专利名称：检测水产品中四种常见致病菌的试剂盒及检测方法
技术领域：
本发明涉及一种可同时快速检测水产品中沙门氏菌(Salmonella spp.)、志贺氏菌(Shigella spp.)、金黄色葡萄球菌(Vibrio, parahaemolyticus)和副溶血性弧菌 (Staphylococcus aureus)的多重PCR试剂盒和改良型检测方法，属于生物技术领域。
背景技术：
近几年我国水产品消费量不断上升，而水产品在养殖、捕捞、储藏、加工、运输、销售等环节容易受到病原微生物的污染，因此病原微生物检测是水产品及其加工品卫生检测中的一项重要工作，其关系到消费者的健康及生命安全。其中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、 副溶血性弧菌和金黄色葡萄球菌被认为是重要的污染水产品的致病菌，已引起各个国家卫生检测部门的广泛重视。我国标准DB11/519-2008《生食水产品卫生要求》规定沙门氏菌、 大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、志贺氏菌等不得检出。严格的食品微生物检验是保障食品安全的重要环节。然而，传统检测方法检测时间长，一般检测周期在5-10天，检测程序繁琐，工作量大，很难适应现代化食品安全快速检测的需要，因此亟需建立一种操作简便、快速准确、灵敏度和特异性都较高的现代化检测方法。分子生物学检测技术的发展为病原微生物快速检测提供了良好的技术平台，如基因探针、NASBA(核酸序列依赖性扩增法)、ATP生物发光法以及PCR等技术已逐渐被研究并完善以用于病原微生物的检测当中。其中多重PCROmiltiplex-PCR)技术不同于传统PCR 技术只能检测单一靶基因，其是通过在同一 PCR反应体系里加入多对特征引物，同时扩增出多个目标核酸片段的PCR反应，可用于多种病原微生物的同时快速检测或鉴定。Germini 等根据沙门氏菌的irwA基因，单核细胞增生李斯特菌的prfA基因，大肠杆菌0157:H7的 eaeA基因以及细菌的16S rRNA基因设计引物，应用多重PCR技术对全蛋液进行测定，特异性地检出上述菌种，灵敏度高，检测效果稳定。国内陈伟等对肉品中的沙门氏菌、志贺氏菌及大肠杆菌0157:H7三种致病菌建立了多重PCR检测体系，检测灵敏度可达lCFU/ml，可在 24h内完成检测工作，并集成了快速检测试剂盒。然而，目前对水产品中常见的四种致病菌沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌和副溶血性弧菌的同时共增菌方法及多重PCR快速检测试剂盒未有报道和公开。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于同时检测水产品中沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌和副溶血性弧菌四种常见致病菌的多重PCR快速检测试剂盒和检测方法，可以有效的节约检测时间，提高检测效率。检测水产品中四种常见致病菌的试剂盒，包括Mg2+、dNTP、Taq酶、PCR Buffer、引物、灭菌双蒸水，其特征在于，所述引物由以下序列组成沙门氏菌引物上游序列5，-GGT CGT CGT TGG GAC TGA TTG G-3，，下游序列 5， -CCG TGG CAT GTC TGA GCA CTT C-3'；
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志贺氏菌引物上游序列5，-GCT CGA AAC GGG CTG TGC TAA TG-3，，下游序列 5， -ACG GTA TCG GAA AGG CGG TCAA-3'；金黄色葡萄球菌引物上游序列5’-AAC GGC AAT ACG CAA AGA GG-3’、下游序列 5' -TAT ACG CTA AGC CAC GTC CAT A-3'；副溶血性弧菌引物上游序列5，-CTGATA ACA ATG ACG CCT CTG CTA AT-3，，下游序歹丨J :5，-TCT GAT ACT CAC CAA TCT GAC GGA ACT-3，。本发明根据金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因nuc、沙门氏菌的侵袭蛋白基因 invA、志贺氏菌的侵染性质粒抗原H基因ipaH、副溶血性弧菌的毒力表达调控基因toxR作为特征靶基因设计出4对特异性引物(见表1)各引物针对相应致病菌高度种内保守，种间特异基因或者毒力相关基因设计。扩增后片段长度大小各异，可通过电泳进行分开辨别。表1四种目标菌的引物序列和扩增PCR产物大小
权利要求
1.检测水产品中四种常见致病菌的试剂盒，包括Mg2+、dNTP、Taq酶、PCRBuffer、引物、 灭菌双蒸水，其特征在于，所述引物由以下序列组成沙门氏菌引物上游序列5’ -GGTCGTCGT TGGGACTGATTGG-3’，下游序列 5， -CCGTGGCATGTCTGAGCACTTC-3’ ；志贺氏菌引物上游序列5’ -GCTCGAAACGGGCTGTGCTAATG-3’，下游序列 5， -ACGGTATCGGAAAGGCGGTCA A-3’ ；金黄色葡萄球菌引物上游序列5’ -AACGGCAATACGCAA AGAGG-3’、下游序列 5’ -TATACGCTAAGCCACGTCCATA-3’ ；副溶血性弧菌引物上游序列5，-CTGATAACAATGACGCCTCTGCTA AT-3，，下游序列5，_TC TGATACTCACCAATCTGACGGAACT-3’。
2.检测水产品中四种常见致病菌的方法，其特征在于包括以下步骤a)样品增菌培养配制选择性增菌培养液，各组分的浓度为缓冲蛋白胨水20g/L、 鱼蛋白胨12 g/L、胆盐3号3 g/L、柠檬酸钠1.5 g/L、氯化锂1 g/L、亚碲酸钾1. 2 mg/L、氯化钠15 g/L、葡萄糖2 g/L、甘露醇1 g/L、丙酮酸钠4 g/L，调节pH值为7. 8 ；取水产品样品加入选择性增菌培养液中，均质1分钟，于恒温振荡器中37 150 rpm培养6 h；b)提取菌液DNA;c)PCR扩增使用权利要求1所述的试剂盒对菌液DNA进行扩增，扩增反应条件如下 采用冷启动，94°C预变性4 min，变性94°C 30 s，退火58. 1°C 1 min，延伸72°C 1 min，30 个循环，终延伸72 °C 5 min ；d)将扩增产物于琼脂糖凝胶电泳进行检测。
全文摘要
本发明公开了一种检测水产品中四种常见致病菌的试剂盒，包括Mg2+、dNTP、Taq酶、PCRBuffer、引物、灭菌双蒸水。本发明还提供了检测水产品中四种常见致病菌的方法，包括样品增菌培养、提取菌液DNA、PCR扩增、将扩增产物于2%琼脂糖凝胶电泳进行检测等步骤。该方法在常规多重PCR检测技术上，对该检测方法从前增菌到PCR扩增等步骤进行了改良和优化，整合后的多重PCR快速检测试剂盒配置便捷，易于产业化生产，检测结果特异性强，灵敏度高。
文档编号C12Q1/14GK102337333SQ20111027781
公开日2012年2月1日 申请日期2011年9月19日 优先权日2011年9月19日
发明者励建荣, 朱军莉, 翁思聪 申请人:浙江工商大学