专利名称：一种hras基因突变检测特异性引物和液相芯片的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种HRAS基因突变检测特异性引物和液相芯片。
背景技术：
ras基因参与细胞生长和分化的调控，参与多种肿瘤的形成与发展。ras基因家族与人类肿瘤相关的特征性基因有三种，即H-ras、K-ras和N_ras，它们分别定位于11、12、I号染色体。ras族癌基因活化是某些肿瘤发生发展的分子基础，其中，点突变是ras族基因活化的重要方式，而ras族基因第12位、13位和61位密码子的点突变可使其获得转化细胞 的能力。因此对肿瘤细胞ras基因点突变的检测，对了解肿瘤的发生发展，以及监测恶性肿瘤的治疗效果具有重大意义，对临床工作具有重要指导意义。其中，HRAS(v-Ha-ras Harvey rat sarcoma viral oncogene homo log)基因定位于11号染色体，由946个腺嘌呤、2287个胞嘧啶、2113个鸟嘌呤、1107个胸腺嘧啶组成。HRAS基因突变及其突变率与地理环境条件、种族、致癌原的不同有关，有研究表明，HRAS点突变与胃癌的某些分子生物学行为相关，而且有可能成为判断胃癌患者预后的有用指标。本发明所开发的HRAS基因突变检测液相芯片涉及的突变位点如下表所示
基因位点__mm__密码子
HRAS12-w (野生型)__GGC
G12S (突变型)__AGC
^ , ^ G12C (突变型) TGCCodonI2 --
G12R (突变型)__GGG
G12D (突变型)__GAC
G12V (突变型)GTC---
13-w (野生型)__GGT
^ G13S (突变型) AGT CodonI3 --
G13R (突变型)__CGT
__G13C (突变型)__TGT
Codon6161-w (野生型)__CAG
Q61K (突变型)__AAG
___Q61R (突变型)__CGG
Q61L (突变型)__CTG
___Q61H (突变型)__CAC
目前，对HRAS基因突变进行检测和分析的方法很少，主要有直接测序法和PCR-RFLP分析法，其中最常用的方法有PCR-RFLP分析法。PCR-RFLP法是基于基因突变造成的限制性内切酶识别位点的改变，如位点丢失或产生新位点，通过PCR扩增某一特定片段，再用限制性内切酶酶切扩增产物，电泳观察片段的大小，这种方法用于检测酶切位点改变的基因突变，可直接判断基因型，但该法不能用于没有产生新酶切位点的基因突变检测。再次，以上这些方法都存在着检测通量的局限性，每次只能检测一种突变类型，不能满足实际应用的需要。
发明内容
本发明的目的之一是提供HRAS基因突变检测液相芯片，该液相芯片可用于单项或者并行检测HRAS基因Codon 12的正常基因型及五种突变型G12S、G12C、G12R、G12D、G12V，Codon 13的正常基因型及三种突变型G13S、G13R、G13C，以及Codon 61的正常基因 型及四种突变型Q61K、Q61R、Q61L、Q61H。实现上述目的的技术方案如下一种HRAS基因突变检测液相芯片，包括有(A).针对HRAS基因不同突变位点分别设计的野生型和突变型的ASPE引物每种ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物序列组成，所述特异性引物序列为针对Codon 12位点的SEQ ID NO. 16以及SEQ ID NO. 17、SEQ IDNO. 18,SEQ IDN0. 19,SEQ ID NO. 20 和 SEQ ID NO. 21 中的一种以上;针对 Codon 13 位点的SEQ ID NO. 22 以及 SEQ ID NO. 23、SEQ ID NO. 24 和 SEQ ID NO. 25 中的一种以上；和 / 或针对 Codon 61 位点的 SEQ ID NO. 26 以及 SEQ ID NO. 27、SEQ ID NO. 28、SEQ ID NO. 29 和SEQ ID NO. 30中的一种以上；所述tag序列选自SEQ ID NO.1 SEQ ID NO. 15 ；(B).有ant1-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球,所述ant1-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述ant1-tag序列选自SEQ ID NO. 31 SEQ ID NO. 45，且所述ant1-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对；(C).用于扩增出需要检测的、具有相应突变位点的目标序列的引物。优选地，所述扩增引物为针对HRAS基因Codon 12和/或Codon 13位点的SEQ IDNO. 46 及 SEQ ID NO. 47 ;和 / 或针对 Codon 61 位点的 SEQ ID NO. 48 及 SEQ ID NO. 49。优选地，所述ASPE引物为:针对Codon 12位点的由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO. 16组成的序列以及由SEQ ID NO. 2及SEQ ID NO. 17组成的序列、由SEQ ID NO. 3和SEQ IDNO. 18组成的序列、由SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 19组成的序列、由SEQ ID NO. 5和SEQ IDNO. 20组成的序列、和/或由SEQ ID NO. 6和SEQ ID NO. 21组成的序列；针对Codon 13位点的由SEQ ID NO. 7和SEQ ID NO. 22组成的序列以及由SEQ ID NO. 8和SEQ ID NO. 23组成的序列、由SEQ ID NO. 9和SEQ ID NO. 24组成的序列、和/或由SEQ ID NO. 10和SEQ IDNO. 25组成的序列；和/或针对Codon 61位点的由SEQ ID NO. 11和SEQ ID NO. 26组成的序列以及由 SEQ ID NO. 12 和 SEQ IDN0. 27 组成的序列、由 SEQ ID NO. 13 和 SEQ ID NO. 28组成的序列、由SEQ ID NO. 14和SEQ IDN0. 29组成的序列、和/或由SEQ ID NO. 15和SEQID NO. 30组成的序列。
本发明的另一目的是提供用于HRAS基因突变检测的特异性引物。实现上述目的的技术方案如下用于HRAS基因突变检测的特异性引物，其为所述特异性引物序列为针对Codon
12位点的 SEQ ID NO. 16 以及 SEQ ID NO. 17、SEQ ID NO. 18、SEQ ID NO. 19、SEQ ID NO. 20和 SEQ ID NO. 21 中的一种以上；针对 Codon 13 位点的 SEQ ID NO. 22 以及 SEQ ID NO. 23、SEQ IDN0. 24 和 SEQ ID NO. 25 中的一种以上；和 / 或针对 Codon 61 位点的 SEQ ID NO. 26以及 SEQ IDN0. 27、SEQ ID NO. 28、SEQ ID NO. 29 和 SEQ ID NO. 30 中的一种以上。本发明的主要优点在于1.本发明所提供的检测方法与测序法的吻合率高达100%。且检测所需要的时间远远低于常用的测序技术，特别符合实际应用需要。所制备的HRAS基因突变检测液相芯片具有非常好的信号-噪声比，并且所设计的探针以及ant1-tag序列之间基本上不存在交叉反应，tag标签序列、ant1-tag标签序列的选取以及tag标签序列与具体ASPE引物的结合，能够避免交叉反应，实现多个突变位点的并行检测。2.本发明通过发明人长期积累的设计经验和大量的实验操作，从众多的特异性引物中选取了最优的组合。本发明设计的ASPE引物特异性引物能够灵敏特异地识别目标检测的突变位点，准确区分各种型别的基因型；在同一个反应体系中，不同的特异性引物之间、特异性引物与非目标检测的PCR扩增产物之间基本上不存在交叉反应，检测特异性好，交叉反应率低于3% ;除了能够检测单个位点突变情况，也能够同时并行检测多个突变位点的突变情况，检测效果一致。3.本发明的检测方法步骤简单，12种突变位点检测可通过一步PCR即可完成2条含有突变位点的目标序列的扩增，避免了反复多次PCR等复杂操作过程中存在的诸多不确定因素，因而可大大提高检测准确率，体现了精确的同时定性、定量分析特征。4.本发明不仅克服了传统固相芯片敏感性不高，检测结果的可重复性差的缺陷，同时对现有的液相芯片技术进行改进，使得所制备微球能适用于不同的检测项目，具有很 强的拓展性。检测的荧光信号值大大提高，从而使得检测的灵敏度进一步得到提高，信噪比增强，检测结果更加准确可靠。
具体实施例方式实施例1本实施例所述的HRAS基因突变检测液相芯片，主要包括有一、ASPE 引物针对HRAS基因Codon 12的正常基因型及五种突变型G12S、G12C、G12R、G12D、G12V，Codon 13的正常基因型及三种突变型G13S、G13R、G13C，以及Codon 61的正常基因型及四种突变型Q61K、Q61R、Q61L、Q61H，分别设计特异性引物序列。ASPE引物由“tag序列+特异性引物序列”组成。ASPE引物序列如下表所示表I HRAS基因的ASPE弓丨物序列(tag序列+特异性引物序列)
权利要求
1.一种HRAS基因突变检测液相芯片，其特征是，包括有(A).针对HRAS基因不同突变位点分别设计的野生型和突变型的ASPE引物每种ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物序列组成，所述特异性引物序列为针对 Codon 12 位点的 SEQ ID NO. 16 以及 SEQ ID NO. 17、SEQ ID NO. 18、SEQ IDN0. 19、SEQ ID NO. 20 和 SEQ ID NO. 21 中的一种以上；针对 Codon 13 位点的 SEQID NO. 22 以及 SEQ ID NO. 23、SEQ ID NO. 24 和 SEQ ID NO. 25 中的一种以上；和 / 或针对Codon 61 位点的 SEQ ID NO. 26 以及 SEQ ID NO. 27、SEQ ID NO. 28、SEQ ID NO. 29 和 SEQID NO. 30中的一种以上；所述tag序列选自SEQ ID NO.1 SEQ ID NO. 15 ；(B).有ant1-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球,所述ant1-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述ant1-tag序列选自SEQ ID NO. 31 SEQ ID NO. 45，且所述ant1-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对；(C).用于扩增出需要检测的、具有相应突变位点的目标序列的引物。
2.根据权利要求1所述的HRAS基因突变检测液相芯片，其特征是，所述扩增引物为针对 Codon 12 和 / 或 Codon 13 位点的 SEQ ID NO. 46 及 SEQ ID NO. 47 ;和 / 或针对 Codon61 位点的 SEQID NO. 48 及 SEQ ID NO. 49。
3.根据权利要求1所述的HRAS基因突变检测液相芯片，其特征是，所述ASPE引物为针对Codon 12位点的由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO. 16组成的序列以及由SEQ ID NO. 2和SEQ IDN0. 17组成的序列、由SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 18组成的序列、由SEQ ID NO. 4和SEQ IDN0. 19组成的序列、由SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 20组成的序列、和/或由SEQ IDNO. 6 和 SEQID NO. 21 组成的序列；针对 Codon 13 位点的由 SEQ ID NO. 7 和 SEQ ID NO. 22组成的序列以及由SEQ ID NO. 8和SEQ ID NO. 23组成的序列、由SEQ ID NO. 9和SEQ IDNO. 24组成的序列、和/或由SEQ ID NO. 10和SEQ ID NO. 25组成的序列；和/或针对Codon61位点的由SEQ IDN0. 11和SEQ ID NO. 26组成的序列以及由SEQ ID NO. 12和SEQ IDNO. 27组成的序列、由SEQID NO. 13和SEQ ID NO. 28组成的序列、由SEQ ID NO. 14和SEQID NO. 29组成的序列、和/或由SEQ ID NO. 15和SEQ ID NO. 30组成的序列。
4.根据权利要求1所述的HRAS基因突变检测液相芯片，其特征是(A)所述ASPE引物为针对Codon12位点的由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO. 16组成的序列以及由SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 17组成的序列、由SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 18组成的序列、由 SEQ ID NO. 4 和 SEQ ID NO. 19 组成的序列、由 SEQ ID NO. 5 和 SEQ ID NO. 20组成的序列、和由SEQ ID NO. 6和SEQ ID NO. 21组成的序列；针对Codon 13位点的由SEQID NO. 7和SEQID NO. 22组成的序列以及由SEQ ID NO. 8和SEQ ID NO. 23组成的序列、由SEQ ID NO. 9 和 SEQ ID NO. 24 组成的序列、和由 SEQ ID NO. 10 和 SEQ ID NO. 25 组成的序列；和针对Codon 61位点的由SEQ ID NO. 11和SEQ ID NO. 26组成的序列以及由SEQ IDNO. 12和SEQ ID NO. 27组成的序列、由SEQ ID NO. 13和SEQ ID NO. 28组成的序列、由SEQID NO. 14和SEQ ID NO. 29组成的序列、和由SEQ ID NO. 15和SEQ ID NO. 30组成的序列；(B)有ant1-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球,所述ant1-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述ant1-tag序列选自SEQ ID NO. 31 SEQ ID NO. 45，且所述ant1-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对；(C)所述扩增引物为:针对Codon12,Codon 13位点的SEQ ID NO. 46及SEQ ID NO. 47 ；和针对 Codon 61 位点的 SEQ ID NO. 48 及 SEQ ID NO. 49。
5.根据权利要求1-4任一项所述的HRAS基因突变检测液相芯片，其特征是，所述间隔臂为5-10个T。
6.用于HRAS基因突变检测液的特异性引物，其特征是，所述特异性引物序列为针对Codon 12 位点的 SEQ ID NO. 16 以及 SEQ ID NO. 17、SEQ ID NO. 18、SEQ ID NO. 19、SEQ IDNO. 20和SEQ ID NO. 21中的一种以上；针对Codon 13位点的SEQ ID NO. 22以及SEQ IDNO. 23、SEQ IDN0. 24 和 SEQ ID NO. 25 中的一种以上；和 / 或针对 Codon 61 位点的 SEQ IDNO. 26 以及 SEQ IDN0. 27、SEQ ID NO. 28、SEQ ID NO. 29 和 SEQ ID NO. 30 中的一种以上。
全文摘要
本发明公开了一种HRAS基因检测特异性引物和液相芯片，该液相芯片主要包括有每种由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物序列组成的ASPE引物，所述特异性引物序列为针对Codon 12位点的SEQ ID NO.16及SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20、和/或SEQ ID NO.21；针对Codon 13位点的SEQ ID NO.22及SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.24、和/或SEQ ID NO.25；和/或针对Codon 61位点的SEQ IDNO.26及SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29、和/或SEQ ID NO.30；有anti-tag序列包被的微球；扩增引物。本发明所提供的检测液相芯片的检测结果与测序法的吻合率高达100％，实现多个突变位点的野生型和突变型并行检测。
文档编号C12Q1/68GK102994617SQ20111026976
公开日2013年3月27日 申请日期2011年9月13日 优先权日2011年9月13日
发明者许嘉森, 吴诗扬 申请人:广州益善生物技术有限公司