专利名称：利用脂肪酸生物合成途径的脂肪酸含量改善用异种大肠杆菌及制备方法
技术领域：
本发明涉及一种脂肪酸生物合成途径的过量表达用转基因大肠杆菌的制备方法及利用上述制备方法制造的转基因大肠杆菌。
背景技术：
使用化石燃料时大量排放地球暖化气体及废弃物，从而给人类带来了严重的环境危机。因此，迫切需要开发能够替代基于化石燃料的化学工业，亦即，以尽量减少有害于人类的废弃物的生产及能源消耗的生物物质作为原料的新环保生物工艺。生物乙醇、生物柴油、生物气(biogas)、丁醇作为生物能(Bioenergy)而受到人们重视，上述的生物能虽然都能作为发电或运输用燃料使用，但因为它们在实际应用与生产方法上的若干缺点而使得作为新再生能源的烃(hydrocarbon)形态的化合物日益受到关注。因此，能够以代谢产物的 方式生成长链脂肪酸(long chain fatty acid)的重组菌株也日益受到人们关注。铜绿假单抱菌(Pseudomonas aeruginosa)是绿胺杆菌，1882年由Gessard在绿色的脓汁发现，由于形成绿色而被称为绿脓杆菌。绿脓杆菌广泛存在于自然界，可以从脓、咳痰、粪便、尿、胆汁、子宫分泌物、血、脊髓液等分离。铜绿假单孢菌绿脓杆菌的形态为革兰阴性杆菌，培养时形成类似于荚膜的细胞外多糖粘质层。形成类似于荚膜的细胞外多糖粘质层。它是一种对自然界具有强大适应能力的微生物。该菌生长所需营养条件非常单纯。化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)能够引起肺炎、咽喉炎、急性肾炎、毒性休克症候群之类的疾病。脂肪酸(fatty acid)是具有I个羧基(-C00H)的烃链的羧酸，表示链状I价羧酸(Carboxylic acid)。由于水解脂肪时生成而使用该名称。脂肪酸分子由烃链(hydrocarbonchain)构成，烃在碳的基本架构上以侧链链接氢并且在一端附着羧基。在生体内部，脂肪酸可由脂肪酸循环(fatty acid cycle)分解或合成。该循环以2个碳为单位合成或分解脂肪酸，因此存在于自然界的脂肪酸几乎大部分以双数碳数形成。微生物生体内起自糖的脂肪酸生物合成的第一个步骤从乙酰辅酶A(acetyl-CoA)开始，之后以两个碳原子为单位连接到烃链而拉长链。在细胞质中由乙酰辅酶A羧化而生成作为脂肪酸生物合成中重要中间物的丙二酰-辅酶A(malonyl-CoA)。该反应由乙酰辅酶A羧酶(carboxylase)复合体催化,该复合体由三个酶构成,为了酶活性,不仅需要ATP,还需要Mn2+与蛋白生物素(Biotin)。丙二酰-辅酶A的丙二酰基(Group)里的三个碳原子中两个在生物合成反应的每个步骤添加到脂肪酸链。与丙二酰-辅酶A的形成相同地，该反应需要位于细胞质且没有与膜结合的多酶复合体。由个别酶构成的该复合体指的是脂肪酸合成酶。作为该脂肪酸合成酶复合体的一部分，酰基载体蛋白质(acyl carrier protein ACP)参与到增加脂肪酸(fatty acid)碳数的结合。
权利要求
1.一种脂肪酸过量表达用大肠杆菌，由表达载体转基因，该表达载体包括选自下列组的至少一个核苷酸序列 (a)编码铜绿假单孢菌的乙酰辅酶A羧酶羧基转移酶阿尔法亚基的核苷酸序列、 (b)编码铜绿假单孢菌的丙二酰-辅酶A-[酰基载体蛋白质]转酰酶的核苷酸序列、及 (c)编码化脓性链球菌的酰基-酰基载体蛋白质硫酯酶的核苷酸序列。
2.根据权利要求I所述的脂肪酸过量表达用大肠杆菌，其特征在于， 上述脂肪酸过量表达用大肠杆菌由包括下列核苷酸序列的表达载体共转化而成(a)编码铜绿假单孢菌的乙酰辅酶A羧酶羧基转移酶阿尔法亚基的核苷酸序列、及(b)编码铜绿假单孢菌的丙二酰-辅酶A-[酰基载体蛋白质]转酰酶的核苷酸序列。
3.根据权利要求I所述的脂肪酸过量表达用大肠杆菌，其特征在于， 上述脂肪酸过量表达用大肠杆菌由包括编码化脓性链球菌的酰基-酰基载体蛋白质硫酯酶的核苷酸序列的表达载体共转化而成。
4.根据权利要求I所述的脂肪酸过量表达用大肠杆菌，其特征在于， 上述脂肪酸过量表达用大肠杆菌由包括下列核苷酸序列的表达载体共转化而成(a)编码铜绿假单孢菌的乙酰辅酶A羧酶羧基转移酶阿尔法亚基的核苷酸序列、(b)编码铜绿假单孢菌的丙二酰-辅酶A-[酰基载体蛋白质]转酰酶的核苷酸序列、及(c)编码化脓性链球菌的酰基-酰基载体蛋白质硫酯酶的核苷酸序列。
5.根据权利要求I所述的脂肪酸过量表达用大肠杆菌，其特征在于， 上述表达载体是具有图2所示基因地图的大肠杆菌-绿脓杆菌穿梭载体PUCP19，上述核苷酸序列插入PUCP19的MCS。
6.根据权利要求I所述的脂肪酸过量表达用大肠杆菌，其特征在于， 上述乙酰辅酶A羧酶羧基转移酶阿尔法亚基由记载为编码1的氨基酸序列构成，上述丙二酰-辅酶A-[酰基载体蛋白质]转酰酶由记载为编码3的氨基酸序列构成，上述酰基-酰基载体蛋白质硫酯酶由记载为编码5的氨基酸序列构成。
7.根据权利要求6所述的脂肪酸过量表达用大肠杆菌，其特征在于， 编码上述乙酰辅酶A羧酶羧基转移酶阿尔法亚基的核苷酸序列由记载为编码2的盐基顺序构成，编码上述丙二酰-辅酶A-[酰基载体蛋白质]转酰酶的核苷酸序列由记载为编码4的盐基顺序构成，编码上述酰基-酰基载体蛋白质硫酯酶的核苷酸序列由记载为编码6的盐基顺序构成。
8.一种脂肪酸过量表达用转基因大肠杆菌的制备方法，包括下列步骤(a)到步骤(b) (a)把选自下列i)到iii)所构成的组中一个以上的核苷酸序列插入表达载体的步骤；及 i)编码铜绿假单孢菌的乙酰辅酶A羧酶羧基转移酶阿尔法亚基的核苷酸序列， )编码铜绿假单孢菌的丙二酰-辅酶A-[酰基载体蛋白质]转酰酶的核苷酸序列，及 iii)编码化脓性链球菌的酰基-酰基载体蛋白质硫酯酶的核苷酸序列， (b)利用插入了上述核苷酸序列的表达载体让大肠杆菌转基因的步骤。
9.根据权利要求8所述的脂肪酸过量表达用转基因大肠杆菌的制备方法，其特征在于，表达上述大肠杆菌的步骤(b)由电击方法实行。
10.一种脂肪酸生物合成方法，包括下列步骤 (a)培养权利要求I到权利要求7的任一项所述的大肠杆菌并生物合成脂肪酸的步骤；及 (b)收取上述步骤(a)的生物合成的脂肪酸的步骤。
11.权利要求I到权利要求7的任一项所述的大肠杆菌应用于脂肪酸生物合成的用途。
全文摘要
本发明涉及一种把参与脂肪酸生物合成途径的酶予以加密的基因进行转基因的脂肪酸过量表达用大肠杆菌及其制备方法。本发明的脂肪酸过量表达用大肠杆菌不仅遗传稳定性优异，还因为基础物质通过两种途径被诱导向脂肪酸循环而大幅提高了脂肪酸过量表达效果。
文档编号C12N15/70GK102939374SQ201180020272
公开日2013年2月20日 申请日期2011年3月8日 优先权日2010年4月22日
发明者李辰远, 李善熙, 全恩英 申请人:西江大学校产学协力团