 min，冷却至 30 37 "C。
4.根据权利要求1或2或3所述的以米糠为基质纳豆芽孢杆菌与酵母菌复合饲用菌剂的固态发酵方法，其特征在于采用固态发酵罐发酵或箱式发酵，固态发酵罐装料量控制 50% 70%，发酵培养基实罐灭菌；箱式发酵物料厚度控制5 12cm，箱式发酵容器需进行灭菌，发酵培养基单独灭菌。
5.根据权利要求1或2或3所述的以米糠为基质纳豆芽孢杆菌与酵母菌复合饲用菌剂的固态发酵方法，其特征在于固态发酵时间为4 6天。
6.根据权利要求3所述的以米糠为基质纳豆芽孢杆菌与酵母菌复合饲用菌剂的固态发酵方法，其特征在于复合饲用菌剂活菌计数方法为纳豆芽孢杆菌的计数培养基为牛肉膏蛋白胨培养基，稀释涂布后于37 V恒温培养培养M 36 h后计数；酿酒酵母的计数培养基为马铃薯培养基培养基，稀释涂布后于观"C恒温培养M 36 h后计数； 发酵结束后，发酵产品在45 55 °C下真空干燥至含水量低于10 %，包装；纳豆芽孢杆菌数和酿酒酵母菌数存活率> 50 %，在低温干燥下贮藏。
7.根据权利要求1或2或3所述的以米糠为基质纳豆芽孢杆菌与酵母菌复合饲用菌剂的固态发酵方法，其特征在于米糠原料为全脂或脱脂米糠。
8.根据权利要求1或2或3所述的以米糠为基质纳豆芽孢杆菌与酵母菌复合饲用菌剂的固态发酵方法，其特征在于复合菌剂活菌计数方法采用稀释平皿涂布计数法，发酵产品中纳豆芽孢杆菌数彡109cfu/g，芽孢数彡IO9 cfu/g，酿酒酵母数彡IO9 cfu/g，混合发酵后发酵产物中的蛋白酶活力> 3000 u/g;产品中可溶性蛋白含量为发酵前的2倍，粗蛋白含量比发酵前增加2.0 %以上。
全文摘要
本发明公开了一种以米糠为基质纳豆芽孢杆菌与酵母菌复合饲用菌剂的固态发酵方法，包括以下步骤发酵培养基制备选用米糠和豆粕为主要原料，按照发酵培养基配方称量，培养基成分按重量百分比组成为米糠85%～95%、豆粕2%～10%、葡萄糖1%～5%，余量为水，使之保持物料充分润湿，无结团，并用NaOH溶液调节物料pH值至6.0～6.5，灭菌备用。固态发酵发酵菌种接种比例，纳豆芽孢杆菌种子液:酿酒酵母种子液按重量配比为5～7:5～3，接种量按重量百分比为5%～10%，固态发酵时间为4～6天，获得复合菌剂；复合菌剂干燥、包装。本发明复合菌剂活性菌数高、成本低，工艺简单、投资少、能耗低，不产生废水、环境污染少、后处理加工方便等特点。
文档编号C12N1/20GK102334611SQ201110260230
公开日2012年2月1日 申请日期2011年9月5日 优先权日2011年9月5日
发明者帅明, 牛丽亚, 蔡凯凯, 黄占旺 申请人:江西农业大学